陳紫婷，唐詩淼，談江瑩，吳 茜

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，武漢430068）

多酚是存在于植物中以苯酚為骨架，具有多羥基取代的一類天然植物次生代謝產(chǎn)物。目前多酚已被報(bào)道的生理功能有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等［1，2］。多糖是指多羥基醛、酮以及它們的縮聚物與衍生物。多糖在抗腫瘤、降血糖、抗衰老等方面都發(fā)揮著重要作用。研究表明，黃連多糖可能通過保護(hù)胰島細(xì)胞以及促進(jìn)胰島素分泌達(dá)到降糖的目的［3］；黃連多糖可以抑制蛋白質(zhì)非酶糖化終產(chǎn)物的生成從而阻礙糖尿病并發(fā)癥產(chǎn)生［4］；靈芝多糖可以顯著降低血糖及血漿胰島素的水平［5］。有研究表明提升面包多糖含量能明顯促進(jìn)人體對黃酮的吸收［6］；用多糖包埋白藜蘆醇其水溶性和穩(wěn)定性明顯提高［7］；多糖和兒茶素混合后具有協(xié)同抗氧化的效果［8］。

兒茶素是茶多酚的主要成分，具有顯著的抗氧化、抗菌、抗病毒作用，能降低脂肪與膽固醇，降低心腦血管疾病的發(fā)病率［9］。殼寡糖也叫低聚殼聚糖，是殼聚糖經(jīng)過特殊生物酶解技術(shù)得到的寡糖產(chǎn)品，具有抗菌、抗氧化、抗?jié)冏饔茫?0-12］。聚合度為2～20，相對分子質(zhì)量在3 200 Da以下。相對于殼聚糖而言，殼寡糖具有較高的溶解度，更容易被生物體利用，而作用能達(dá)到殼聚糖的10倍以上。

近十年來，人們嘗試用各種化學(xué)法和酶法將酚類化合物結(jié)合到多糖上，而相對于改性之前的多酚與多糖，合成的多酚-多糖復(fù)合物展現(xiàn)出更優(yōu)越的物理化學(xué)特性及生物活性。另外，這些復(fù)合物在食品、制藥和化工領(lǐng)域都有著廣泛應(yīng)用。然而復(fù)合物的制備及純化過程較為復(fù)雜，且在此過程中，多酚與多糖也可能會發(fā)生一些未知的變化［13］。另外，目前很少研究簡單水溶液體系中多酚與多糖的相互作用及其與生物活性的關(guān)系。

本研究的目的在于探究兒茶素和殼寡糖復(fù)配物對大腸埃希氏菌的抗菌活性，解析兒茶素與殼寡糖的相互作用特征及抑菌機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）BNCC 185254購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，采用營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。供試菌經(jīng)活化后，接入營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，于37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，備用。

兒茶素，上海克林生化科技有限公司；殼寡糖（相對分子質(zhì)量小于3 000），山東優(yōu)索化工科技有限公司，其他試劑均為分析純。

營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，牛肉浸出物3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，去離子水1.0 L。

1.2 儀器與設(shè)備

HCB-1300V海爾垂直層流潔凈工作臺，青島海爾特種電器有限公司；ZXSR-1270真彩觸摸屏生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；ZWYRD2403多功能智能組合搖床，南京先璽儀器設(shè)備有限公司；MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器，上海五相儀器儀表有限公司；Tecan M200 PRO多功能酶標(biāo)儀，北京世貿(mào)遠(yuǎn)東科學(xué)儀器有限公司；UV-1601北分瑞利雙光束比例監(jiān)控紫外/可見分光光度計(jì)，西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，德國CHRIST公司；Nexus 470型傅立葉紅外光譜儀，美國Perkin Elmer公司；X-射線衍射儀，英國馬爾文儀器有限公司；納米粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 兒茶素與殼寡糖對大腸埃希氏菌的作用抑制率的測定參考了Tang等［14］的方法，并做了一些修改。將大腸埃希氏菌菌懸液按體積分?jǐn)?shù)1%接種于超高溫滅菌的營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，使初始菌落數(shù)在105～106cfu/mL。將兒茶素和殼寡糖分別溶解于營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，并以1∶1、1∶2、1∶4（兒茶素∶殼寡糖，W/W）比例復(fù)配。將復(fù)配溶液與菌液按照4∶1的體積比加入無菌96孔板，在37℃下培養(yǎng)12 h，測定0 h和12 h的OD600，從而得到抑制率。抑制率計(jì)算公式如下。

