吳 浩，周 磊，袁莉霞，孫崇魯

（浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校，浙江 寧波315100）

三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum）又稱金錢吊葫蘆，是葡萄科崖爬藤屬珍稀藥用植物，全株可入藥，以塊根效果最佳。主要分布于浙江、福建等省，可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝炎及病毒性腦膜炎等多種疾病［1］。由于臨床應(yīng)用量的激增，野生蘊(yùn)藏量急劇下降，近年來栽培［2，3］、組培［4］等方面的研究集中。由于三葉崖爬藤與爬藤屬其他植物外形頗為相似［5］，因此在三葉崖爬藤種質(zhì)資源收集過程中會(huì)遇到一定的困難。

近年來分子鑒定技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物物種的鑒定，其中DNA條形碼序列分析已逐漸被應(yīng)用于多基原鑒定、產(chǎn)地鑒別等方面。用于鑒定的DNA條形碼有ITS、matK和psbA-trnH等，譚新寧等［6］利用ITS序列成功鑒定了青葙子（Celios cristata）及其6種同屬的混偽品；Zhou等［7］利用ITS序列成功鑒定25種雪藤屬草藥，并建立了該類草藥的分子標(biāo)記系統(tǒng)；Zahra等［8］對(duì)32種唇形科植物利用rbcL、matK以及psbA-trnh進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)matK和psbA-trnh兩種序列對(duì)種間的鑒定成功率高于rbcL，為40%；鄭輝等［9］研究峨眉山區(qū)唇形科藥用植物發(fā)現(xiàn)，以ITS2和matK序列鑒定唇形科藥用植物是最快速、準(zhǔn)確的鑒定和識(shí)別方法，能準(zhǔn)確地闡明物種之間的親緣關(guān)系。

matK是位于葉綠體等基因組中tmK基因的內(nèi)含子部分［10］，用于編碼的matK基因分子量小，拷貝數(shù)多，結(jié)構(gòu)簡單，不僅含有較高的基因同源性，而且還存在大量的變異位點(diǎn)，可用于物種間親緣關(guān)系研究及進(jìn)化樹構(gòu)建，是鑒定同屬不同植物品種的優(yōu)良候選基因［11-13］，因此在各類藥材鑒定中具有較好的應(yīng)用前景。本研究從生物信息學(xué)的角度對(duì)三葉崖爬藤的matK基因進(jìn)行分析，為三葉崖爬藤資源開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持，為瀕危藥用植物三葉崖爬藤的分子鑒定及保護(hù)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

除三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum）通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得外，其他13種matK基因序列均從NCBI網(wǎng)站上下載得到，用于研究系統(tǒng)進(jìn)化樹，所下載其他崖爬藤屬植物的matK基因序列Genbank號(hào)如表1所示。

表1 物種名及Genbank號(hào)

1.2 數(shù)據(jù)分析

利用NCBI ORFfinder對(duì)三葉崖爬藤matK基因進(jìn)行分析，搜索開放閱讀框；采用ProtParam工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析三葉崖爬藤matK蛋白的氨基酸種類及相對(duì)分子質(zhì)量等理化性質(zhì)；利 用Protscale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl？1）進(jìn)行matK親/疏水性的預(yù)測；利用在線軟件SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）預(yù) 測matK的 信 號(hào) 肽；運(yùn) 用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）完成跨膜結(jié)構(gòu)域的分析；利用軟件Tar?getP 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/index.php）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；利用在線工具JPred 4（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/）預(yù)測二級(jí) 結(jié)構(gòu)，再利用SWISS-MODEL（http：//www.swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行同源建模，預(yù)測三維結(jié)構(gòu)；最后運(yùn)用MEGA7對(duì)三葉崖爬藤等14種matK基因序列完成進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 開放閱讀框預(yù)測

三葉崖爬藤matK基因的開放閱讀框分析見圖1。三葉崖爬藤matK基因序列長度為969 bp，利用ORFFinder對(duì)其進(jìn)行開放閱讀框分析，共獲得6個(gè)開放閱讀框（ORF1～ORF6），其中ORF1的長度最大，為969 bp，起始密碼子位于171 bp，終止密碼子位于969 bp，共編碼266個(gè)氨基酸。

2.2 氨基酸組成分析

ProtParam分析表明，三葉崖爬藤matK的分子式為C1508H2222N378O371S7，相對(duì)分子質(zhì)量為4 486，共含有20種氨基酸（圖2），其中亮氨酸的比例最高，占所有氨基酸的12.40%，其后依次為苯丙氨酸（10.50%）、絲氨酸（10.20%）、異亮氨酸（7.50%）、賴氨酸（6.40%）、天冬酰胺（6.00%）、絡(luò)氨酸（6.00%）、組 氨 酸（5.60%）、纈 氨 酸（4.90%）、谷 氨 酰 胺（4.90%）、精氨酸（3.80%）、甘氨酸（3.80%）、脯氨酸（3.80%）、丙氨酸（3.00%）、谷氨酸（3.00%）、天冬氨酸（2.60%）、色氨酸（2.30%）、甲硫氨酸（1.90%）、半胱氨酸（0.80%）、蘇氨酸（0.80%）。不穩(wěn)定系數(shù)為49.32，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

