賈曉昀，王寒濤，魏恒玲，喻樹(shù)迅

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所，棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽(yáng) 455000；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035)

陸地棉(GossypiumhirsutumL.)是世界上播種面積最大、產(chǎn)量最高的棉種，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)及日常生活中占有重要地位。高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)是棉花新品種選育始終追求的育種目標(biāo)，而協(xié)調(diào)產(chǎn)量與品質(zhì)之間復(fù)雜的相互影響也成為育種的難題[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，棉花產(chǎn)量與纖維品質(zhì)性狀之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，通過(guò)傳統(tǒng)育種手段實(shí)現(xiàn)同步改良的難度較大。近年來(lái)，生產(chǎn)上的無(wú)膜種植及機(jī)械化采收對(duì)棉花早熟性提出更高要求[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，棉花早熟性與纖維品質(zhì)、產(chǎn)量之間也存在復(fù)雜的相互影響[7-10]。因此，協(xié)調(diào)早熟性、產(chǎn)量、纖維品質(zhì)三者之間的相互關(guān)系成為棉花育種新的難題[5，8，10-12]。

早熟棉又稱(chēng)短季棉，其突出特點(diǎn)是生育期較短、結(jié)鈴?fù)滦跫校聿ピ缡?，適宜黃河流域、長(zhǎng)江流域棉區(qū)麥(油)后直播，實(shí)現(xiàn)棉田的一年兩熟[12-13]；也適宜在西北內(nèi)陸棉區(qū)推遲播種時(shí)間，露地直播，減少地膜的使用，并提高機(jī)械采收水平[14]。因此，培育早熟棉被認(rèn)為是緩解當(dāng)前糧棉爭(zhēng)地矛盾、提高植棉經(jīng)濟(jì)效益、減少土壤污染的有效措施[13-14]。然而，早熟棉的主要缺點(diǎn)是其產(chǎn)量潛力較小、纖維品質(zhì)較差，難以保證豐產(chǎn)并滿(mǎn)足高端紡織產(chǎn)品的需求[15]。因此，深入挖掘棉花早熟性、產(chǎn)量、纖維品質(zhì)的分子遺傳機(jī)制，明確三者之間相互作用的分子遺傳因素，不僅有助于了解棉花基因組的功能信息，更有助于早熟、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)棉花新品種的培育。

前期已有大量關(guān)于棉花早熟性、產(chǎn)量和纖維品質(zhì)QTL(Quantitative trait loci)定位的研究報(bào)道[7，12，16-28]，為了解棉花重要性狀遺傳機(jī)制提供充實(shí)的研究基礎(chǔ)。近期，Zhang等[29]通過(guò)多年多點(diǎn)試驗(yàn)，以重組自交系群體為材料，結(jié)合多種標(biāo)記類(lèi)型構(gòu)建高密度遺傳圖譜，研究了棉花纖維品質(zhì)和產(chǎn)量之間復(fù)雜遺傳基礎(chǔ)。但是，關(guān)于棉花早熟性、產(chǎn)量、纖維品質(zhì)三者之間相互關(guān)系的研究較少。因此，本研究以早熟棉為母本構(gòu)建一個(gè)陸地棉種內(nèi)重組自交系(Recombinant inbred line，RIL)群體，經(jīng)過(guò)連續(xù)6 a田間性狀調(diào)查，在構(gòu)建高密度遺傳圖譜、QTL定位基礎(chǔ)上[24，30-31]，分析早熟性、產(chǎn)量、纖維品質(zhì)之間的相關(guān)性及其分子遺傳基礎(chǔ)，為明確三者之間相互作用的遺傳機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及性狀調(diào)查

本研究以早熟棉中棉所36為母本、自交系G2005為父本，于2006年在安陽(yáng)完成雜交，經(jīng)連續(xù)多代自交，構(gòu)建了包含137個(gè)株系的重組自交系群體(F8)，并于2010-2015連續(xù)6 a在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所農(nóng)場(chǎng)種植，完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，單行小區(qū)，4.0 m行長(zhǎng)，0.8 m行距，0.2 m株距，3次重復(fù)，田間管理按照農(nóng)場(chǎng)大田管理。