1.3.2 紫外-可見光譜分析將兒茶素與殼寡糖水溶液以1∶1、1∶2、1∶4（兒茶素∶殼寡糖，W/W）的比例復(fù)配。樣品于室溫下靜置20 min后，用紫外-可見分光光度計(jì)記錄200～800 nm的紫外-可見光譜變化。

1.3.3 紅外光譜分析將兒茶素與殼寡糖水溶液以1∶1、1∶2、1∶4（兒茶素∶殼寡糖，W/W）的比例復(fù)配。樣品室溫放置20 min后凍干用于紅外光譜分析。2 mg樣品和300 mg干KBr混合后研磨，將研磨好的粉末壓入片劑。用Nexus 470型傅立葉紅外光譜儀從4 000～400 cm-1測定不同樣品的紅外光譜。所有曲線用軟件做平滑處理。

1.3.4 X射線衍射分析在電流為50 mA，工作電壓為40 kV，掃描范圍2θ為5°～40°，掃描速度為4°/min，步長為0.02°的條件下，用X射線衍射儀檢測殼寡糖和復(fù)配物凍干粉（兒茶素和殼寡糖以1∶1、1∶2、1∶4的比例復(fù)配）的晶體結(jié)構(gòu)。

1.3.5 粒徑分析抗菌活性可能和粒徑相關(guān)［15］。將兒茶素與殼寡糖溶液以1∶1、1∶2、1∶4（兒茶素∶殼寡糖，W/W）的比例復(fù)配。室溫放置20 min后，用馬爾文納米粒度分析儀來檢測復(fù)配物的粒徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素與殼寡糖對大腸埃希氏菌生長的影響

如圖1所示，單獨(dú)的兒茶素在較低濃度（≤0.6 mg/mL）時(shí)，對大腸埃希氏菌BNCC 185254的生長有促進(jìn)作用，主要是由于兒茶素在低濃度時(shí)有促氧化作用，隨著兒茶素濃度升高，單獨(dú)兒茶素作用時(shí)，也展現(xiàn)出較好的抑菌效果。單獨(dú)的殼寡糖作用于大腸埃希氏菌時(shí)，抑菌效果較弱，而與兒茶素復(fù)配時(shí)，隨著殼寡糖濃度增高，抑菌效果逐漸增強(qiáng)。當(dāng)兒茶素與殼寡糖以1∶4的質(zhì)量比復(fù)配時(shí)，抑制率達(dá)到最大，約為90%。說明低濃度的兒茶素與高濃度殼寡糖發(fā)生了較強(qiáng)的作用，抗菌活性方面得到顯著提升。需要注意的是，不同比例復(fù)配可能會造成不同類型的相互作用，選取合適的比例有助于復(fù)配物發(fā)揮最佳抗菌能力。復(fù)配物中較高濃度的殼寡糖沒有促進(jìn)大腸埃希氏菌的生長，表明殼寡糖的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變，而兒茶素的結(jié)構(gòu)也可能同時(shí)發(fā)生了變化，從而導(dǎo)致抗菌活性改變。

