王重娟 周錦妍 王崇靜 梁月琴 朱瑜丹 王星星 李仲昆

摘 要 目的：研究雙歧桿菌聯(lián)合左卡尼汀對(duì)菌群失調(diào)腹瀉模型大鼠腸道菌群的影響。方法：將30只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、益生菌組（雙歧桿菌三聯(lián)活菌腸溶膠囊70 mg/mL）、左卡尼汀組（左卡尼汀注射液50 mg/mL）和左卡尼汀+益生菌組（左卡尼汀注射液50 mg/mL+雙歧桿菌三聯(lián)活菌腸溶膠囊70 mg/mL）。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠均連續(xù)灌胃50 mg/mL克林霉素磷酸酯（2 mL/只，每天1次，連續(xù)4天）以建立菌群失調(diào)腹瀉模型。實(shí)驗(yàn)第5天起進(jìn)入恢復(fù)期，各給藥組大鼠開始灌胃相應(yīng)藥物，空白對(duì)照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水;灌胃體積均為1 mL/只，每天1次，連續(xù)給藥7天。實(shí)驗(yàn)期間觀察各組大鼠的一般情況;收集造模期結(jié)束時(shí)正常對(duì)照組和模型組大鼠的糞便以及恢復(fù)期末次給藥后各組大鼠的糞便，分別進(jìn)行腸道菌群基因組DNA提取與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序，并對(duì)處理后的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元聚類、物種注釋以及腸道菌群的Alpha和Beta多樣性分析。結(jié)果：造模期結(jié)束時(shí)，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠開始出現(xiàn)1級(jí)和2級(jí)糞便，腸道菌群的多樣性、豐富度以及腸道中厚壁菌門/擬桿菌門比值和乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和阿克曼氏菌屬等益生菌的豐度均顯著降低（P<0.05），而腸球菌屬等致病菌的豐度顯著升高（P<0.05）?；謴?fù)期結(jié)束時(shí)，與模型組比較，益生菌組、左卡尼汀組和左卡尼汀+益生菌組大鼠的活動(dòng)量和糞便的形態(tài)、顏色恢復(fù)至正常，腸道菌群的多樣性和豐富度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但其腸道中乳桿菌屬的豐度有一定提高，且左卡尼汀+益生菌組大鼠腸道中阿克曼氏菌屬的豐度顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：雙歧桿菌聯(lián)合左卡尼汀雖對(duì)提高菌群失調(diào)腹瀉模型大鼠腸道菌群的多樣性和豐富度無(wú)顯著效果，但能在一定程度上增加其腸道中益生菌的豐度。

關(guān)鍵詞 腸道菌群;益生菌;左卡尼汀;雙歧桿菌;高通量測(cè)序;多樣性

中圖分類號(hào) R963;R372 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）06-0682-09

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of Bifidobacterium combined with L-carnitine on intestinal flora of dysbacteriosis diarrhea model rats. METHODS： Totally 30 SD rats were randomly divided into blank control group， model group， probiotics group （Bifidobacterium triple viable enteric coated capsules 70 mg/mL）， L-carnitine group （L-carnitine injection 50 mg/mL） and L-carnitine+probiotics group （L-carnitine injection 50 mg/mL+Bifidobacterium triple viable enteric coated capsules 70 mg/mL）. Except for blank control group， the rats in other groups were given 50 mg/mL clindamycin phosphate intragastrically （2 mL/rat， once a day， for 4 consecutive days） to establish the model of dysbacteriosis diarrhea. On the 5th day of the experiment， the rats in administration groups were given corresponding drugs intragastrically， blank control group and model group were given equal volume of normal saline intragastrically; with the dosage volume of 1 mL/rat， once a day， for consecutive 7 days. The general situation of rats in each group was observed during the experiment. The feces of normal control group and model group at the end of the modeling and the feces of the rats in administration group after the last administration were collected for genomic DNA extraction， polymerase chain reaction amplification， library construction and high-throughput sequencing. After processing， the effective data were analyzed by operational taxonomic unitsclustering and species annotation， as well as Alpha and Beta diversity of intestinal flora. RESULTS： At the end of the modeling， compared with blank control group， grade 1 feces and grade 2 feces were found in model group. The diversity and richness of intestinal flora， the ratio of Firmicutes/Bacteroidetes and the abundance of probiotics such as Lactobacillus， Bifidobacterium and Ackermann were significantly decreased （P<0.05）， while the abundance of pathogenic bacteria such as Enterococcus was significantly increased （P<0.05）. At the end of the recovery period， compared with model group， the activity， fecal morphology and color of rats in probiotics group， L-carnitine group and L-carnitine+probiotics group returned to normal， and the diversity and richness of intestinal flora had no significant difference （P>0.05）. However， the abundance of Lactobacillus in intestinal tract was increased to a certain extent， and the abundance of Ackermann in intestinal tract of rats in L-carnitine+probiotics group was significantly increased （P<0.05）. CONCLUSIONS： Although Bifidobacterium combined with L-carnitine have no significant effect on improving the diversity and richness of intestinal flora in dysbacteriosis diarrhea model rats， it could increase the abundance of probiotics to a certain extent.

