張存勝，劉巖，楊莉，田玉菲

（1 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2 江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室,江蘇南京210042；3 南京智造力知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司，江蘇南京211100）

乙醇在汽油中的推廣使用，使得生物丁醇和生物己醇研究備受關(guān)注。作為中鏈醇，己醇具有高能量密度、低水溶性、低揮發(fā)性等特點，可與汽油混合作為燃料使用；在醫(yī)藥化工領(lǐng)域，己醇也是許多產(chǎn)品的重要前體原料[1]。目前己醇主要由化學(xué)法制備，即Ziegler生產(chǎn)途徑[2]，其反應(yīng)式如式(1)～(4)。

由于化工合成途徑對環(huán)境污染較大，尋求廉價、綠色的己醇合成方法十分緊迫。利用微生物發(fā)酵合成生物醇類是一項極具前景的綠色技術(shù)，它可以通過微生物發(fā)酵將原料轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇，避免化工途徑產(chǎn)生的重污染。生物乙醇是生物法合成醇類的典型案例，批式發(fā)酵時乙醇濃度可高達100g/L[3]。與生物乙醇相比，生物己醇發(fā)酵技術(shù)尚不成熟。工業(yè)廢棄合成氣是目前報道最多的己醇發(fā)酵原料之一，其用于己醇發(fā)酵具有抑制物少、成本低等優(yōu)勢，但也存在諸多問題，如反應(yīng)速率慢、產(chǎn)量低、氣液傳質(zhì)效率低等[4]。本文結(jié)合近幾年的生物己醇研究進展，對合成氣制備生物己醇的研究進行了綜述，分別介紹了己醇合成的幾種微生物及相關(guān)原理，討論了影響合成氣己醇發(fā)酵的關(guān)鍵因素，并對己醇的發(fā)酵策略進行了論述，最后對生物己醇的發(fā)展前景進行了展望，旨為己醇生物合成研究提供思路，以期生物己醇用于工業(yè)生產(chǎn)。

1 己醇發(fā)酵微生物及代謝原理

目前報道中，生物己醇的合成有兩種途徑，一是利用單一菌株直接將合成氣轉(zhuǎn)化為己醇，能夠?qū)崿F(xiàn)該轉(zhuǎn)化的菌僅有Clostridium carboxidivorans[4]，其代謝原理如圖1所示。代謝途徑分為甲基途徑和羰基途徑兩個分支，兩個分支將氣態(tài)底物轉(zhuǎn)為中間產(chǎn)物乙酰輔酶A（acetyl-CoA），乙酰輔酶A在不同酶的作用下有3 個轉(zhuǎn)化方向：①生成乙酸和乙醇（Wood-Ljungdahl 途徑）；②通過丁酰輔酶A（butyryl-CoA）生成丁酸和丁醇；③通過己酰輔酶A（hexanoyl-CoA），生成己酸和己醇[5-6]。值得注意的是，在乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)換為己酰輔酶A 的過程中，丁酰輔酶A 通過硫解酶與乙酰輔酶A 作用生成3-氧代己酰輔酶A，進一步轉(zhuǎn)化為己酰輔酶A，此過程為己醇合成的重要途徑，為鏈延伸過程[7]。通過己酰輔酶A合成己醇有兩種可能的途徑：①醛脫氫酶將己酰輔酶A還原為己醛，己醛通過己醇脫氫酶還原為己醇[8]；②生成的己酸直接被還原為己醇，在此情況下，己酸先由醛氧化還原酶轉(zhuǎn)化為己醛，然后再由己醇脫氫酶轉(zhuǎn)化為己醇[9]。

