銅綠假單胞菌是醫(yī)院獲得性感染的重要機(jī)會(huì)病原菌之一，常引起囊性纖維化住院病人的慢性肺部感染。由于銅綠假單胞菌具有固有耐藥和獲得性耐藥的特性，治療該菌引起的感染可供選擇的抗生素種類非常有限。碳青霉烯類抗菌藥物由于具有較高的青霉素結(jié)合蛋白親和能力、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性及細(xì)菌外膜滲透性，對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌引起的嚴(yán)重感染具有良好的治療效果。然而，抗菌藥物的廣泛及不合理使用造成耐碳青霉烯銅綠假單胞菌在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)不斷升高的趨勢(shì)，這給臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。

根據(jù)全國細(xì)菌耐藥檢測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，近年來肺炎克雷伯氏菌和鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率持續(xù)升高，而銅綠假單胞菌的耐藥性卻有明顯下降的趨勢(shì)。目前國內(nèi)外雖已有大量文獻(xiàn)研究銅綠假單胞菌的耐藥性和耐藥機(jī)制，然而關(guān)于時(shí)間跨度較長的調(diào)查研究卻尚少有報(bào)道。銅綠假單胞菌作為呼吸道感染病人的最常見病原菌，分離率僅次于鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯氏菌，本研究擬對(duì)2007—2008年間和2017—2018年間成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸科臨床分離的銅綠假單胞菌進(jìn)行調(diào)查研究，比較分析10年間菌株的耐藥性和分子流行病學(xué)變化，為臨床合理選擇抗菌藥物及控制銅綠假單胞菌感染提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

美洛培南（批號(hào)130506-202004）、頭孢哌酮（批號(hào)130420-201105）、哌拉西林（批號(hào)130419-202008）、頭孢他啶（批號(hào)130484-201806）、慶大霉素（批號(hào)130326-201716）、左氧氟沙星（批號(hào)130455-201607）、環(huán)丙沙星（批號(hào)130451-201904）、妥布霉素（批號(hào)130527-200402）、阿米卡星（批號(hào)130335-200204）和氨曲南（批號(hào)130507-201303）購自中國食品藥品檢定研究院、亞胺培南（批號(hào)MB1457-S）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司、MH瓊脂（貨號(hào)CM901）購自北京陸橋技術(shù)有限公司、LB培養(yǎng)基（貨號(hào)L8291）購自北京索萊寶科技有限公司、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（貨號(hào)DP302）和DNA marker（貨號(hào)MD114）購自北京天根生化科技有限公司、2×Es Taq MasterMix（貨號(hào)CW0690S）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司、引物合成和測(cè)序由上海生工生物公司完成；MIP-P型細(xì)菌多點(diǎn)接種儀（日本佐久間公司）、CFX96型PCR擴(kuò)增儀、PowerPac型電泳儀和Gel DocXR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 菌株分離及鑒定

收集2007—2008年間和2017—2018年間成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸科住院病人臨床送檢標(biāo)本分離出的銅綠假單胞菌。醫(yī)院感染的判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）關(guān)于醫(yī)療保健相關(guān)感染的定義和特定類型感染的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。納入標(biāo)準(zhǔn)為病人住院時(shí)間＞48 h，同一個(gè)病人僅僅收集1株銅綠假單胞菌；排除標(biāo)準(zhǔn)為沒有任何感染癥狀的銅綠假單胞菌感染病人。分離培養(yǎng)出的菌株采用生化分析、Vitek系統(tǒng)和16S rRNA測(cè)序進(jìn)行鑒定。

1.3 最低抑菌濃度測(cè)定

采用瓊脂平板倍比稀釋法測(cè)定銅綠假單胞菌對(duì)抗生素的敏感程度。細(xì)菌接種在LB平板上，然后倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h?？股厥褂脺缇纳睇}水倍比稀釋后加入到空培養(yǎng)皿中，然后將MH瓊脂加入到培養(yǎng)皿緩慢搖勻，使其抗生素的終濃度達(dá)到0.5～256.0μg/mL。銅綠假單胞菌在滅菌的鹽水管中稀釋到0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬缓笥媒臃N儀點(diǎn)種在含不同濃度抗生素的MH瓊脂平板上，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～20 h后讀取結(jié)果。