根據(jù)磁珠法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書方法提取糞便樣本中腸道菌群的基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度后，用無(wú)菌水稀釋DNA至1 ng/?L。以稀釋后的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。16S V4區(qū)引物序列為515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;806R：5′-GGACTACHVG- GGTWTCTAAT-3′。反應(yīng)體系含Phusion Master Mix（2×）15 ?L，上、下游引物（2 ?mol/L）各3 ?L，DNA模板（1 ng/?L）10 ?L，無(wú)菌水 2 ?L。擴(kuò)增條件為98 ℃預(yù)變性1 min;98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán);再以72 ℃延伸5 min結(jié)束反應(yīng)。使用2%瓊脂糖膠電泳（電壓80 V、電泳時(shí)間40 min）純化PCR產(chǎn)物。使用GeneJET膠回收試劑盒割膠回收主帶大小在400～450 bp之間的目標(biāo)條帶。上述DNA提取與PCR擴(kuò)增均由北京諾禾致源生物信息有限公司完成。

2.4 大鼠腸道菌群基因組文庫(kù)構(gòu)建與高通量測(cè)序

根據(jù)TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫(kù)試劑盒方法進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，將構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)。Qubit數(shù)值≥30者，使用測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序。上述文庫(kù)構(gòu)建與高通量測(cè)序均由北京諾禾致源生物信息有限公司完成。

2.5 大鼠腸道菌群基因組測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

2.5.1 原始數(shù)據(jù)處理 因測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)（Raw tags）中還存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，首先將Raw tags從堿基數(shù)達(dá)到3的第1個(gè)低質(zhì)量堿基位點(diǎn)截?cái)?，進(jìn)一步過(guò)濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長(zhǎng)度小于tags長(zhǎng)度75%的數(shù)據(jù)，再與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//github.com/torognes/vsearch/）進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)并去除嵌合體序列，從而得到最終的有效數(shù)據(jù)（Effective tags）。

2.5.2 可操作分類單元聚類和物種注釋 利用Uparse v7.0.1001軟件對(duì)所有樣本的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為可操作分類單元（OTUs），以O(shè)TUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為代表對(duì)OTUs進(jìn)行物種注釋[8]。根據(jù)物種注釋結(jié)果，分別統(tǒng)計(jì)在門、屬水平豐度排名前10的物種。

2.5.3 樣本DNA測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及腸道菌群的Alpha多樣性分析 使用R 2.15.3軟件繪制稀釋曲線、等級(jí)聚類曲線、物種累積箱形圖和分組OTUs韋恩圖，以評(píng)價(jià)測(cè)序的深度、物種豐富度、樣本量是否足夠以及各組OTUs組成情況。使用Qiime 1.9.1軟件進(jìn)行樣本的Alpha多樣性分析，計(jì)算香農(nóng)指數(shù)（Shannon指數(shù)）、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和樣品文庫(kù)覆蓋率（Goods coverage）。其中，Shannon指數(shù)反映樣品中微生物的多樣性，其值越大，說(shuō)明菌群多樣性越高;Chao1和ACE指數(shù)反映群落中OTUs的數(shù)目，是生態(tài)學(xué)中估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù)，其值越大，說(shuō)明菌群豐富度越高;Goods coverage反映測(cè)序結(jié)果是否可代表樣本中微生物的真實(shí)情況，其值越大（最大值為1），說(shuō)明樣本中序列被測(cè)出的概率越高[9]。

2.5.4 腸道菌群的Beta多樣性分析 用Qiime 1.9.1軟件計(jì)算Unifrac距離、構(gòu)建UPGMA（Unweighted pair- group method with arithmetic mean）樣本聚類樹，使用? ?R 2.15.3軟件繪制無(wú)度量多維標(biāo)定（Non-metric multi-dimensional scaling，NMDS）圖[10]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 造模情況