由于能夠直接進行生物己醇合成的微生物極少，一般采用多種微生物混合發(fā)酵，通過它們的協(xié)同作用制備己醇，是己醇生物合成的可替代途徑。利用不同菌種將合成氣轉(zhuǎn)化為己醇的過程可分為3個階段，如表1所示，第一步為合成氣向乙酸、乙醇的轉(zhuǎn)化，即通過Wood-Ljungdahl 途徑將CO、CO2和H2轉(zhuǎn)化為乙酸和乙醇[10-13]；第二步為乙酸乙醇向己酸的轉(zhuǎn)化，即乙酸乙醇通過鏈延伸作用合成中鏈己酸[14]；第三步為己酸向其對應(yīng)醇的轉(zhuǎn)化，即己酸還原為己醇[15-16]。

由表1不難發(fā)現(xiàn)，除C.carboxidivorans外，其他菌株均不能獨立完成合成氣向己醇的轉(zhuǎn)化。利用不同功能的微生物混合發(fā)酵，基于它們的協(xié)同作用，為己醇的轉(zhuǎn)化提供了可能。Diender等[18]以合成氣為原料，將C.autoethanogenum 和C.kluyveri 進行混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物中有己醇生成，兩株菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了協(xié)同作用，其中C.autoethanogenum將合成氣轉(zhuǎn)化為乙酸和乙醇，而C.kluyver 通過反向β氧化將乙酸乙醇轉(zhuǎn)化為己酸，C.autoethanogenum利用合成氣將己酸還原為己醇。無獨有偶，Richter等[19]將C.ljungdahlii和C.kluyveri進行混合發(fā)酵，實現(xiàn)了合成氣向己醇轉(zhuǎn)化。

圖1 Clostridium carboxidivorans合成己醇代謝途徑

表1 合成氣轉(zhuǎn)化為己醇的功能菌株

相比而言，合成氣向乙酸乙醇和己酸的轉(zhuǎn)化技術(shù)已取得顯著進展[10-14]，然而，己酸還原為己醇的研究尚未有明顯突破。新近研究發(fā)現(xiàn)，一些菌株能夠利用合成氣將羧酸還原為相應(yīng)的醇，如Clostridium ragsdalei、C.ljungdahlii、Alkalibaculum.bacchi 和C. carboxidivorans 等[15-16]。Liu 等[16]研 究 發(fā)現(xiàn)，A. bacchi CP15 單一培養(yǎng)時己酸轉(zhuǎn)化率僅為63.6%，而Alkalibaculum bacchi CP15 與Clostridium propionicum 混合發(fā)酵時己酸轉(zhuǎn)化率高達90.7%。這表明將兩種或多種菌種混合培養(yǎng)，能夠?qū)崿F(xiàn)己醇的連續(xù)轉(zhuǎn)化。

2 提高合成氣己醇發(fā)酵效率的措施

2.1 合成氣組分調(diào)控

合成氣中CO、H2和CO2的體積分數(shù)分別為1%～59%、2%～34%和10%～15%[20]。CO 和H2是合成氣發(fā)酵中微生物主要的碳源和電子來源，CO2只能在CO 或H2存在的情況下作為碳源使用[21]。適宜濃度的CO 可以促進細胞的生長和乙醇的產(chǎn)生，有研究表明，在H2/CO比為0.36時，發(fā)酵得到的最大乙醇/乙酸比僅為0.06，而H2/CO比為1.2時，乙醇/乙酸比可達2.5[16]，因此為了增加醇的產(chǎn)量，可適當(dāng)?shù)靥岣吆铣蓺饨M分中CO 的濃度。但過高的CO濃度會抑制微生物氫化酶的活性，例如混合氣體中CO 體積分數(shù)為10%時，其對C.ragsdalei 氫化酶活性的抑制率高達90%[22]。當(dāng)氫化酶的活性被抑制時，微生物將通過一氧化碳脫氫酶（CODH）氧化CO 獲得電子，此時醇的轉(zhuǎn)化率將會降低，這是由于CO 被用于交換電子而非物質(zhì)轉(zhuǎn)化[23]。因此，為了獲得較高的碳轉(zhuǎn)化率和高己醇產(chǎn)量，應(yīng)控制合成氣中CO濃度，避免其對氫化酶產(chǎn)生抑制作用。