現(xiàn)蕾期調(diào)查每行中部10株棉花第一果枝節(jié)位(Node of first fruiting branch，NFFB)，并于9月底調(diào)查第一果枝節(jié)位高度(Height of NFFB，HNFFB)、株高(Plant height，PH)；整行調(diào)查開(kāi)花期(Flowering timing，F(xiàn)T)、吐絮期(Boll opening timing，BT)(每行50%植株開(kāi)花/吐絮日期即為開(kāi)花期/吐絮期)，計(jì)算花鈴期(Flowering to boll-opening period，F(xiàn)BP)和全生育期(Whole growth period，WGP)；成熟后，每行人工收獲正常吐絮棉鈴50朵，調(diào)查鈴重(Boll weight，BW)、衣分(Lint percentage，LP)等產(chǎn)量相關(guān)性狀，軋花后檢測(cè)纖維長(zhǎng)度(Fiber length，F(xiàn)L)、比強(qiáng)度(Fiber strength，F(xiàn)S)、整齊度(Fiber uniformity，F(xiàn)U)、馬克隆值(Micronaire，MC)、伸長(zhǎng)率(Fiber elongation rate，F(xiàn)E)等纖維品質(zhì)相關(guān)性狀。

1.2 遺傳圖譜構(gòu)建

采用CTAB法提取親本及RIL群體的DNA，Restriction site associated DNA(RAD)法進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序及構(gòu)建遺傳圖譜[32]。于IlluminaHiSeq 2000高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序工作在深圳華大基因(BGI)完成，測(cè)序讀長(zhǎng)為100 bp的雙末端測(cè)序。采用BWA(version 0.5.9-r16)軟件將序列比對(duì)到陸地棉參考基因組；利用GATK(the Genome Analysis Toolkit)軟件和SAMTools軟件同時(shí)進(jìn)行SNP變異位點(diǎn)檢測(cè)，鑒定親本與參考基因組之間的差異堿基；采用HighMap策略進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建。

1.3 數(shù)據(jù)分析及QTL定位

表型數(shù)據(jù)首選通過(guò)Excel 2016計(jì)算平均數(shù)，再通過(guò)SAS 9.3軟件(SAS Institute，Inc.，Cary，NC，USA)計(jì)算各性狀之間的相關(guān)性。

采用WinQTLCart 2.5軟件復(fù)合區(qū)間作圖法(Composite interval mapping，CIM)完成加性效應(yīng)QTL分析，窗口大小為5 cM，步長(zhǎng)1 cM，背景標(biāo)記10個(gè)，LOD值由0.05顯著水平下1 000次迭代計(jì)算確定；采用MapChart軟件完成QTL染色體分布作圖；采用QTLIciMapping 4.1軟件MET功能的ICIM-EPI方法完成多環(huán)境上位性QTL分析[33]，參數(shù)為Scan=5 cM、PIN=0.000 1，LOD值由1 000迭代計(jì)算獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 早熟性與產(chǎn)量性狀相關(guān)性

由表1可知，鈴重與早熟性狀之間主要表現(xiàn)為不顯著正相關(guān)(與第一果枝節(jié)位之間為不顯著負(fù)相關(guān))；衣分與全生育期、花鈴期之間表現(xiàn)為極顯著負(fù)相關(guān)，與株高、第一果枝節(jié)位高度之間表現(xiàn)為不顯著負(fù)相關(guān)，與開(kāi)花期、第一果枝節(jié)位之間表現(xiàn)為不顯著正相關(guān)。表明早熟性較好的材料，其鈴重較?。换ㄢ徠谠介L(zhǎng)衣分越低。

表1 早熟相關(guān)性狀與產(chǎn)量構(gòu)成因子之間相關(guān)系數(shù)Tab.1 Correlation coefficients between cotton earliness and yield traits

2.2 早熟性與纖維品質(zhì)相關(guān)性

纖維品質(zhì)性狀中，纖維長(zhǎng)度、比強(qiáng)度、整齊度、伸長(zhǎng)率與早熟性狀之間以正相關(guān)為主，其中整齊度與開(kāi)花期、株高、第一果枝節(jié)位、第一果枝節(jié)位高度之間相關(guān)性達(dá)到顯著或極顯著水平；馬克隆值與株高之間表現(xiàn)為正相關(guān)，與其他5個(gè)早熟相關(guān)性狀之間表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，其中與第一果枝節(jié)位高度之間的相關(guān)性達(dá)到顯著水平(表2)。表明早熟性較好的材料，纖維長(zhǎng)度較短、強(qiáng)度較弱、整齊度較低，綜合纖維品質(zhì)相對(duì)較差。

