王 娟 綜述，賀琤雯 審校

1．海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院實驗診斷科，上海 200433；2．南方醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗專業(yè)2016級，廣東廣州 510515

原發(fā)性肝癌(PLC)是我國常見的惡性腫瘤之一，它是因肝內(nèi)膽管細胞或肝細胞變異或受到致病菌侵襲導致的惡性腫瘤，具有較高的病死率。早期診斷與治療是延長患者生存周期，提高治療效果的關(guān)鍵。甲胎蛋白(AFP)異質(zhì)體AFP-L3是《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)》推薦的PLC診斷指標，它具有靈敏度高和特異度高等特點[1]。作為肝癌細胞特異性生成的AFP亞型，它與癌細胞增殖程度密切相關(guān)，并在肝臟疾病的早期診斷及預后評估中起重要作用[2-3]。鑒于AFP異質(zhì)體在肝臟疾病中的重要作用，筆者對AFP異質(zhì)體的檢測方法及其與肝臟疾病診斷、預后的關(guān)系等方面進行了綜述。

1 AFP異質(zhì)體的分類

AFP是一種含有兩條復合糖鏈的胚源性糖蛋白，60年代起就作為肝臟惡性腫瘤的標志物。由于來源的不同，其分子在糖鏈結(jié)構(gòu)的亞結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)也不同，由此衍生出AFP變異體，也稱AFP異質(zhì)體。OKUYAMA等[4]根據(jù)AFP與外源性凝集素結(jié)合能力的差異，采用扁豆凝集素(LCA)親和雙向放射免疫電泳法，將人體血清AFP分成LCA結(jié)合型和LCA非結(jié)合型兩種類型異質(zhì)體。從陰極開始在LCA親和電泳上AFP的條帶依次是L1、L2、L3，分別命名為AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3。其中AFP-L1主要存在于慢性肝炎和肝硬化患者血清中，構(gòu)成非惡性肝病AFP的主要部分；AFP-L2主要來自卵黃囊腫瘤，懷孕期間母體內(nèi)可檢測到；AFP-L3是一種異常糖基化AFP，為肝癌細胞特異性產(chǎn)生[5-6]。前兩者為LCA非結(jié)合型，后者為LCA結(jié)合型，目前人們通常所說的AFP異質(zhì)體實際是指與LCA結(jié)合的AFP-L3[7]。

2 AFP異質(zhì)體檢測技術(shù)

2.1親和免疫交叉電泳法 親和免疫交叉電泳是檢測AFP異質(zhì)體的傳統(tǒng)方法，具體是將LCA和瓊脂糖均勻混合制成凝膠板，血清點樣后進行電泳。根據(jù)其分子量大小，與LCA結(jié)合的糖蛋白電泳速度降低，以此與非結(jié)合型分離。然后再做垂直免疫電泳，AFP異質(zhì)體與抗AFP抗體結(jié)合形成沉淀峰，經(jīng)考馬斯亮藍法、放射自顯影法或酶標法等顯色技術(shù)顯色后進行定量測定[8]。此方法操作相對簡單，但干擾因素較多，顯帶圖像不夠清晰，靈敏度較低，故臨床目前較少采用此方法進行AFP-L3的檢測。

2.2親和吸附法 親和吸附法采用親和吸附離心柱，柱內(nèi)裝有耦聯(lián)了LCA的瓊脂糖作為親和介質(zhì)[9]。以液相競爭為基礎，在原有AFP測定的基礎上增加一個親和吸附的前處理步驟，當血清通過離心柱時，與LCA結(jié)合力強的留在柱中，經(jīng)過清洗液除去未結(jié)合的AFP亞型，最后浸泡洗脫得到較純的結(jié)合型AFP-L3。AFP-L3及總的AFP可用化學發(fā)光法定量檢測。目前臨床采用商品化的微量離心柱法試劑，可以快速、簡便地獲得標本中的AFP-L3成分，然后應用化學發(fā)光方法進行定量檢測，方法簡單，結(jié)果較為準確，成本較低，是目前臨床常用方法。

2.3AFP-L3蛋白芯片 該方法將鼠源AFP單克隆抗體和小LCA點樣固定在醛基玻片上，制備出AFP抗體和小LCA蛋白芯片，并對血清標本進行檢測，最后利用化學發(fā)光方法獲得各個待測標本的化學發(fā)光像素值。該蛋白芯片檢測方法實現(xiàn)了在同一檢測窗內(nèi)，通過一次血清標本加樣，同時檢測AFP和AFP-L3。該方法兼有方便省時和經(jīng)濟實用兩大優(yōu)勢，未來可應用于進行大規(guī)模的肝細胞癌(HCC)篩查檢測，也為未來多種腫瘤標志物同時檢測提供了可參考的新途徑。

2.4全自動電泳熒光免疫分析法 隨著自動化儀器的普及，全自動免疫分析儀在臨床得到廣泛應用。該方法通過使用免疫熒光法在液相中進行抗原抗體反應后，分離并檢測形成的免疫復合物，通過計算各組分熒光強度的峰面積，得到AFP-L3的比值。試劑由測定對象物質(zhì)中具有親和性的抗原、抗體、受體等加上陰離子構(gòu)成。測定程序大體分為5個步驟：(1)形成陰離子結(jié)合物(結(jié)合了DNA的標識體)、測定對象物質(zhì)及熒光結(jié)合物(結(jié)合了熒光物質(zhì)的標識體)的復合體的液相反應工序。(2)通過形成的復合體與復合體結(jié)合的陰離子的移動力，進行等速電泳、濃縮的工序。(3)感知電位差，從等速電泳切換到區(qū)帶電泳的工序。(4)利用區(qū)帶電泳的復合體分離工序。(5)利用激光引起熒光測定的分析工序。該方法快速高效，極大地提高了檢測的敏感性和特異性。并能實現(xiàn)AFP+AFP-L3+維生素K缺乏或拮抗劑-Ⅱ誘導的蛋白質(zhì)(PIVKA-Ⅱ)聯(lián)合檢測，提升了早期HCC的診斷效能，彌補單項檢測的不足[10]。同時，由于操作簡便，快速且重復性好，該方法被越來越多的臨床實驗室所接受。