3.1.1 造模期大鼠的一般情況觀察結(jié)果 造模期內(nèi)，各組大鼠均較活潑、反應(yīng)敏捷，毛發(fā)光亮，飲食正常。但從實(shí)驗(yàn)第3天起，模型組大鼠開始出現(xiàn)1級(jí)成形、軟糞便和2級(jí)稀爛、不成形糞便，而空白對(duì)照組大鼠的糞便在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期內(nèi)均為0級(jí)硬糞便?？瞻讓?duì)照組和模型組大鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)值分別為（13.50±2.59）、（13.00±5.02） g，二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3.1.2 造模期糞便樣本DNA測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及腸道菌群的Alpha多樣性分析結(jié)果 稀釋曲線結(jié)果顯示，當(dāng)序列接近60 000時(shí)，再增加序列數(shù)量后很少產(chǎn)生新的OTUs，表明試驗(yàn)測(cè)序深度足夠[11]。等級(jí)聚類曲線結(jié)果顯示，從水平方向看，空白對(duì)照組在橫軸上物種等級(jí)的跨度顯著大于模型組，表明空白對(duì)照組大鼠腸道菌群的豐富度高于模型組。物種累積箱形圖結(jié)果顯示，當(dāng)樣本數(shù)量不斷增加至空白對(duì)照組和模型組樣本量之和時(shí)，很少有新的物種出現(xiàn)，表明樣本數(shù)量足夠[12]。通過(guò)空白對(duì)照組和模型組樣本聚類得到的分組OTUs韋恩圖看，兩組樣本（12份）有580個(gè)共有的OTUs，其中空白對(duì)照組有112個(gè)特征OTUs，而模型組只有63個(gè)特征OTUs，表明空白對(duì)照組大鼠腸道菌群的物種豐富度高于模型組。造模期DNA測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及腸道菌群的Alpha多樣性分析結(jié)果見圖1。

模型組大鼠Shannon指數(shù)顯著低于空白對(duì)照組（P<0.01），說(shuō)明空白對(duì)照組大鼠腸道菌群的多樣性顯著高于模型組。模型組大鼠Chao1、ACE指數(shù)雖低于空白對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）?？瞻讓?duì)照組和模型組大鼠的Goods coverage均為0.99，這進(jìn)一步表明兩個(gè)組的測(cè)序深度足夠，樣品中序列未被檢測(cè)到的可能性較低。造模期兩組大鼠腸道菌群的Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

3.1.3 造模期大鼠腸道菌群的Beta多樣性分析結(jié)果NMDS分析結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和模型組大鼠腸道中菌群分為2群，并分布在不同區(qū)域，表明兩組大鼠腸道菌群存在明顯差異。UPGMA樣本聚類分析結(jié)果顯示，兩組大鼠腸道中細(xì)菌組成的相似度聚類可分成2類，模型組除有1只大鼠與空白對(duì)照組歸為同類外，其余均為不同類，表明空白對(duì)照組大鼠的腸道菌群整體與模型組不同。造模期大鼠腸道菌群的Beta多樣性分析結(jié)果見圖2。

3.1.4 造模期大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成分析結(jié)果 在門水平上，空白對(duì)照組和模型組大鼠的優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門和擬桿菌門，但與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠腸道中厚壁菌門豐度顯著降低（P<0.05），擬桿菌門豐度顯著升高（P<0.05），厚壁菌門/擬桿菌門（F/B）比值分別為1.87和0.67。在屬水平上，空白對(duì)照組大鼠的優(yōu)勢(shì)菌屬為擬桿菌屬和乳桿菌屬，而模型組大鼠的優(yōu)勢(shì)菌屬為擬桿菌屬和Romboutsia。空白對(duì)照組大鼠腸道中乳桿菌屬、雙歧桿菌屬（因排序不在前10，限于篇幅結(jié)果未詳細(xì)展示）以及考拉桿菌屬、阿克曼氏菌屬的豐度均顯著高于模型組（P<0.05），而擬桿菌屬、腸球菌屬和糞芽孢菌屬（因排序不在前10，限于篇幅結(jié)果未詳細(xì)展示）的豐度均顯著低于模型組（P<0.05）。造模期兩組大鼠腸道菌群（豐度排名前10位）結(jié)構(gòu)組成分析結(jié)果見表2（表中數(shù)值為0.00±0.00的表示其對(duì)應(yīng)菌株的豐度<0.005）。