表2 早熟相關(guān)性狀與纖維品質(zhì)性狀之間相關(guān)系數(shù)Tab.2 Correlation coefficients between cotton earliness and fiber quality traits

2.3 產(chǎn)量與纖維品質(zhì)相關(guān)性

產(chǎn)量和纖維品質(zhì)是棉花最重要的經(jīng)濟(jì)性狀，由表3可知，鈴重與伸長(zhǎng)率、纖維長(zhǎng)度、比強(qiáng)度之間表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，與整齊度、馬克隆值之間表現(xiàn)為正相關(guān)，其中與比強(qiáng)度、整齊度的相關(guān)性達(dá)到顯著或極顯著水平；衣分與馬克隆值之間表現(xiàn)為正相關(guān)，與其他4個(gè)性狀之間表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，其中與馬克隆值、比強(qiáng)度之間的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平。表明纖維長(zhǎng)度較長(zhǎng)、比強(qiáng)度較強(qiáng)、馬克隆值較小的材料，鈴重較小、衣分較低。

表3 纖維品質(zhì)性狀與產(chǎn)量構(gòu)成因子之間相關(guān)系數(shù)Tab.3 Correlation coefficients between fiber quality and yield traits

2.4 早熟性、產(chǎn)量、纖維品質(zhì)加性QTL分布

前期通過(guò)RAD-seq(Restriction-site associated DNA sequencing)技術(shù)對(duì)親本及137個(gè)RILs進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序[33]，構(gòu)建了一張包含6 434個(gè)位點(diǎn)、總圖距為4 071.98 cM的高密度遺傳圖譜，標(biāo)記間平均遺傳距離僅為0.63 cM[24]，對(duì)早熟性、產(chǎn)量、纖維品質(zhì)相關(guān)的3類(lèi)性狀進(jìn)行QTL定位，獲得247個(gè)早熟相關(guān)QTL[24]、186個(gè)纖維品質(zhì)QTL[31]及61個(gè)產(chǎn)量相關(guān)QTL[30]，廣泛分布于26條染色體。根據(jù)QTL置信區(qū)間，將有重疊的QTL稱(chēng)為“QTL重疊區(qū)段”，共發(fā)現(xiàn)98個(gè)加性QTL重疊區(qū)段，其中56個(gè)區(qū)段內(nèi)QTL增效基因來(lái)源于不同的親本，另外42個(gè)區(qū)段的QTL增效基因來(lái)源于同一個(gè)親本。其中68個(gè)QTL重疊區(qū)段同時(shí)影響至少兩類(lèi)性狀(圖1)。有11個(gè)QTL重疊區(qū)段同時(shí)分布有早熟性、產(chǎn)量和纖維品質(zhì)相關(guān)的QTL，其中僅有3個(gè)區(qū)段內(nèi)QTL增效基因來(lái)源相同，8個(gè)區(qū)段內(nèi)QTL增效基因來(lái)源不同；有39個(gè)區(qū)段內(nèi)分布有早熟性和品質(zhì)相關(guān)QTL，其中11個(gè)區(qū)段內(nèi)QTL增效基因來(lái)源相同，28個(gè)區(qū)段內(nèi)QTL增效基因來(lái)源不同；有11個(gè)區(qū)段內(nèi)分布有早熟性和產(chǎn)量相關(guān)QTL，其中7個(gè)區(qū)段內(nèi)QTL增效基因來(lái)源相同，4個(gè)區(qū)段內(nèi)QTL增效基因來(lái)源不同；有7個(gè)區(qū)段內(nèi)分布有產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)的QTL，其中3個(gè)區(qū)段內(nèi)的QTL增效基因來(lái)源相同，4個(gè)區(qū)段內(nèi)QTL增效基因來(lái)源不同。說(shuō)明早熟性、產(chǎn)量和品質(zhì)三類(lèi)性狀的分子遺傳基礎(chǔ)之間存在廣泛的相互影響，同一位點(diǎn)具有明顯的一因多效作用，且對(duì)不同性狀的影響方向不同，導(dǎo)致性狀之間表現(xiàn)復(fù)雜的相關(guān)性。

