葉曉鮮，李明洋，朱珊麗，崔懷瑞，王昱，張麗芳

溫州醫(yī)科大學仁濟學院基礎醫(yī)學部解剖教研室

分子病毒與免疫研究所，浙江溫州325035

2019 年12 月，部分地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)感染新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的肺炎患者，2003 年 2 月，我國廣東暴發(fā) SARS，2012 年 9 月，沙特暴發(fā) MERS，這 3 次疫情均由冠狀病毒（coronavirus，CoV）引發(fā)，患者均表現(xiàn)出嚴重的急性呼吸系統(tǒng)綜合征。SARS-CoV-2 迅速在全世界范圍內(nèi)傳播，截至目前，國內(nèi)確診病例超過10 萬例，國外確診病例超過1.3 億例，疫情十分嚴峻，嚴重危害了人類健康，目前尚無特效藥物進行防治［1］。

冠狀病毒為具有衣殼（螺旋形狀）和外套膜的線性單股正鏈 RNA 病毒，其基因大小為29 800 bp［2-3］，是已知RNA 病毒中最長的。冠狀病毒間存在4 種較為保守的結構蛋白，由基因組的3′端編碼，分別為S 蛋白（表面刺突蛋白）、E 蛋白（小包膜蛋白）、M蛋白（外膜蛋白）、N 蛋白（核衣殼蛋白［2，4］），主要參與病毒復制與感染過程。M 蛋白為一種跨膜糖蛋白，長222 個aa，在雙層脂包膜的外表面有N-親水性末端突出，可使宿主產(chǎn)生中和性抗體，其后面有3 個疏水的跨膜區(qū)，在第3 個跨膜區(qū)后面存在一段高度保守的氨基酸序列SmWSFNPE（SARS-CoV 中的也為SmWSFNPE）。C-末端親水區(qū)位于病毒粒子內(nèi)部，在病毒粒子出芽時進入病毒粒子核心，促進膜的彎曲變形，作用于病毒核殼體［5］。

本研究以SARS-CoV-2 M 蛋白的氨基酸序列為基礎，應用計算機網(wǎng)絡生物信息學軟件，對其結構及B 細胞表位進行預測，為該蛋白的功能研究及疫苗研發(fā)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 SARS-CoV-2 M 蛋白氨基酸序列獲得及理化性質(zhì)預測 通過NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫檢索獲得SARS-CoV-2 M 蛋白的氨基酸序列，應用ExPASy 在線軟件中的ProtParam 預測其理化性質(zhì)。

1.2 SARS-CoV-2 M 蛋白的二級結構及三級結構預測 應用ExPASy 在線軟件中的SOPMA 與GOR綜合預測M 蛋白的二級結構；應用ExPASy 在線軟件中的SWISS-MODEL 預測其三級結構。

1.3 SARS-CoV-2 M 蛋白的跨膜區(qū)域預測 應用ExPASy 在線軟件中的 TMHMM、Phobius 預測 M 蛋白的跨膜區(qū)域。

1.4 SARS-CoV-2 M 蛋白的親水性、表面可及性、抗原性、極性、柔韌性參數(shù)預測 應用ExPASy 在線軟件中的 PROSCALE 與 DNASTAR 預測 M 蛋白的 HOOPWOODS 親水性［6］、Janin 表面可及性、Jameson-Wolf抗原性、Zimmerman 極性［7］與柔韌性。

1.5 SARS-CoV-2 M 蛋白的B 細胞表位與其他冠狀病毒屬的同源性分析 應用吳玉章等［8］建立的抗原性指數(shù)（antigenic Index，AI）方法，并結合上述得到的多種參數(shù)綜合預測SARS-CoV-2 M 蛋白的B 細胞優(yōu)勢表位。應用Vector NTI 對SARS-CoV-2 M 蛋白與其他RNA 冠狀病毒的M 蛋白進行同源性比對。

2 結 果

2.1 SARS-CoV-2 M 蛋白氨基酸序列及理化性質(zhì) M 蛋白由222 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為25 150，初步推斷分子式為C1165H1823N303O301S8，等電點（theoretical pI）為9.51，不穩(wěn)定系數(shù)（instability index）為39.14，表明該蛋白為穩(wěn)定性蛋白，疏水性平均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）為 0.446，大于0，表明該蛋白親水性較差，為疏水性蛋白。氨基酸序列見圖1。

圖1 SARS-CoV-2 M 蛋白的氨基酸序列（QHD43419.1）Fig.1 Amino acid sequence（QHD43419.1）of SARS-CoV-2 M protein