3.2 益生菌聯(lián)合左卡尼汀對(duì)模型大鼠腸道菌群的影響

3.2.1 恢復(fù)期大鼠的一般情況觀察結(jié)果 恢復(fù)期（實(shí)驗(yàn)第5～11天），空白對(duì)照組大鼠較活潑、反應(yīng)敏捷，毛發(fā)光亮，飲食正常，其糞便均為褐色、成形的0級(jí)糞便。模型組大鼠雖反應(yīng)尚可，但活動(dòng)量較空白對(duì)照組明顯減少，且持續(xù)出現(xiàn)不成形的1級(jí)和2級(jí)糞便，體質(zhì)量增長(zhǎng)較慢。益生菌組、左卡尼汀組和左卡尼汀+益生菌組大鼠的活動(dòng)量以及糞便的形態(tài)和顏色均逐漸恢復(fù)至正常，且體質(zhì)量增長(zhǎng)未見減慢。在實(shí)驗(yàn)第11天，空白對(duì)照組、模型組、益生菌組、左卡尼汀組和左卡尼汀+益生菌組大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)值分別為（40.17±13.57）、（35.67±8.82）、（47.17±22.23）、（41.50±20.11）、（41.83±8.84） g，其中益生菌組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)值顯著高于模型組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況見圖3。

3.2.2 恢復(fù)期樣本DNA測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及腸道菌群的Alpha多樣性分析結(jié)果 稀釋曲線結(jié)果顯示，當(dāng)序列接近60 000時(shí)，即使再增加序列也很少產(chǎn)生新的OTUs，表明試驗(yàn)測(cè)序深度足夠[11]。等級(jí)聚類曲線結(jié)果顯示，從水平方向看，各組在橫軸上物種等級(jí)的跨度大小為空白對(duì)照組>模型組>益生菌組>左卡尼汀+益生菌組>左卡尼汀組，說(shuō)明益生菌、左卡尼汀和左卡尼汀+益生菌組均不能提高大鼠腸道菌群的豐富度。物種累積箱形圖結(jié)果顯示，當(dāng)樣本量不斷增加至5組樣本量之和時(shí)，很少有新的物種出現(xiàn)，表明5組樣本量足夠[11]。通過(guò)各組聚類得到的分組OTUs韋恩圖看，5組樣本共有416個(gè)共有的OTUs，空白對(duì)照組、模型組、益生菌組、左卡尼汀組和左卡尼汀+益生菌組分別有33、21、33、19、8個(gè)特征OTUs，說(shuō)明益生菌能夠增加模型大鼠的特征OTUs?；謴?fù)期大鼠糞便樣本DNA測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及腸道菌群的Alpha多樣性分析結(jié)果見圖4。

從Goods coverage來(lái)看，各組大鼠的Goods coverage均達(dá)到了1.00，表明恢復(fù)期各組樣本的測(cè)序深度均足夠。從Shannon指數(shù)來(lái)看，各給藥組大鼠的Shannon指數(shù)雖均低于空白對(duì)照組，但只有左卡尼汀+益生菌組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明僅左卡尼汀+益生菌組大鼠腸道菌群多樣性較空白對(duì)照組顯著降低。同時(shí)，模型組和各藥物組大鼠Chao1、ACE指數(shù)均低于空白對(duì)照組（P<0.05或P<0.01），且益生菌、左卡尼汀和左卡尼汀+益生菌均未表現(xiàn)出提升模型大鼠Shannon、Chao1和ACE指數(shù)的趨勢(shì)（P>0.05）。以上結(jié)果表明，益生菌、左卡尼汀和左卡尼汀+益生菌給藥后均不能提高腹瀉模型大鼠腸道菌群的多樣性和豐富度。恢復(fù)期各組大鼠腸道菌群的Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

