莫天宇,徐善斌,鄒德堂,王敬國(guó),劉化龍,孫 健,賈 琰,趙宏偉,鄭洪亮

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150030)

鹽脅迫會(huì)抑制植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成、降低光合效率、造成離子失衡以及高滲透脅迫、導(dǎo)致植株萎蔫和細(xì)胞凋亡[1],使作物大幅度減產(chǎn),已成為影響作物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因素。近年來(lái),伴隨灌溉方式不當(dāng)、過(guò)度施用化肥與工業(yè)污染等問(wèn)題的出現(xiàn),土壤鹽漬化程度不斷加重[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球已有約6%的土地遭受鹽害侵襲[3]。我國(guó)鹽漬土總面積約為0.36億hm2,占全國(guó)可利用土地總面積的4.88%,并以每年1%的速度增加[4]。

水稻(Oryzasativa)是世界上主要的糧食作物之一,全球有超過(guò)一半的人口以稻米為主食[5-6]。水稻是一種鹽敏感作物,在遭受鹽脅迫后會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量急劇下降[7]。因此,提高水稻耐鹽性,創(chuàng)制耐鹽性水稻種質(zhì)是水稻育種的一個(gè)重要目標(biāo)。近些年來(lái),水稻中已經(jīng)有很多鹽脅迫相關(guān)的基因被克隆,如OsDST、OsSOS1、OsHKT、OsWRKY13、OsSNAC1、OsMYB、OsNAC等[8-14]。OsEIL1和OsEIL2基因是擬南芥EIN3在水稻中的同源基因,二者均為轉(zhuǎn)錄因子[15]。Yang等[16]研究表明,OsEIL1基因突變會(huì)導(dǎo)致水稻根生長(zhǎng)對(duì)乙烯鈍感,OsEIL2基因突變后水稻胚芽鞘生長(zhǎng)對(duì)乙烯鈍感,此外,OsEIL1和OsEIL2基因會(huì)結(jié)合OsHKT2;1基因啟動(dòng)子的EBS(EIN3-bindingsites)區(qū)域,促進(jìn)OsHKT2;1基因的轉(zhuǎn)錄,OsEIL1和OsEIL2基因突變后會(huì)導(dǎo)致OsHKT2;1基因表達(dá)量下調(diào),從而減少鹽脅迫下根對(duì)鈉離子的吸收,進(jìn)而增強(qiáng)水稻的耐鹽性。

CRISPR/Cas9技術(shù)是繼ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)之后的第三代基因編輯技術(shù)[17-19]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由sgRNA(Single guide RNA)和Cas9(CRISPR associated protein 9)核酸酶2個(gè)部分構(gòu)成,其中,sgRNA是一個(gè)具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA,起識(shí)別靶序列和連接Cas9核酸酶的作用,Cas9是一種限制性核酸內(nèi)切酶,具有RuvC和HNH 2個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域,分別起到切割DNA正反雙鏈的作用。Cas9核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)被稱為PAM(Protospacer adjacent motif),序列為NGG,Cas9在識(shí)別到PAM位點(diǎn)之后會(huì)在其上游第3或第4個(gè)堿基處造成DNA雙鏈斷裂[20],DNA雙鏈斷裂后會(huì)觸發(fā)生物體的同源重組(HDR,Homologous direct recombination)修復(fù)和非同源末端連接修復(fù)(NHEJ,Nonhomologous end joining),其中,同源重組修復(fù)會(huì)導(dǎo)致堿基的插入或替換,非同源末端連接修復(fù)會(huì)導(dǎo)致堿基的插入或缺失,從而達(dá)到基因敲除的目的[21]。