2.2 SARS-CoV-2 M 蛋白的二級結構及三級結構GOR 預測結果顯示，SARS-CoV-2 M 蛋白的二級結構由 46.85% α-螺旋（alpha helix，Hh）、13.51% β-片層（extended strand，Ee）、39.64%無規(guī)卷曲（random coil，Cc）組成；SOPMA 預測結果顯示，其二級結構由34.68% α-螺旋、21.17% β-片層、37.39%無規(guī)卷曲組成。兩組參數(shù)進行綜合分析，M 蛋白主要以α 螺旋為主，主要序列為10-70、80-104。見圖2。SWISSMODEL 軟件預測SARS-CoV-2 M 蛋白的空間結構見圖3。

2.3 SARS-CoV-2 M 蛋白的跨膜區(qū)域 TMHMM、Phobius 在線軟件預測結果表明，SARS-CoV-2 M 蛋白為跨膜蛋白，見圖4。這兩種預測軟件結果較一致，進行綜合分析，膜外區(qū)域為1-19、74-77，跨膜區(qū)域為 20-39、52-73、79-100，膜內(nèi)區(qū)域為 41-50、104-222，其中跨膜區(qū)域的氨基酸序列結構基本以α-螺旋為主。

2.4 SARS-CoV-2 M 蛋白的親水性、表面可及性、抗原性、極性與柔韌性參數(shù) 應用ProtScale 在線軟件與DNASTAR 中的protean 綜合預測HOPP-WOODS親水性參數(shù)、Zimmerman 極性參數(shù)與柔韌性參數(shù)、E mini 表現(xiàn)可及參數(shù)、Jameson-Wolf 抗原性參數(shù)和線性表位預測，各種參數(shù)預測結果見圖5 和表1。

圖2 SARS-CoV-2 M 蛋白的二級結構Fig.2 Secondary structure of SARS-CoV-2 M protein

圖3 SARS-CoV-2 M 蛋白的三級結構Fig.3 Tertiary structure of SARS-CoV-2 M protein

圖4 SARS-CoV-2 M 蛋白的跨膜區(qū)域預測Fig.4 Prediction of transmembrane region of SARS-CoV-2 M protein

圖5 SARS-CoV-2 M 蛋白不同參數(shù)預測結果Fig.5 Prediction of various parameters of SARS-CoV-2 M protein

2.5 SARS-CoV-2 M 蛋白的B 細胞優(yōu)勢表位與其他冠狀病毒屬的同源性 預測結果表明，SARS-CoV-2 M 蛋白可能的B 細胞優(yōu)勢表位肽段為NGTITVEELK（5-14），位于膜外區(qū)域，平均AI 為0.177。同源性分析顯示，SARS-CoV-2 M 蛋白與SARS-CoV M 蛋白的同源性匹配高達90%，與Bat SARS-like-CoV M 蛋白的同源性匹配高達90%，與MERS-CoV M 蛋白的同源性匹配為40%，與HCoV-229E M 蛋白的同源性為27%，與IBV M 蛋白的同源性為28%，其他同源性匹配結果見表2，序列比對結果見圖6。

表1 不同方法預測SARS-CoV-2 M 蛋白B 細胞表位的肽段位置Tab.1 Prediction of peptide location of B cell epitope of SARS-CoV-2 M protein by various methods

表2 M 蛋白同源性分析（%）Tab.2 Homology of M protein（%）

圖6 M 蛋白多序列比對結果Fig.6 Comparison of various sequences of M protein

3 討 論

長期以來，冠狀病毒一直與人類和動物關系密切，2019 年前，已發(fā)現(xiàn)6 種冠狀病毒能引起人類感染，分別是：引起輕微自限性疾病的HCoV-229E［9］、HCoV-OC43［10］、HCoV-NL63［11］、HCoV-HKU1［12］以及引起人類嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征的SARS-CoV和 MERS-CoV［13］。SARS-CoV-2 是在 SARS-CoV 和MERS-CoV 后出現(xiàn)的第3 個同樣引起人類嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征的冠狀病毒，是唯一在全球廣泛傳播的非流感病毒。SARS-CoV-2 造成的死亡率低于SARS（9.6%）和 MERS（34.4%），但其在宿主體內(nèi)的病毒載量模式更接近于流感病毒［14］，傳染性更強，有長期潛伏在人體內(nèi)的風險，會出現(xiàn)一定數(shù)量的無癥狀或輕癥患者，增大了防控難度［15］。目前我國通過高效嚴謹?shù)姆揽?，短? 個月，疫情得到明顯控制，而國外90%以上的國家感染人數(shù)快速上升，已成為全球公共衛(wèi)生機構面臨的一個艱巨挑戰(zhàn)。面對新發(fā)傳染病，目前最有效方法是采取隔離措施，但只適用于短期，從可能會再次暴發(fā)或季節(jié)性流行的潛在風險來看，研發(fā)與儲備安全、有效的疫苗對于疫情防控具有重大意義［16］。