3.2.3 恢復(fù)期大鼠腸道菌群的Beta多樣性分析結(jié)果NMDS分析結(jié)果顯示，僅空白對(duì)照組大鼠的物種信息與其余各組無(wú)重疊部分，說(shuō)明空白對(duì)照組與其余各組大鼠的腸道菌群構(gòu)成差異較大;而模型組、益生菌組、左卡尼汀組、左卡尼汀+益生菌組大鼠之間腸道菌群構(gòu)成差異相對(duì)較小，說(shuō)明益生菌、左卡尼汀、左卡尼汀+益生菌均不能顯著改變模型大鼠的腸道菌群。UPGMA樣本聚類分析結(jié)果顯示，只有空白對(duì)照組各樣本在UPGMA聚類樹中的距離較為相近，被單獨(dú)聚為一類，而其余組各樣本間均存在重疊部分。上述結(jié)果說(shuō)明，除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠腸道菌群的構(gòu)成無(wú)明顯差異，這進(jìn)一步證實(shí)了“3.2.2”項(xiàng)下結(jié)論?；謴?fù)期各組大鼠腸道菌群的Beta多樣性分析結(jié)果見圖5。

3.2.4 恢復(fù)期大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成分析結(jié)果 在門水平上，空白對(duì)照組、模型組、益生菌組、左卡尼汀組和左卡尼汀+益生菌組大鼠的F/B比值分別為0.58、0.39、0.45、0.28、0.30;與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠腸道中厚壁菌門、無(wú)壁菌門的豐度均顯著降低（P<0.05），朊細(xì)菌門的豐度顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，益生菌組大鼠的F/B比值顯著升高、朊細(xì)菌門以及左卡尼汀組大鼠腸道中疣微菌門的豐度均顯著降低（P<0.05），左卡尼汀+益生菌組大鼠腸道中朊細(xì)菌門豐度顯著降低（P<0.05）。在屬水平上，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠腸道中擬桿菌屬的豐度顯著升高（P<0.05），阿克曼氏菌屬、乳桿菌屬的豐度均顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，左卡尼汀+益生菌組大鼠腸道中阿克曼氏菌屬的豐度顯著升高（P<0.05），且益生菌組、左卡尼汀組和左卡尼汀+益生菌組大鼠腸道中乳桿菌屬的豐度均有不同程度的提高。恢復(fù)期各組大鼠腸道菌群（豐度排名前10位）結(jié)構(gòu)組成分析結(jié)果見表4（表中數(shù)據(jù)為0.00±0.00的表示對(duì)應(yīng)菌株的豐度<0.005）。

4 討論

人體腸道內(nèi)龐大的菌群大致可以分為3類：一類是共生菌，主要是專性厭氧菌，包括乳桿菌、雙歧桿菌以及部分梭菌類和革蘭氏陽(yáng)性球菌（如糞鏈球菌、乳球菌）等，其參與了食物的消化過(guò)程并促進(jìn)腸道的蠕動(dòng)，同時(shí)具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑制致病菌生長(zhǎng)等功能;另一類是條件致病菌，如大腸埃希菌和腸球菌等，其在正常情況下對(duì)人體有益，但在某些因素（如長(zhǎng)期使用廣譜抗生素、腸道動(dòng)力異常）的作用下其大量繁殖后也會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害;還有一類是致病菌，如艱難梭菌、金黃色葡萄球菌等，這類細(xì)菌在正常人體腸道內(nèi)含量較少[7，12]。正常情況下，人體腸道內(nèi)的細(xì)菌相互拮抗、相互協(xié)同，在質(zhì)和量上形成一種動(dòng)態(tài)平衡，但長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)導(dǎo)致敏感菌的生長(zhǎng)被抑制，致病菌借機(jī)大量繁殖而導(dǎo)致腸道菌群的紊亂[13]。

目前許多研究采用抗生素建立腸道菌群失調(diào)動(dòng)物模型，如郭佳裕等[14]通過(guò)灌胃鹽酸林可霉素（120 mg/d，連續(xù)灌胃7天）成功建立了腸道菌群紊亂小鼠模型;再如李娜等[15]通過(guò)灌胃頭孢曲松鈉溶液（0.02 mL/g，頭孢曲松質(zhì)量濃度為0.6 g/mL，連續(xù)灌胃10天）成功建立了小鼠腸道菌群失調(diào)模型。但不同類型的抗生素、不同的給藥劑量和給藥時(shí)間都會(huì)影響造模效果。本研究通過(guò)灌胃克林霉素磷酸酯（50 mg/mL）的方法來(lái)建立了大鼠腸道菌群失調(diào)模型。張文娣[7]的研究結(jié)果顯示，50 mg/mL的克林霉素磷酸酯可導(dǎo)致大鼠腸道菌群失調(diào)，但停藥一段時(shí)間后可在一定程度上恢復(fù)，提示在該劑量下不會(huì)引起大鼠腸道菌難以逆轉(zhuǎn)的失調(diào)情況。本研究結(jié)果顯示，在造模期結(jié)束時(shí)，模型組大鼠腸道菌群的多樣性和豐富度顯著低于空白對(duì)照組，該結(jié)果與文獻(xiàn)[16]報(bào)道相一致;在菌群結(jié)構(gòu)方面，模型組大鼠腸道中F/B比值較空白對(duì)照組顯著下降（F/B比值是反應(yīng)腸道菌群紊亂的重要指標(biāo)[12]），同時(shí)乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、阿克曼氏菌屬等益生菌的豐度也顯著下降，而腸球菌屬等致病菌的豐度顯著升高，且UPGMA聚類分析也將空白對(duì)照組和模型組樣本聚為2類。以上研究結(jié)果均提示，本研究中腸道菌群紊亂大鼠模型復(fù)制成功。