2.2 抑制物控制

除CO、H2、CO2外，合成氣還含有許多微量化合物，用于己醇發(fā)酵時，會嚴重影響微生物的生長和代謝[24]。例如，NO 的摩爾分數(shù)大于0.015%時會明顯抑制C.carboxidivorans P7氫化酶的活性，使氫化酶分解H2產(chǎn)生電子受到抑制[23]。氨是可能出現(xiàn)在合成氣中的另一抑制物，Xu 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，氨的存在會導(dǎo)致培養(yǎng)基中銨離子（N）的積累，從而抑制了氫化酶活性和細菌的生長，氨的摩爾分數(shù)為0.37% 時就會對C. ragsdalei 產(chǎn)生明顯的抑制。Zhang 等[26]通過高濃度氨氮進行了己酸發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)C.kluyveri 游離細胞對氨氮的耐受極限值是2.0g/L，采用秸稈對該菌進行固定化培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，固定細胞對氨氮的耐受性顯著提高，氨氮濃度達5.0g/L時該菌仍可進行己酸轉(zhuǎn)化，這表明通過細胞固定手段可以提高微生物對抑制物的抵抗能力。因此，在利用工業(yè)廢棄合成氣進行發(fā)酵時，一方面需提高微生物的耐受性，另一方面可去除合成氣中雜質(zhì)，以提高發(fā)酵的穩(wěn)定性、降低其對發(fā)酵的負面影響。

2.3 氣液傳質(zhì)效率提高

CO 和H2在水相中的溶解度均較低，雖然其可為己醇發(fā)酵提供碳源和能源，但由于氣液傳質(zhì)的限制，降低了氣體利用率、限制了溶劑產(chǎn)量[27]。許多研究對不同的反應(yīng)器進行了探索研究以增強氣液傳質(zhì)效率，如連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器（CSTR）、中空纖維膜反應(yīng)器（HFMR）、泡柱反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器等。其中，CSTR 通過葉輪攪拌可提高氣體與液體的接觸面積促進氣液傳質(zhì)，且易于操作和控制，是目前最常用的反應(yīng)器[28]。在HMFR中，氣態(tài)底物流經(jīng)中空纖維膜的管腔，通過微孔膜擴散而不形成氣泡，微生物在中空纖維膜的另一側(cè)生長、形成生物被膜，能夠快速吸收擴散過來的氣體，有效提高傳質(zhì)效率[29]。

另有研究表明，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加活性炭和納米顆粒等固定化載體能提高氣液接觸面積和傳質(zhì)效率。Lee 等[30]研究了磁性二氧化硅納米顆粒對合成氣發(fā)酵過程中CO、H2和CO2溶解度、細胞質(zhì)量、醇和酸產(chǎn)量的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗組能將CO、H2和CO2的溶解量分別提高3.15倍、2.94倍和0.97倍，將乙醇、乙酸濃度和細胞質(zhì)量分別提高2.14 倍、0.6 倍和2.28 倍，其機理在于穩(wěn)定的納米顆粒與氣泡相互碰撞使氣泡破碎變小，增加了傳質(zhì)面積[31]。

CO、H2或CO2等氣體的溶解度與壓力成正相關(guān)的線性關(guān)系，高壓可改善傳質(zhì)、促進培養(yǎng)基中底物更好的供應(yīng)，并增加細胞對碳源和能量的利用，從而獲得更高的生長速率和產(chǎn)物濃度[28]。Abubackar等[32]比較了不同初始壓力對C.autoethanogenum發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響，發(fā)現(xiàn)高壓環(huán)境會促使乙醇產(chǎn)量增加，這是由于高壓對氣體的溶解度和生物轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生了積極的影響。