圖1 殼寡糖、兒茶素及復(fù)配物對大腸埃希氏菌BNCC 185254生長的影響

2.2 紫外-可見光譜分析

從圖2可以看出，在紫外-可見光譜280 nm波長處，復(fù)配物和兒茶素呈現(xiàn)相似的峰型。將兒茶素與不同比例的殼寡糖復(fù)配后，復(fù)配物的吸光度逐漸增大，而且峰對應(yīng)的波長出現(xiàn)輕微紅移的現(xiàn)象。表明兒茶素的發(fā)色團(tuán)性質(zhì)發(fā)生了改變，隨著復(fù)配物中殼寡糖比例的增加，變化更為明顯。兒茶素與殼寡糖在相互作用之后，其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但是在此過程中未發(fā)生化學(xué)變化［16］。

圖2 殼寡糖、兒茶素與不同比例復(fù)配物的紫外-可見光譜

2.3 紅外光譜分析

如圖3所示，在紅外光譜的2 930、3 420 cm-1波數(shù)處能看到殼寡糖的C-H的特征吸收帶和O-H伸縮振動。羧甲基化后，1 380、1630 cm-1兩條帶的峰強(qiáng)度發(fā)生了顯著變化，這是羧基的對稱與不對稱伸縮振動所引起的［17］。復(fù)配后，O-H伸縮振動峰平移到約3 390 cm-1處，吸收波數(shù)隨著復(fù)配物中殼寡糖比例的增加而逐漸紅移。發(fā)生這個(gè)現(xiàn)象的原因可能是殼寡糖和兒茶素之間形成的氫鍵增加［18］，使得暴露的疏水基團(tuán)增多。同時(shí)C-H伸縮振動強(qiáng)度（2 930 cm-1）隨著復(fù)配物中殼寡糖比例的增加而逐漸減弱。復(fù)配物和殼寡糖的結(jié)構(gòu)與生物活性會因?yàn)檫@些變化受到影響。

圖3 殼寡糖、兒茶素與不同比例復(fù)配物的紅外光譜

2.4 X射線衍射分析

由圖4可以看出，隨著復(fù)配物中殼寡糖濃度的增大，2θ在12.9°、20.7°時(shí)出現(xiàn)的兩個(gè)特征衍射峰逐漸變?yōu)?2.4°、23.6°，并且峰強(qiáng)度逐漸增大。表明復(fù)配物通過重新整合形成了一種新的聚合物結(jié)構(gòu)，與此同時(shí)結(jié)晶度發(fā)生了改變。

圖4 殼寡糖、兒茶素與不同比例復(fù)配物的X射線衍射

2.5 粒徑分析

由圖5可知，隨著復(fù)配物中殼寡糖濃度增大，其粒徑逐漸減小。當(dāng)兒茶素與殼寡糖的質(zhì)量比為1∶4時(shí)，粒徑減小至（179.8±15）nm。復(fù)配物粒徑減小的原因可能是在復(fù)配后殼寡糖的構(gòu)象發(fā)生了改變，而且由于量子尺寸效應(yīng)，復(fù)配物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁有更高的親和力，或復(fù)配物能進(jìn)入細(xì)胞從而導(dǎo)致抗菌活性變強(qiáng)，這與Sarwar等［19］的結(jié)果一致。

圖5 殼寡糖與不同比例復(fù)配物的粒徑分析

3 結(jié)論

試驗(yàn)分析了兒茶素與殼寡糖復(fù)配對大腸埃希氏菌BNCC 185254生長的影響，并結(jié)合紫外-可見光譜、紅外光譜以及X射線衍射分析其相互作用以及可能的抑菌機(jī)理。結(jié)果表明，隨著殼寡糖濃度增加，兒茶素與殼寡糖之間的相互作用增強(qiáng)，并且抑菌能力提高，在兒茶素與殼寡糖質(zhì)量比為1∶4時(shí)，抑菌效果最佳。兒茶素和殼寡糖之間的相互作用導(dǎo)致二者結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但并沒有化學(xué)反應(yīng)發(fā)生。粒徑試驗(yàn)表明，兒茶素與殼寡糖復(fù)配物具有更小的粒徑，有利于增強(qiáng)抗菌活性，研究對多酚與多糖的相互作用在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思路。