本研究在D3染色體上發(fā)現(xiàn)1個(gè)與早熟性、產(chǎn)量、纖維品質(zhì)都相關(guān)的染色體區(qū)段，該區(qū)段共分布有24個(gè)QTL，且QTL增效基因均來(lái)自于父本G2005，最大貢獻(xiàn)率達(dá)到29.37%[24](圖2)。因此，該位點(diǎn)可作為深入挖掘棉花早熟性、產(chǎn)量、品質(zhì)相關(guān)基因的候選區(qū)域。

2.5 早熟性、產(chǎn)量、纖維品質(zhì)多環(huán)境上位性QTL分析

共檢測(cè)到99個(gè)早熟性、產(chǎn)量、纖維品質(zhì)相關(guān)性狀多環(huán)境上位性QTL位點(diǎn)，可解釋3.86%～9.80%表型變異。其中，45個(gè)位點(diǎn)與加性QTL位點(diǎn)重疊。因此，上位性作用也是影響早熟性、產(chǎn)量和纖維品質(zhì)相關(guān)性的重要分子遺傳因素。

3 結(jié)論與討論

3.1 鈴重、衣分適中的材料有利于協(xié)調(diào)早熟性與纖維品質(zhì)性狀

產(chǎn)量與纖維品質(zhì)是棉花最重要的2個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀，是獲得植棉收益的重要基礎(chǔ)，高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)棉花品種的選育成為育種工作的共同目標(biāo)。然而，產(chǎn)量與纖維品質(zhì)之間具有十分復(fù)雜的相互影響，同時(shí)實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)與優(yōu)質(zhì)存在較大困難。近年來(lái)，早熟棉被認(rèn)為是解決植棉地區(qū)糧棉爭(zhēng)地矛盾、減少地膜污染的有效突破口。因此，早熟棉新品種選育逐漸成為棉花育種家們的工作重點(diǎn)，而早熟性也成為基礎(chǔ)研究的重要目標(biāo)性狀。齊子杰[34]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)鈴性強(qiáng)、株鈴數(shù)多的材料，纖維品質(zhì)較好，但是鈴重、子指、衣分等性狀較差，單株鈴數(shù)和鈴重對(duì)產(chǎn)量影響較大；生育期、株高、第一果枝節(jié)位與鈴重、衣分之間以負(fù)相關(guān)為主。戴茂華等[35]研究發(fā)現(xiàn)，單株鈴數(shù)和衣分對(duì)產(chǎn)量影響較大。梁冰[9]研究發(fā)現(xiàn)，全生育期與鈴重、纖維長(zhǎng)度、比強(qiáng)度、整齊度之間為正相關(guān)，與衣分、伸長(zhǎng)率、馬克隆值之間為負(fù)相關(guān)，宿俊吉[10]也得到類(lèi)似結(jié)果。

本研究通過(guò)連續(xù)6 a調(diào)查重組自交系群體表型性狀，分析各性狀之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，棉花早熟性、產(chǎn)量、纖維品質(zhì)相關(guān)性狀之間既存在正向相關(guān)性，也存在負(fù)向相關(guān)性。鈴重與株高、第一果枝節(jié)位高度、全生育期、開(kāi)花期、花鈴期、整齊度、馬克隆值之間為正向相關(guān)性，與第一果枝節(jié)位、纖維長(zhǎng)度、纖維比強(qiáng)度、伸長(zhǎng)率之間為負(fù)向相關(guān)性；衣分與開(kāi)花期、第一果枝節(jié)位、馬克隆值之間為正向相關(guān)性，與全生育期、花鈴期、株高、第一果枝節(jié)位高度、纖維長(zhǎng)度、比強(qiáng)度、整齊度、伸長(zhǎng)率之間為負(fù)向相關(guān)性；纖維長(zhǎng)度、比強(qiáng)度、整齊度、伸長(zhǎng)率與早熟相關(guān)性狀之間為正相關(guān)，馬克隆值與早熟性狀之間為負(fù)相關(guān)。因此，鈴重大、衣分高的材料，早熟性較差、綜合纖維品質(zhì)較差；早熟性較好的材料，纖維品質(zhì)表現(xiàn)較差。品種選育過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)重視鈴重、衣分適中的材料，進(jìn)而協(xié)調(diào)早熟性與纖維品質(zhì)。