2.4 溫度與pH調(diào)控

溫度與pH 是影響發(fā)酵效率的重要環(huán)境因子，它們會直接影響細胞活性、生長速度甚至代謝途徑。多數(shù)微生物發(fā)酵適合在30～37℃中溫下進行。然而最近研究表明，中溫雖有利于酸的積累，但不適合醇類的產(chǎn)出，與37℃相比，若將C.carboxidivorans P7 在25℃的低溫下培養(yǎng)，其代謝活性和生長速度降低、遲滯期延長，但低溫能促使乙醇和丁醇產(chǎn)量提高，分別達到了32.1mmol/L 和14.5mmol/L，對應(yīng)的己醇和己酸濃度分別為8.21mmol/L 和9.02mmol/L[13]，這表明適宜的低溫環(huán)境可促進碳鏈延伸和長鏈酸醇累積。發(fā)酵溫度不僅影響微生物的生長和底物轉(zhuǎn)化，也會影響合成氣在發(fā)酵液中的溶解度[28]，低溫環(huán)境更利于氣體的溶解。因此，在己醇發(fā)酵過程中，可通過調(diào)整培養(yǎng)溫度來實現(xiàn)某一目標產(chǎn)物的積累。

C.carboxidivorans生長的pH范圍為4.4～7.0，最佳pH為5.0～7.0[33]。高pH（5.0～6.0）有利于細胞生長和羧酸轉(zhuǎn)化，低pH（4.5～5.0）有利于醇類物質(zhì)生成[34-35]。然而，過低的pH 會抑制細菌生長，最終導(dǎo)致細胞死亡。Abubackar 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在控制pH 為4.5 的合成氣發(fā)酵過程中， C.autoethanogenum中只有乙醇的產(chǎn)量增多。pH為6.0時，發(fā)酵體系會積累等量的乙酸和乙醇，這表明pH對微生物利用合成氣具有重要的影響，低pH更有利于溶劑的生成。

2.5 其他措施

金屬元素通常在Wood-Ljungdahl 途徑中與底物結(jié)合或影響電子轉(zhuǎn)移，從而影響產(chǎn)物的積累，增加培養(yǎng)基中特定微量金屬的濃度會提高己醇產(chǎn)量[37]。生產(chǎn)乙醇、丁醇和中鏈醇也需要較低的氧化還原電位，無氧環(huán)境對微生物利用合成氣極為重要，在底物中加入還原劑如Na2S 可為微生物提供良好生長環(huán)境、提高長鏈醇產(chǎn)量。另外，H2作為還原物質(zhì)還可提供電子、參與NAD(P)+向NAD(P)H的轉(zhuǎn)化，有利于醇類物質(zhì)生成[38]。

3 生物己醇發(fā)酵發(fā)展前景分析

我國正己醇產(chǎn)量較低，例如2019 年國內(nèi)正己醇產(chǎn)量約2000 噸。而國內(nèi)正己醇需求量則日趨增大，預(yù)計至2023 年國內(nèi)己醇需求量將達6400t/a，未來幾年己醇價格將維持在3.9 萬元/噸左右。相比之下，工業(yè)廢棄合成氣的價格極為低廉，約0.915CNY/m3。利用廉價合成氣進行己醇高值轉(zhuǎn)化具有較強的經(jīng)濟優(yōu)勢，然而技術(shù)瓶頸將合成氣己醇發(fā)酵限制在實驗室研究水平。目前，利用廉價合成氣發(fā)酵制備乙醇已在多地投產(chǎn)應(yīng)用，例如，朗澤技術(shù)（Lanza Tech）公司與中國首鋼集團啟動了全球首個將工業(yè)廢氣轉(zhuǎn)化為乙醇的商業(yè)化設(shè)施[29]，生物乙醇生產(chǎn)顯示了良好的經(jīng)濟效益和社會效益[39]。

近年來，研究人員對合成氣發(fā)酵的研究主要集中在丁醇生產(chǎn)，對己醇的研究報道較少、且己醇濃度較低，例如，由C.carboxidivorans 利用合成氣制備己醇時最高濃度僅為1.06g/L[4]，未來生物己醇的研究方向?qū)⒓性诳朔彤a(chǎn)量的“瓶頸”問題，有望在下列3個方面取得突破。