目前,CRIPSR/Cas9技術(shù)已經(jīng)在多種作物中進(jìn)行應(yīng)用,如水稻[22-23]、小麥[24-25]、大豆[26-27]、玉米[28-29]、高粱[30]等。在水稻中,Wang等[31]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻3個(gè)減數(shù)分裂相關(guān)基因:OsREC8、OsPAIR1、OsOSD1和一個(gè)單倍體誘導(dǎo)基因OsMTL進(jìn)行敲除并獲得了水稻無(wú)性繁殖的后代,實(shí)現(xiàn)了雜交水稻F1雜合性狀的固定。Tang等[32]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除水稻中鎘離子運(yùn)輸基因OsNramp5降低了水稻鎘離子含量。Zhang等[33]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除水稻OsRR22基因獲得了耐鹽性增強(qiáng)的水稻突變體。

本研究以粳稻品種東農(nóng)427為研究材料,利用CRISPR/Cas9技術(shù)同時(shí)對(duì)耐鹽負(fù)調(diào)控基因OsEIL1和OsEIL2進(jìn)行敲除以期獲得耐鹽性提高的水稻突變體材料,為粳稻耐鹽性種質(zhì)資源改良提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以粳稻品種東農(nóng)427為試驗(yàn)材料,試驗(yàn)所用菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)Mach1-T1和農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)感受態(tài)EHA105均購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司,PrimerStarGXL、BsaⅠ核酸內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司,T4DNA ligase 購(gòu)自寶生物(大連)有限公司。試驗(yàn)所用載體pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA和pYLCRISPR/Cas9-MTmono雙元載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士惠贈(zèng)。

1.2 敲除靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

靶點(diǎn)設(shè)計(jì):在RAP(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)數(shù)據(jù)庫(kù)下載OsEIL1(Os03g0324300)和OsEIL2(Os07g0685700)基因序列,序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)OsEIL1和OsEIL2的CDS序列存在較高的相似度,因此,利用CRISPR-GE在線工具包(http://skl.scau.edu.cn)[34]在OsEIL1和OsEIL2基因靠近5′端的高度同源區(qū)域設(shè)計(jì)一個(gè)敲除靶點(diǎn),保存接頭引物序列。本研究中使用的所有引物均由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

參照Ma等[35]的試驗(yàn)方法進(jìn)行載體構(gòu)建。

接頭制備:將合成好的接頭引物原液(100 μmoL/L)各取1 μL混合,加98 μL 0.5×TE Buffer稀釋至1 μmoL/L,90 ℃ 30 s后移至室溫冷卻退火,進(jìn)行連接頭反應(yīng)。

gRNA表達(dá)盒制備:利用酶切法將退火后的雙鏈接頭連接到pYL-U3-gRNA載體上,反應(yīng)體系(10 μL):pYL-U3-gRNA 1 μL,退火后的接頭產(chǎn)物1 μL,10×DNA ligase Buffer 1 μL,BsaⅠ限制性內(nèi)切酶(10 000 U/mL)0.5 μL,T4連接酶(400 000 U/mL) 0.1 μL,ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序:37 ℃ 5 min,20 ℃ 5 min,共5個(gè)循環(huán)。取1.5 μL反應(yīng)產(chǎn)物作為PCR模板,用上游引物U-F和下游引物gRNA-R進(jìn)行一輪PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系(10 μL):連接頭產(chǎn)物1.5 μL,5×PS Buffer 2 μL,U-F/gRNA-R引物(10 μmol/L)各0.2 μL,dNTP(2 mmol/L) 0.6 μL,PrimeStarGXL 0.1 μL, ddH2O 5.4 μL。反應(yīng)程序:98 ℃ 預(yù)變性2 min;98 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s 共25個(gè)循環(huán)。將1輪PCR產(chǎn)物稀釋20倍后取1 μL為模板,用B1′和BL引物進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(20 μL):稀釋后的一輪PCR產(chǎn)物1 μL,5×PS Buffer 2 μL dNTP(2 mmol/L) 1 μL,B1′/BL引物(10 μmol/L)各0.3 μL,PrimeStarGXL 0.2 μL,ddH2O 12.2 μL。反應(yīng)程序:98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 30 s 共25個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,切膠回收g-RNA表達(dá)盒。