1.4 多位點(diǎn)序列分型（Multilocus Sequence Typing，MLST）

采用MLST技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行基因分型。參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)和合成銅綠假單胞菌的7個(gè)管家基因的引物序列。使用天根公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)銅綠假單胞菌的DNA進(jìn)行提取純化。50μL PCR反應(yīng)體系成分為：25μL 2×Es Taq Mastermix，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL DNA模板，22μL ddHO。PCR反應(yīng)條件：最初96℃預(yù)變性1 min；然后96℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，重復(fù)此循環(huán)30次；最后再72℃延伸10 min。擴(kuò)增完成后，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳驗(yàn)證和膠回收純化后送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定。管家基因的DNA序列在銅綠假單胞菌的MLST數(shù)據(jù)庫（https：//pubmlst.org/paeruginosa/）上進(jìn)行比對(duì)從而獲得等位基因和序列型（Sequence Type，ST）。然后通過eBURST軟件將得到的所有ST基因型進(jìn)行聚類分析，其中具有5個(gè)或5個(gè)以上相同等位基因的ST即為同一個(gè)克隆復(fù)合體（Clonal Complex，CC）。

1.5 碳青霉烯酶耐藥基因分析

采用PCR擴(kuò)增耐碳青霉烯類抗生素的銅綠假單胞菌是否攜帶碳青霉烯酶耐藥基因，其引物序列如表1所示。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：首先94℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性30 s，52～56℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)此循環(huán)30次；最后再72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增完成后，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行證實(shí)，將電泳結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得耐藥基因類型。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)資料進(jìn)行分析。2007—2008年和2017—2018年銅綠假單胞菌對(duì)抗生素的耐藥性差異采用

χ

檢驗(yàn)，其中以

P

＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離鑒定和藥敏結(jié)果

2007—2008年間共從3 028例住院病人臨床標(biāo)本中分離出134株銅綠假單胞菌，檢出率為4.4%；2017—2018年間共從4 276例住院病人臨床標(biāo)本中分離出85株銅綠假單胞菌，檢出率為2.0%。

表1 銅綠假單胞菌碳青霉烯酶耐藥基因擴(kuò)增引物序列

10年間銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性變化如表2所示。2007—2008年間銅綠假單胞菌對(duì)幾乎所有抗菌藥物的耐藥率均＞55%（阿米卡星除外）。2017—2018年間銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率則均＜30%。此外，2007—2008年間菌株的耐藥性高于2017—2018年間菌株的耐藥性（

P

＜0.001）。

2.2 MLST分型

10年間銅綠假單胞菌的MLST基因型差異如表3所示。2007—2008年間，134株銅綠假單胞菌共分為15個(gè)ST型，其中ST235和ST111是最流行的基因型，分別占33.6%（45）和20.1%（27）。此外，ST244、ST298、ST175、ST357和ST316基因型分布也較為普遍，分別占11.2%（15）、7.5%（10）、6.0%（8）、5.2%（7）和3.7%（5）。2017—2018年間，85株銅綠假單胞菌共分為9個(gè)ST型，其中以ST235、ST175、ST244、ST111和ST308基因型為主，分別占38.8%（33）、22.4%（19）、11.8%（10）、9.4%（8）和7.1%（6）。

表2 10年間銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性變化/%（株）

利用eBURST軟件將所有獲得的ST型與數(shù)據(jù)庫中已知存在的ST比較分析顯示，本研究中ST235、ST1162、ST227和ST85型共86株菌屬于CC235，其中ST235是該復(fù)合體的根，ST1162、ST227和ST85均由ST235型進(jìn)化而來（圖1A）。ST244、ST17和ST111型共62株菌屬于CC274，其中ST274是該復(fù)合體的根，ST244、ST17和ST111型均由ST274型進(jìn)化而來（圖1B）。

2.3 碳青霉烯酶基因分析

2007—2008年間共有78株耐碳青霉烯銅綠假單胞菌，通過PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶耐藥基因并測(cè)序，有14株攜帶金屬β-內(nèi)酰胺酶基因IMP-4，5株攜帶金屬β-內(nèi)酰胺酶基因VIM-2。然而，2017—2018年間共有12株耐碳青霉烯銅綠假單胞菌，其中僅有2株攜帶IMP-4基因，其它耐藥基因均擴(kuò)增陰性（圖2，3）。