3.2 復(fù)雜的分子遺傳基礎(chǔ)是導(dǎo)致性狀間相互影響的原因之一

QTL定位是研究數(shù)量性狀的有效方法，為挖掘關(guān)鍵基因及有效分子標(biāo)記提供可靠依據(jù)。自1994年棉花的第一張遺傳圖譜公布[36]，研究人員開(kāi)始不斷挖掘棉花基因組信息，開(kāi)發(fā)出大量的AFLP、RAPD、SSR等棉花分子標(biāo)記，并構(gòu)建陸地棉種內(nèi)/種間遺傳圖譜[37]。基于這些圖譜及QTL定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)，棉花產(chǎn)量、纖維品質(zhì)、農(nóng)藝性狀、抗病性等相關(guān)的QTL廣泛分布于26條染色體，且有QTL簇及熱點(diǎn)區(qū)域[16，29]。但是，進(jìn)一步研究區(qū)段內(nèi)的基因信息則比較困難。

隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，以及陸地棉參考基因組序列的公布[38-39]，挖掘棉花重要性狀的基因及遺傳調(diào)控通路更加方便。Su等[23，40-42]利用SLAF-seq技術(shù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，挖掘355份陸地棉早熟性、產(chǎn)量、纖維品質(zhì)等性狀的關(guān)鍵基因。Sun等[43-44]同樣采用全基因組關(guān)聯(lián)分析方法，挖掘719份棉花材料產(chǎn)量及纖維品質(zhì)候選基因。Ma等[21]通過(guò)重測(cè)序技術(shù)挖掘419份陸地棉產(chǎn)量及纖維品質(zhì)性狀的關(guān)鍵基因。Zhang等[29]通過(guò)簡(jiǎn)化基因組測(cè)序、SNP芯片及SSR標(biāo)記，構(gòu)建了一張標(biāo)記密度高、圖譜質(zhì)量好的陸地棉重組自交系遺傳圖譜，并通過(guò)17個(gè)環(huán)境下解析纖維品質(zhì)和產(chǎn)量的相互關(guān)系及其相關(guān)QTL/基因，為進(jìn)一步明確纖維品質(zhì)和產(chǎn)量之間的遺傳機(jī)制、改良品種選育技術(shù)提供很好的研究基礎(chǔ)。因此，先進(jìn)的測(cè)序技術(shù)能夠直接將表型性狀與基因信息相關(guān)聯(lián)，為更加準(zhǔn)確的研究關(guān)鍵性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供便利條件。即便如此，多性狀之間的相互作用機(jī)理依然是基礎(chǔ)研究的難題。

本研究前期采用RAD-seq技術(shù)，以包含137個(gè)株系的重組自交系群體為材料，構(gòu)建了一張標(biāo)記間平均距離僅有0.63 cM的高密度遺傳圖譜，并對(duì)早熟性、產(chǎn)量、纖維品質(zhì)等性狀進(jìn)行QTL定位，共得到494個(gè)QTL位點(diǎn)。基于此，共發(fā)現(xiàn)有98個(gè)加性QTL重疊區(qū)段，其中56個(gè)區(qū)段內(nèi)QTL增效基因的來(lái)源不同，42個(gè)區(qū)段內(nèi)QTL增效基因來(lái)源相同，說(shuō)明同一區(qū)段內(nèi)的基因能夠同時(shí)影響不同性狀，但是對(duì)不同性狀的正負(fù)效應(yīng)可能不同，導(dǎo)致性狀之間的復(fù)雜的相互關(guān)系，一因多效作用顯著。此外，共發(fā)現(xiàn)99個(gè)多環(huán)境上位性QTL位點(diǎn)，并且多個(gè)位點(diǎn)與加性QTL重疊，說(shuō)明廣泛存在的上位性效應(yīng)也是導(dǎo)致性狀的復(fù)雜相關(guān)性的因素之一。

本研究在D3染色體上發(fā)現(xiàn)了同時(shí)與早熟性、產(chǎn)量、纖維品質(zhì)相關(guān)的染色體區(qū)段，區(qū)段內(nèi)QTL增效基因來(lái)源相同，且貢獻(xiàn)率高、穩(wěn)定性好，可作為研究多性狀同步改良的候選區(qū)段，進(jìn)行候選基因挖掘及功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)。