CRISPR/Cas9表達(dá)載體構(gòu)建:將二輪PCR膠回收產(chǎn)物克隆到pYL-CRISPR/Cas9-MTmono載體,反應(yīng)體系(15 μL):二輪PCR膠回收產(chǎn)物2.5 μL,pYL-CRISPR/Cas9-MTmono質(zhì)粒0.6 μL,BsaⅠ核酸內(nèi)切酶1 μL,10×cutsmart Buffer 1.5 μL,ddH2O 8.8 μL,PCR反應(yīng)37 ℃ 15 min后暫停程序,加入T4Ligase Buffer 1.5 μL,T4Ligase 0.1 μL,PCR反應(yīng) 37 ℃ 5 min,10 ℃ 5 min,20 ℃ 5 min，共15個(gè)循環(huán)。

表1 本研究中使用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.3 質(zhì)粒擴(kuò)繁及陽(yáng)性克隆篩選

將連接產(chǎn)物通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化至Mach1-T1感受態(tài)大腸桿菌中,在含有卡那霉素(50 mg/L)的LB培養(yǎng)基上涂板培養(yǎng),挑取單菌落,用NOS-F和T1-R引物進(jìn)行PCR檢測(cè)陽(yáng)性菌落,陽(yáng)性菌落接種于含有卡那霉素(50 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃,160 r/min過(guò)夜搖菌,用康為世紀(jì)公司(北京)的高純度小量質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒。抽提好的質(zhì)粒用AscⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切檢測(cè),將酶切檢測(cè)正確的質(zhì)粒通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入到EHA105感受態(tài)農(nóng)桿菌中。

1.4 T0植株獲得及突變情況、潛在脫靶效應(yīng)檢測(cè)

用攜帶載體的農(nóng)桿菌侵染水稻品種東農(nóng)427的愈傷組織,潮霉素篩選出陽(yáng)性愈傷組織并分化成T0植株。采用CTAB法[36]提取T0植株全基因組DNA,以潮霉素基因特異性引物Hyg-F和Hyg-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè)陽(yáng)性植株。設(shè)計(jì)引物OsEIL1-T1-F/R和OsEIL2-T1-F/R擴(kuò)增OsEIL1和OsEIL2基因靶點(diǎn)及其附近的序列,對(duì)所有轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株進(jìn)行分析,PCR產(chǎn)物送至擎科生物技術(shù)有限公司(北京)進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果使用兼并序列解碼(DSDecode)方法進(jìn)行分析[37]。

利用CRISPR-GE在線工具包預(yù)測(cè)潛在脫靶位點(diǎn),選擇分值最高的5個(gè)位點(diǎn)作為潛在脫靶位點(diǎn),利用PCR擴(kuò)增測(cè)序分析所有T0突變植株的脫靶效應(yīng)。

1.5 T1純合突變植株及無(wú)T-DNA元件植株的篩選

在田間選取T1植株50株掛牌,取葉片提取全基因組DNA,利用OsEIL1-T1-F/R和OsEIL2-T1-F/R引物PCR測(cè)序,篩選出純合雙基因純合突變的植株,再利用Hyg-F和Hyg-R引物在純合的植株中篩選無(wú)T-DNA元件插入的植株,將這些植株自交繁殖至T2。

1.6 T2植株鹽脅迫鑒定

取野生型種子與突變體種子于28 ℃浸種萌發(fā)3 d后加入Hoagland營(yíng)養(yǎng)液,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為26 ℃,設(shè)置光周期為16 h光照(3 000 lx)8 h黑暗。幼苗培養(yǎng)28 d后加入200 mmol/L的NaCl溶液進(jìn)行鹽處理,同時(shí)設(shè)置對(duì)照,處理5 d后分別測(cè)量突變植株和野生型植株的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量,并收取處理?xiàng)l件下突變植株和野生型植株的地上部分和地下部分,利用火焰光度法[38]測(cè)量Na+、K+離子含量。將鹽處理后的植株換成營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行恢復(fù)處理,7 d后觀察處理前后野生型幼苗和突變體幼苗的長(zhǎng)勢(shì),統(tǒng)計(jì)幼苗存活率。