圖1 三葉崖爬藤matK基因的開放閱讀框分析

圖2 三葉崖爬藤matK的氨基酸組成

2.3 親/疏水性分析

三葉崖爬藤matK中存在一些極性氨基酸，對(duì)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)形成有一定的影響，利用Protscale對(duì)三葉崖爬藤matK的氨基酸序列進(jìn)行親/疏水性分析（圖3），預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)總平均疏水指數(shù)（GRAVY）為-0.020，說明此蛋白為親水性蛋白質(zhì)，最高分值為2.40，最低分值在-2.05。

圖3 三葉崖爬藤matK氨基酸的親/疏水性

2.4 信號(hào)肽預(yù)測分析

利用在線軟件SignalP4.1對(duì)三葉崖爬藤matK的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測分析（圖4）。結(jié)果表明，三葉崖爬藤matK最大S值為0.899，出現(xiàn)在第12位氨基酸上；最大Y值為0.134，出現(xiàn)在第20位氨基酸上；最大C值為0.081，出現(xiàn)在第28位氨基酸上。S平均值大于0.5，表明該蛋白為分泌蛋白，存在信號(hào)肽，屬于信號(hào)肽的概率高達(dá)99.8%，信號(hào)肽剪切位點(diǎn)預(yù)測處于64～65位氨基酸。

圖4 三葉崖爬藤matK的信號(hào)肽預(yù)測

2.5 跨膜區(qū)預(yù)測

利用軟件TMHMM Server v.2.0對(duì)三葉崖爬藤matK蛋白進(jìn)行跨膜預(yù)測分析（圖5）。結(jié)果表明，該蛋白膜外的比例為100%，而在膜內(nèi)的比例為0，說明該蛋白不存在跨膜區(qū)，不具備介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的信號(hào)傳遞功能。

圖5 三葉崖爬藤matK的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.6 亞細(xì)胞定位預(yù)測

通過軟件TargetP 2.0對(duì)三葉崖爬藤matK蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測（圖6）。結(jié)果表明，線粒體導(dǎo)肽的可能性為0，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的可能性為0.014 3，類囊體管腔轉(zhuǎn)移肽的可能性為0，因此三葉崖爬藤matK蛋白只存在于葉綠體中。

2.7 蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線工具JPred 4分析三葉崖爬藤matK氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖7所示。再利用SWISS-MODEL對(duì)三葉崖爬藤matK蛋白進(jìn)行同源建模，獲得該蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，如圖8所示。

2.8 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

圖6 三葉崖爬藤matK的亞細(xì)胞定位預(yù)測

圖7 三葉崖爬藤matK的二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖8 三葉崖爬藤matK的三維結(jié)構(gòu)

通過NCBI收集13種爬藤屬植物的matK基因，并與測序獲得的三葉崖爬藤一起通過MEGA7構(gòu)建進(jìn)化樹（圖9）。結(jié)果顯示，單葉紅枝崖爬藤、紅枝崖爬藤、尾葉崖爬藤、草崖藤、毛枝崖爬藤與三葉崖爬藤的親緣性較高；顯孔崖爬藤、廣西崖爬藤、莖花崖爬藤、過山崖爬藤、厚葉崖爬藤、景洪崖爬藤、十字崖爬藤與三葉崖爬藤的親緣性略遠(yuǎn)；其中崖爬藤的親緣性最遠(yuǎn)。

圖9 三葉崖爬藤matK基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

目前matK蛋白大多處于功能及表達(dá)方面的研［14，15］，本研究所編碼的三葉崖爬藤matK蛋白質(zhì)預(yù)測位于細(xì)胞器葉綠體中，所含的氨基酸包括20種，基因解析中發(fā)現(xiàn)翻譯的蛋白含有相對(duì)較多的極性氨基酸，該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為49.32，表明為不穩(wěn)定的親水蛋白質(zhì)，含有信號(hào)肽，不含跨膜區(qū)。此研究為三葉崖爬藤matK蛋白的提取研究提供了一定的基礎(chǔ)。

matK基因序列結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，在同屬類植物中同源性較高，較rbcl進(jìn)化速率慢［16］，快于ITS［17］，可應(yīng)用于下一級(jí)（種）的分類。近年來，matK被應(yīng)用于多種植物的親緣性研究，陳芙蓉等［18］通過matK、trnL等序列的分析，建立一種能快速鑒別野菊以及藥用菊的有效方法；黃瓊林等［19］通過構(gòu)建matK基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，直觀有效地將高良姜和混偽品區(qū)分開來；戚華沙等［20］通過trnH-psbA、matK序列對(duì)不同來源的34份油茶種子完成了鑒別，發(fā)現(xiàn)trnH-psbA+matK序列可有效鑒別普通油茶、越南油茶以及其他供試油茶物種；劉利平等［21］利用DNA條形碼的4個(gè)序列（matK、rabL、psbK-psbI、atpF-atpH）對(duì)天南星及其易混品進(jìn)行鑒定，建立了適用于該物種的DNA條形碼有效鑒別方法。本研究測序獲得三葉崖爬藤matK基因序列，通過NCBI網(wǎng)站，Blast對(duì)比獲得13條同屬植物matK序列為969 bp，擁有6個(gè)開放閱讀框；通過構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)毛枝崖爬藤與三葉崖爬藤的親緣性最高，崖爬藤與三葉崖爬藤的親緣性最遠(yuǎn)，且三葉崖爬藤能有效地與其他爬藤屬物種區(qū)分開來。本研究為后續(xù)深入研究三葉崖爬藤matK基因，并有效利用該基因進(jìn)行爬藤屬或下一級(jí)分類研究奠定了基礎(chǔ)。