益生菌是臨床上常用的治療新生兒腹瀉和母乳喂養(yǎng)不耐受的制劑，常用的益生菌包括雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、地衣芽孢桿菌等[17-18]。姜琳等[19]的研究顯示，合用雙歧桿菌乳酸菌片可有效預(yù)防小兒抗生素相關(guān)腹瀉;伍靜等[20]的研究表明，口服乳酸菌和雙歧桿菌能夠上調(diào)腸道菌群失衡模型小鼠腸道中乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量，調(diào)節(jié)和修復(fù)其腸道菌群的平衡狀態(tài)。但是由于益生菌為活菌制劑，其生物活性易受外部環(huán)境的影響，且其進(jìn)入人體或動(dòng)物消化道后，受到胃酸和膽鹽等的影響，最終能到達(dá)腸道并定植發(fā)揮作用的活菌數(shù)量極少，有時(shí)并不能發(fā)揮益生效果[5]。在本研究中，當(dāng)恢復(fù)期結(jié)束時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)灌胃益生菌后不能提高模型大鼠腸道菌群的豐富度和多樣性，但是能提高其F/B比值。相關(guān)研究顯示，抗生素可導(dǎo)致腹瀉模型小鼠腸道中F/B比值顯著下降，提示灌胃益生菌可改善菌群失調(diào)腹瀉模型大鼠的腸道菌群紊亂情況[21]。此外，乳桿菌屬是常見的益生菌，其能夠治療或輔助治療新生兒腹瀉及胃腸道等疾病[22]。在本研究中，益生菌組大鼠腸道中乳桿菌屬的豐度較模型組有一定升高?？梢姡辔敢嫔?，其可通過(guò)改變菌群結(jié)構(gòu)、增加腸道內(nèi)益生菌豐度來(lái)改善模型大鼠的腹瀉情況。

左卡尼汀又名左旋肉毒堿，是一種由氨基酸生物合成的季銨化合物，在能量代謝尤其是脂肪酸的分解代謝中起著重要作用;同時(shí)，其還具有抗氧化、維持體內(nèi)細(xì)胞膜穩(wěn)定以及促進(jìn)蛋白質(zhì)合成等活性[23]。此外，左卡尼汀是腸道菌群產(chǎn)生三甲胺的重要來(lái)源[24]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合使用益生菌和左卡尼汀雖不能提高菌群失調(diào)腹瀉模型大鼠腸道菌群的豐富度、多樣性以及F/B比值，但能夠在一定程度上提高其腸道中阿克曼氏菌屬和乳桿菌屬等益生菌的豐度。多項(xiàng)研究表明，阿克曼氏菌對(duì)腸道炎癥、肥胖、糖尿病等疾病具有改善作用，能夠降低炎癥因子水平、誘導(dǎo)腸道菌群重塑、在維持腸道穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，有望被開發(fā)為生物治療劑和下一代益生菌制劑[25-26]。

綜上所述，本研究通過(guò)采用克林霉素磷酸酯灌胃的方式成功建立了菌群失調(diào)腹瀉大鼠模型，初步證明了益生菌聯(lián)合左卡尼汀對(duì)模型大鼠腸道菌群的多樣性和豐富度無(wú)顯著恢復(fù)作用，但能在一定程度上提高其腸道益生菌的豐度。本研究為臨床聯(lián)合使用左卡尼汀和益生菌提供了一定的參考，但要確認(rèn)該作用及具體機(jī)制還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更深入的研究。

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（收稿日期：2020-09-30 修回日期：2020-12-31）

（編輯：林 靜）