1.7 T2植株農(nóng)藝性狀考察

在大田環(huán)境下種植東農(nóng)427野生型和T2無(wú)T-DNA元件插入的純合突變體材料,成熟時(shí)期測(cè)量株高、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻OsEIL1和OsEIL2敲除靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

根據(jù)水稻OsEIL1和OsEIL2基因序列比對(duì)結(jié)果(圖1),在兩基因高相似度區(qū)域設(shè)計(jì)1個(gè)敲除位點(diǎn)(圖2),利用單個(gè)sgRNA同時(shí)敲除2個(gè)基因,將構(gòu)建好的載體命名為pYLCRISPR/Cas9-OsEIL1-OsEIL2,載體圖譜如圖3所示。

2.2 T0轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗檢測(cè)及突變情況、脫靶情況的分析

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將基因編輯載體轉(zhuǎn)入到受體材料東農(nóng)427中,在T0共獲得30株再生植株,用載體特異性引物Hyg-F/R進(jìn)行PCR檢測(cè),篩選陽(yáng)性植株,結(jié)果表明,30株再生植株中有25株為陽(yáng)性苗,陽(yáng)性率為83.3%(圖4)。

利用特異性引物OsEIL1-T1-F/R和OsEIL2-T1-F/R擴(kuò)增25株陽(yáng)性植株的靶點(diǎn)區(qū)域序列并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明,25株陽(yáng)性植株中有5株(eil1-eil2-9、eil1-eil2-12、eil1-eil2-13、eil1-eil2-16、eil1-eil2-25)發(fā)生了突變(圖5),突變率為20.0%,其中,OsEIL1基因突變植株有5株,1株為雙等位突變,4株為雜合突變,OsEIL2基因突變植株有1株,突變類型為純合突變(表2),eil1-eil2-9植株為OsEIL1和OsEIL2基因同時(shí)發(fā)生突變。對(duì)5株T0突變植株的潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行了分析,測(cè)序結(jié)果表明,5株T0突變植株均未發(fā)生脫靶效應(yīng)(表3)

表2 T0轉(zhuǎn)基因植株突變檢測(cè)Tab.2 Mutation detection of T0 plants

2.3 無(wú)T-DNA元件的雙基因純合突變植株的篩選

將雙基因突變植株eil1-eil2-9自交繁殖獲得T1種子,將T1種子種成株行,隨機(jī)挑選50株掛牌提取全基因組DNA,利用OsEIL1-T1-F/R和OsEIL2-T1-F/R篩選出雙基因純合突變植株16株,其中,OsEIL1和OsEIL2基因的突變方式均為單堿基插入,OsEIL1基因起始密碼子(ATG)后第372和第373個(gè)堿基之間插入“A”導(dǎo)致該蛋白在第278個(gè)氨基酸處翻譯提前終止,OsEIL2基因起始密碼子(ATG)后第384和第385個(gè)堿基之間插入“T”導(dǎo)致該蛋白在第535個(gè)氨基酸處翻譯提前終止。進(jìn)一步利用Hyg-F/R引物在16株純合突變植株中篩選出4株無(wú)T-DNA元件插入的植株,留種,自交加代,獲得T2突變株系,將該株系命名為eil1-eil2HM(圖6,7)。

2.4 T2植株耐鹽性鑒定

將eil1-eil2HM突變株系進(jìn)行苗期鹽處理,處理前,突變體與野生型植株的長(zhǎng)勢(shì)、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量與野生型差異不大。用含有200 mmol/L NaCl的營(yíng)養(yǎng)液處理5 d后,野生型植株的長(zhǎng)勢(shì)受到了明顯的抑制,而突變體植株的長(zhǎng)勢(shì)受到部分抑制,大部分植株仍繼續(xù)存活(圖8-A)。在鮮質(zhì)量和干質(zhì)量方面,鹽處理后突變體植株的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均顯著高于野生型植株(圖8-B,C);在Na+離子含量方面,突變體植株的地上部及地下部Na+含量均顯著低于野生型植株(圖8-D);在K+離子含量方面,突變體植株地上部及地下部鉀離子含量均與野生型植株差異不顯著(圖8-E);在換成正常營(yíng)養(yǎng)液恢復(fù)7 d后,野生型植株基本全部死亡,存活率為8.3%,而突變體植株仍有大部分存活,存活率為75.0%(圖8-F)。