在廣泛的進化過程中，許多病毒從其宿主細胞中獲得了脂質(zhì)雙層，由此形成具有整合到膜包膜中的病毒結構蛋白的特殊保護性和功能性鑲嵌結構。病毒膜蛋白通常在結構和功能上類似于其宿主對應物［17］。M 蛋白是冠狀病毒的主要膜蛋白之一，是具有多種生物學功能的主要跨膜糖蛋白，同時也是病毒顆粒中最豐富的糖蛋白［18］。在研究其他冠狀病毒的情況下，發(fā)現(xiàn)M 蛋白與E、S 和N 蛋白在病毒形態(tài)中相互作用，并在病毒裝配中起重要作用［19-21］。N 蛋白與病毒RNA 結合形成核衣殼，M 與E 蛋白是病毒組裝過程中病毒樣顆粒的必要組成部分［20，22-24］，M 和E 蛋白與核衣殼之間的相互作用導致病毒出芽。M蛋白胞質(zhì)尾中的單個酪氨酸對于與SARS-CoV 的S蛋白有效相互作用非常重要，S 蛋白可被摻入病毒包膜，成熟的病毒粒子從細胞中釋放出來。IBV 和嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥 SARS-CoV［19，23］中也已鑒定出M 和S 蛋白之間的相互作用。因此，M 蛋白是病毒裝配和形態(tài)發(fā)生中的關鍵成分之一，參與復制的調(diào)控并將基因組RNA 包裝到病毒顆粒。

迄今為止，關于M 蛋白抗原特性的信息有限。冠狀病毒的M 蛋白能在感染或由表達M 蛋白的減毒重組病毒免疫的宿主中誘導抗體應答［25-29］。小鼠肝炎病毒（一種小鼠冠狀病毒）M 蛋白的單克隆抗體可在體外中和病毒的感染性［30-31］，并保護動物免受體內(nèi)致命病毒的攻擊［31］。這些特征使M 蛋白成為開發(fā)診斷測試和亞單位疫苗的有吸引力的靶標［25-29，32-35］，盡管其抗原決定簇尚待確定。后期有實驗對SARSCoV 進行研究，確定了分別位于極端N-末端區(qū)域（殘基1-31）和內(nèi)部C-末端區(qū)域（殘基132-161）的M 蛋白上的兩個主要免疫顯性表位［36］，采集了SARS 患者的半數(shù)血清和病毒免疫小鼠及家兔的抗血清，發(fā)現(xiàn)來自N-末端抗原決定基的合成肽M1-31 和來自C-末端抗原決定基的M132-161 與來自40 名SARS患者的所有恢復期血清高度反應，但與來自健康獻血者的30 份對照血清樣品無反應，提示其在SARS血清學診斷中的潛在應用價值，顯示兩種肽（M1-31和M132-161）均能在免疫兔中誘導高滴度的抗體反應，從而突出了它們的抗原性和免疫原性。這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)SARS 診斷制劑和疫苗提供了重要信息。多種證據(jù)表明，即使蛋白大部分被埋在病毒膜中，其也能在感染或免疫過程中誘導抗體反應［25-29］。盡管尚未定義冠狀病毒M 蛋白上的抗原位點，但推測其N-端親水性胞外域包含負責免疫反應的主要抗原決定簇［37］。尚未確定α 干擾素對病毒感染免疫作用的重要性，但已證明可傳播的胃腸炎病毒M蛋白的N-末端暴露區(qū)域是α 干擾素在淋巴細胞中的誘導劑。因此，可借助在SARS-CoV 的M 蛋白上發(fā)現(xiàn)的免疫優(yōu)勢表位來理解SARS-CoV-2 M 蛋白的免疫原性。

本研究應用生物信息學技術預測SARS-CoV-2 M 蛋白的B 細胞表位，經(jīng)綜合上述參數(shù)分析，其可能的B 細胞優(yōu)勢表位位于肽段5-14，位于膜外區(qū)域。Vector NTI Advance 11 同源性匹配分析顯示，SARSCoV-2 M 蛋白與SARS-CoV M 蛋白的同源性匹配為90%，鑒于其M 蛋白之間的高度相似性，可以目前對SARS-CoV M 蛋白的相關研究結果為研發(fā)SARSCoV-2 疫苗提供思路，最終結果需進行實驗來鑒定。