3 AFP異質(zhì)體的臨床應用

3.1肝臟疾病鑒別診斷 過去認為AFP偏高一般意味著肝癌的發(fā)生，但許多良性肝臟疾病，如肝損傷、充血性肝大，也會使AFP升高，單憑AFP結(jié)果難以區(qū)分良、惡性病變。AFP-L3升高與肝癌細胞生成較多的AFP-L3分子有關(guān)，且AFP-L3占血清AFP的百分比(AFP-L3%)升高不依賴于總的AFP水平，體現(xiàn)了良惡性細胞的異質(zhì)性，能夠排除良性肝病引起的AFP升高[11-13]，具有更高的特異度。慢性乙型肝炎(CHB)患者血清中AFP-L3水平顯著高于健康人群[14]，且隨著Child-Pugh分級增加，血清AFP-L3水平呈上升趨勢[15]，進一步說明AFP-L3可檢測肝細胞損傷程度，作為評估肝功能的重要指標。AFP-L3不受影像學陰影束縛[16]，其陽性率與癌腫塊大小無關(guān)，而AFP水平與之呈正相關(guān)，小肝癌(癌最大徑<2 cm)患者中三分之一不會有AFP升高，但約35%患者血清中可檢測到AFP-L3[17]。AFP-L3陽性的肝癌有快速生長和早期轉(zhuǎn)移的潛在可能。

3.2PLC的療效評估及預后判斷 PLC患者血清中AFP-L3普遍高表達，并且與TNM分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)[14]。目前治療肝癌的最有效方法依然是手術(shù)切除，早期切除對患者預后療效有一定幫助。切除后AFP水平隨之下降，下降速度與體內(nèi)AFP殘余量及半衰期有關(guān)。手術(shù)成功則一般AFP在兩個月內(nèi)轉(zhuǎn)陰，AFP異質(zhì)體將消失。若檢測結(jié)果顯示AFP下降明顯但未轉(zhuǎn)為陰性，AFP異質(zhì)體變化不明顯，則提示手術(shù)不徹底，癌組織還存在邊緣殘留或轉(zhuǎn)移等。若AFP異質(zhì)體下降至25%以下，與AFP水平保持相對恒定，則可能是肝炎或肝硬化所致[18]。

4 AFP異質(zhì)體的其他應用

4.1在胚胎性腫瘤鑒別診斷中的價值 AFP主要由胎兒的肝細胞及卵黃囊合成[19]，妊娠期婦女體內(nèi)AFP水平會出現(xiàn)規(guī)律性波動，胚胎性腫瘤會造成AFP異常升高，與肝癌較難區(qū)分。此時AFP異質(zhì)體的檢測在鑒別診斷中可起到一定作用。相關(guān)資料表示，肝癌患者血清中以LCA結(jié)合型為主，即AFP-L3占主要部分，而胚胎性腫瘤患者血清以LCA非結(jié)合型為主[20]。

4.2在篩查胎兒唐氏綜合征(DS)中的價值 DS是新生兒出生缺陷常見的一類遺傳性疾病。目前多采用孕中期母血清中AFP、游離β-人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)及游離雌三醇等標志物進行產(chǎn)前篩查，但檢測靈敏度均較低，只有60%～70%。有研究表明[21]，AFP-L2或AFP-L3在篩查DS方面優(yōu)于AFP。以AFP-L2、AFP-L3替代AFP并與游離β-hCG建立不同模型分析后結(jié)果顯示，以AFP-L2+AFP-L3+游離β-hCG篩查DS胎兒的AUC最高[0.929(95%CI:0.861～0.975)]。臨界值為1/1 636時，靈敏度、特異度、約登指數(shù)分別為0.907、0.857、0.764。

5 AFP異質(zhì)體與AFP聯(lián)合檢測在PLC中的應用

AFP是PLC的血清標志物，但有部分患者表現(xiàn)為持續(xù)性的AFP陰性[22],且AFP受妊娠等多種因素影響，部分良性肝病患者也可存在外周血AFP升高，因此AFP用于診斷存在漏診、誤診的可能。AFP-L3在肝癌細胞中特異性表達,亓艷[23]等研究表明，AFP-L3單獨診斷HCC的靈敏度為56.52%，特異度為90.67%，準確度為79.65%，特異度有所提高，但靈敏度和準確度仍未令人滿意。目前臨床普遍采用AFP聯(lián)合AFP-L3對PLC進行診斷，可在保證特異度的基礎上大大提高靈敏度和準確度。AFP檢測陰性的患者可能AFP-L3檢測為陽性，由于兩種檢測指標存在不完全交叉，所以聯(lián)合診斷能夠彌補單指標檢測的不足，提高臨床應用價值。

6 結(jié)論與展望

AFP-L3對于早期診斷PLC具有十分重要的臨床意義，其靈敏度、特異度顯著高于AFP[24-26]。為提高PLC檢出的正確率和患者生存率，越來越多的AFP-L3聯(lián)合檢測方案被提出，但對于如何采用更好的檢測組合，以及簡單、快速的實驗方法，還有待于進一步研究。