2.5 T2植株農(nóng)藝性狀考察

在成熟期對(duì)野生型和突變體植株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查,結(jié)果表明,野生型植株與突變體植株在株高、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒質(zhì)量上無(wú)顯著差異(圖9-A-F)

3 結(jié)論與討論

CRISPR/Cas9被稱為繼ZFN和TALEN之后的第3代基因編輯技術(shù),因其具有構(gòu)建簡(jiǎn)單、高效定點(diǎn)編輯等優(yōu)勢(shì)而廣泛應(yīng)用于作物種質(zhì)改良,與傳統(tǒng)育種相比,CRISPR/Cas9系統(tǒng)可高效快速定點(diǎn)編輯目標(biāo)基因,改良受體材料的性狀,通過(guò)自交,在T1或T2即可獲得純合突變且不含T-DNA元件插入的突變株系,極大地縮短了水稻育種的周期。

本研究以耐鹽負(fù)調(diào)控基因OsEIL1和OsEIL2為目標(biāo)基因,通過(guò)序列比對(duì)的方式,在OsEIL1和OsEIL2高相似度區(qū)域設(shè)計(jì)一個(gè)sgRNA同時(shí)對(duì)這2個(gè)基因進(jìn)行敲除。在T025株轉(zhuǎn)基因苗中獲得了5株突變植株(突變率為20.0%),該頻率顯著低于前人的研究結(jié)果[35, 39],推測(cè)可能與本研究所用的受體材料和sgRNA序列位點(diǎn)有關(guān)。有研究表明,CRISPR/Cas9系統(tǒng)在動(dòng)物或植物中均可能發(fā)生脫靶效應(yīng)[40-41],選擇了5個(gè)與sgRNA序列最相近的位點(diǎn)作為潛在脫靶位點(diǎn),并對(duì)T0的5株突變植株進(jìn)行PCR測(cè)序,結(jié)果表明，5株突變植株均未發(fā)生脫靶效應(yīng)。將T0雙基因突變的植株進(jìn)行自交,在T1篩選出純合突變,且不含T-DNA元件插入的植株。純合突變植株的OsEIL1和OsEIL2基因的突變類型均為單堿基插入,OsEIL1基因?yàn)椤癆”堿基插入,OsEIL2基因?yàn)閴A基“T”插入。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,OsEIL1和OsEIL2基因單堿基插入后均引起了移碼突變,導(dǎo)致翻譯提前終止進(jìn)而引起該蛋白不能發(fā)揮正常的生物學(xué)功能,由此可導(dǎo)致OsHKT2;1基因表達(dá)量下調(diào),從而減少鹽脅迫下根對(duì)鈉離子的吸收,進(jìn)而增強(qiáng)水稻的耐鹽性。

將T2純合突變株系進(jìn)行苗期耐鹽性鑒定及農(nóng)藝性狀調(diào)查,結(jié)果表明,OsEIL1和OsEIL2基因突變后,植株對(duì)Na+的吸收減弱,從而減輕了Na+毒害,最終提高了水稻的耐鹽性。在成熟期對(duì)野生型植株和突變體植株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行考察,OsEIL1和OsEIL2基因突變后植株的株高、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒質(zhì)量均未發(fā)生顯著變化,說(shuō)明OsEIL1和OsEIL2基因突變并未對(duì)植株的主要農(nóng)藝性狀造成影響。

綜上所述,本研究以粳稻品種東農(nóng)427為材料,通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)OsEIL1和OsEIL2基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除并獲得了雙基因純合突變且不含T-DNA元件的突變體材料,突變體材料的耐鹽性明顯提升且主要農(nóng)藝性狀未受到影響。該結(jié)果為耐鹽水稻品種的培育提供了理論和材料基礎(chǔ)。