3 討論

圖2 耐碳青霉烯銅綠假單胞菌78株P(guān)CR擴(kuò)增后金屬β-內(nèi)酰胺酶基因IMP陽性產(chǎn)物電泳圖

表3 2007—2008年間和2017—2018年間銅綠假單胞菌多位點(diǎn)序列分型結(jié)果比較/%（株）

圖3 耐碳青霉烯銅綠假單胞菌78株P(guān)CR擴(kuò)增后金屬β-內(nèi)酰胺酶基因VIM陽性產(chǎn)物電泳圖

臨床上50%～70%的呼吸道感染均由銅綠假單胞菌引起。呼吸道銅綠假單胞菌感染是病人慢性阻塞性肺疾病和呼吸衰竭的主要原因，可引起較高的發(fā)病率和死亡率。在本研究中，近兩年銅綠假單胞菌的檢出率明顯下降，這可能與該院嚴(yán)格執(zhí)行抗生素管理和感染控制措施得當(dāng)有很大關(guān)系。此外，與全國細(xì)菌耐藥檢測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)一致，該院呼吸科銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率同樣具有明顯下降的趨勢(shì)，可能與以下原因有關(guān)：（1）該院自2011年開始應(yīng)衛(wèi)生部要求開展抗菌藥物臨床應(yīng)用專項(xiàng)整治活動(dòng)，規(guī)范了抗生素的使用，使得抗生素使用率和使用強(qiáng)度均有所降低，抗生素產(chǎn)生的選擇性壓力降低；（2）外源耐藥基因的獲得也是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的一個(gè)重要因素，很多耐藥基因都位于質(zhì)粒上，可以在菌株之間快速傳播，然而銅綠假單胞菌獲得耐藥基因的能力比鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯氏菌弱。除此之外，還有很多因素影響細(xì)菌的耐藥性，如產(chǎn)生抗生素滅活酶或鈍化酶、藥物作用靶位改變、外膜通透性下降及形成生物膜等，其耐藥性下降的具體原因還有待進(jìn)一步研究。近兩年該院呼吸科銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類和氨基糖苷類藥物敏感性最高。氨基糖苷類藥物因其毒副作用比較大，臨床應(yīng)用較少，因此碳青霉烯類藥物仍是臨床治療該菌感染的首選藥物。

MLST是通過對(duì)管家基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)，分析菌株的基因型差異，因具有操作簡(jiǎn)便、分辨率高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，目前是一種比較常用的細(xì)菌基因分型方法。本研究MLST結(jié)果顯示該院呼吸科最流行的基因型為ST235、ST111、ST175和ST244，聚類分析顯示大部分菌株屬于CC235和CC274，這與國內(nèi)外流行的基因型具有相似性，但也存在地域特點(diǎn)，提示我們?cè)谶M(jìn)行感染控制及抗菌藥物治療中應(yīng)該更多地參考本地域內(nèi)的流行特點(diǎn)。雖然研究中兩個(gè)時(shí)間段流行的基因型比例有所變化，但流行的基因類型變化不大，提示該院呼吸科具有穩(wěn)定的MLST基因型譜，菌株具有長期穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)。

碳青霉烯酶特別是金屬β-內(nèi)酰胺酶（metallo-βlactamase，MBL）的產(chǎn)生是銅綠假單胞菌的一個(gè)重要耐藥機(jī)制。MBLs能夠水解碳青霉烯類和其他β-內(nèi)酰胺類抗生素，但不能被酶抑制劑如克拉維酸或他唑巴坦所抑制。IMP和VIM型金屬酶是目前銅綠假單胞菌最普遍、分布比較多的基因類型，也是出現(xiàn)最早的兩種酶，隨后其他金屬β-內(nèi)酰胺酶如SPM-，GIM-，SIM-，KHM-，NDM-，AIM-，DIM-等相繼出現(xiàn)。在本研究中，2007—2008年間分別有14株和5株耐碳青霉烯銅綠假單胞菌攜帶IMP-4和VIM-2基因，陽性率為17.9%和6.4%。而2017—2018年間只有2株菌（16.7%）攜帶IMP-4基因，未發(fā)現(xiàn)其他耐藥基因。近兩年菌株攜帶耐藥基因較少可能與其對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥率降低有關(guān)。本研究碳青霉烯耐藥基因陽性率低于其他國內(nèi)外研究報(bào)道，說明在該院呼吸科銅綠假單胞菌的耐藥作用機(jī)制中，OprD2缺失或外排泵高表達(dá)或AmpC高表達(dá)導(dǎo)致的碳青霉烯類耐藥具有較高的比例，可能在銅綠假單胞菌耐碳青霉類抗菌藥物中起到重要作用，然而具體的耐藥機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。