3.1 構(gòu)建基因工程菌

Bruant等[40]對C.carboxidivorans的整個基因組進行了測序，經(jīng)過對比分析，發(fā)現(xiàn)C.carboxidivorans具 有 完 整 的 Wood-Ljungdahl 基 因 簇， 且C.carboxidivorans具有能夠編碼己醇脫氫酶的基因，己醇脫氫酶使己酰輔酶A轉(zhuǎn)換為己醇，目前尚未發(fā)現(xiàn)其他梭狀芽孢桿菌具有這種己醇脫氫酶。有研究提出，利用基因組整合可使生成副產(chǎn)物的途徑中止，提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)率；或通過合成生物學(xué)手段，將Wood-Ljungdahl 途徑的基因移植到更具可塑性的細胞內(nèi)，以提高己醇產(chǎn)率[41]。目前，Wood-Ljungdahl 途徑的基因已經(jīng)被成功引入大腸桿菌[42]，隨著基因工程技術(shù)進一步發(fā)展，此類方法有望實現(xiàn)生物己醇產(chǎn)量突破。

3.2 兩種或兩種以上菌株的混合發(fā)酵

對兩株或多株菌混合培養(yǎng)，利用混菌協(xié)同作用實現(xiàn)己醇轉(zhuǎn)化的可行性已被證實。然而，混合發(fā)酵仍有諸多問題有待解決。通過調(diào)節(jié)發(fā)酵體系關(guān)鍵環(huán)境因子，能夠改善微生物生長條件和傳質(zhì)效率，為己醇產(chǎn)量提高提供可能。例如，C.autoethanogenum和C. kluyveri 的共培養(yǎng)只能在pH 為5.5～6.5 的范圍內(nèi)進行[20]，對pH 進行實時在線調(diào)節(jié)能夠同時提高兩株菌的發(fā)酵性能。合成氣中的CO對C.kluyveri會產(chǎn)生毒性[19]，適當(dāng)調(diào)節(jié)CO 初始濃度可降低CO 對C.kluyveri毒性。為促進微生物與合成氣充分接觸，可開發(fā)更為有效的反應(yīng)器以增大氣液接觸面積、提高氣液傳質(zhì)效率。

3.3 高產(chǎn)己醇菌篩選

自然界的土壤、厭氧活性污泥及生物質(zhì)廢水中微生物種類繁多，大多數(shù)微生物屬于未培微生物，從自然界篩選高產(chǎn)己醇菌是獲取目標菌株的重要手段。例如，C.carboxidivorans 最初即是從美國俄克拉荷馬州的農(nóng)業(yè)瀉湖中分離獲得[33]，這表明自然界是目標菌株的重要來源。未來的研究需要對篩選培養(yǎng)基進行科學(xué)設(shè)計，并對所篩選菌株進行馴化等，以獲取高效表達、高耐受性的目標菌株。

4 結(jié)語

采用工業(yè)廢棄合成氣進行生物己醇合成能夠降低己醇的生產(chǎn)成本，提高其經(jīng)濟價值，同時又能減少廢氣排放，實現(xiàn)資源利用和環(huán)保的雙贏。除合成氣外，許多生物質(zhì)廢棄物也是生物己醇的良好原料，例如采用混合發(fā)酵時，乙醇、乙酸和己酸均可由生物質(zhì)獲得，這將拓寬生物己醇發(fā)酵的原料范圍，為其廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。目前，生物己醇發(fā)酵的瓶頸問題仍然是己醇產(chǎn)量較低，通過基因技術(shù)獲取突變株、從自然篩選功能菌和混菌發(fā)酵有望在己醇方面取得突破，通過耐受性篩選、關(guān)鍵環(huán)境因子調(diào)控等手段能夠進一步提高己醇發(fā)酵性能，為生物己醇的產(chǎn)量提高提供了可能。