口腔鱗癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，約占頜面部惡性腫瘤的90%。近年來(lái)，隨著以手術(shù)為主，放化療為輔等綜合療法的應(yīng)用，口腔鱗癌的臨床療效逐漸改善，但中晚期口腔鱗癌病人的5年生存率仍然較低。因此，充分了解口腔鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的分子機(jī)制，尋找新的診療方法，對(duì)改善病人預(yù)后，提高病人5年生存率意義重大。微小RNAs（miRNAs）是一類由18～22個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA分子。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、分化和自噬等多種生物學(xué)過(guò)程中作用顯著，其表達(dá)異常參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。吳巖等研究發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌病人口腔黏膜組織中的miR-590表達(dá)水平顯著上調(diào)，其可能參與了口腔粘膜細(xì)胞癌變的過(guò)程。但目前miR-590對(duì)口腔鱗癌生物行為的影響及其機(jī)制還不清楚。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)miR-590在口腔鱗癌組織中的表達(dá)水平，初步探討其對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和可能機(jī)制，以期為口腔鱗癌提供有效診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

52例口腔鱗癌組織樣本取自2014年1月至2017年1月于菏澤市牡丹人民醫(yī)院口腔科住院病人，將手術(shù)切除獲得口腔鱗癌組織及距離腫瘤邊緣2 cm的癌旁組織標(biāo)本，腫瘤組織經(jīng)病理鑒定為口腔鱗癌，癌旁組織標(biāo)本經(jīng)病理鑒定為正常組織。其中男性35例，女性17例；年齡40～75歲，中位年齡為61歲；舌癌30例，口底癌8例，牙齦癌11例，頰癌3例。所有病人術(shù)前均未接受化療和放射治療。所有病人或其近親屬均知情同意。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。Tca-8113細(xì)胞購(gòu)于上海斯信生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清為hyclone公司產(chǎn)品；PCR引物，miRNA抑制物陰性對(duì)照（anti-miR-NC）、miR-590抑制物（anti-miR-590）、pcDNA3.1、大腫瘤抑制基因1（LATS1）過(guò)表達(dá)載體（pcDNA3.1-LATS1）、小干擾RNA陰性對(duì)照（si-NC）、LATS1小干擾RNA（si-LATS1）以及LATS1野生型熒光素酶報(bào)告載體（WTLATS1）和LATS1突變型熒光素酶報(bào)告載體（MUTLATS1）的構(gòu)建測(cè)序等均有北京華大基因公司提供；四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、購(gòu)自北京索萊寶公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Lipofectamine2000和Trizol試劑，鼠源LATS1、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、P21、上皮鈣黏素（E-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體以及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠Ⅱ抗IgG均購(gòu)自Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組

Tca-8113細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基（含有10%的胎牛血清和1%的青鏈霉素雙抗）放入37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融匯至80%時(shí)，胰酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)期Tca-8113細(xì)胞接種于6孔板，利用Lipofectamine2000將anti-miR-NC、anti-miR-590、pcDNA3.1和pcDNA3.1-LATS1分別轉(zhuǎn)染至融匯至60%的Tca-8113細(xì)胞，依次標(biāo)記為anti-miR-NC組、antimiR-590組、pcDNA3.1組和pcDNA3.1-LATS1組，培養(yǎng)24～72 h后進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。為證實(shí)miR-590是通過(guò)調(diào)控LATS1表達(dá)參與對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的調(diào)控，將si-NC或si-LATS1分別與antimiR-590共轉(zhuǎn)染至Tca-8113細(xì)胞，依次標(biāo)記為antimiR-590+si-NC組和anti-miR-590+si-LATS1，檢測(cè)抑制LATS1表達(dá)能否逆轉(zhuǎn)anti-miR-590對(duì)Tca-8113細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)

利用Trizol法分別提取52例口腔鱗癌組織和與其對(duì)應(yīng)的癌旁組織及各組Tca-8113細(xì)胞的總RNA，測(cè)定其濃度后，取1μg的RNA樣本利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。以U6為內(nèi)源性參照，用2法計(jì)算miR-590的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

各組取2×10個(gè)Tca-8113細(xì)胞接種96孔板，在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)各取出一板細(xì)胞，每孔加入MTT溶液20μL。再孵育4 h，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）溶液150μL。在微量振蕩振蕩10 min直至結(jié)晶完全溶解。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度以表示細(xì)胞活力。

1.5 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力

遷移實(shí)驗(yàn)：用適量RPMI-1640培養(yǎng)液（不含有胎牛血清）重懸細(xì)胞。取600μL含10%胎牛血清培養(yǎng)液加入Transwell下室，取300μL的細(xì)胞懸液（約含有5×10個(gè)細(xì)胞）加入上室。常規(guī)培養(yǎng)24 h，用棉簽擦去上室膜附著細(xì)胞，甲醇固定下室膜附著細(xì)胞，結(jié)晶紫染液染色。將小室倒置于顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)，取均值為遷移數(shù)目。

侵襲實(shí)驗(yàn)：按照1∶8比例配置Matrigel膠工作液，取50μL加入Transwell小室，室溫放置30 min使Matrigel聚合成膠備用。其他步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

生物信息軟件預(yù)測(cè)miR-590與LATS1的3"非翻譯區(qū)（UTR）存在互補(bǔ)序列。構(gòu)建含有miR-590結(jié)合序列的LATS1-3"UTR的野生型（WT）-LATS1和突變型（MUT）熒光素酶報(bào)告載體WT-LATS1、MUT-LATS1。在Tca-8113細(xì)胞中利用Lipofectamine2000分別將WT/MUT-LATS1與miR-590 mimics和miR-NC共轉(zhuǎn)染，裂解轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組Tca-8113細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)

RIPA裂解法獲得各組Tca-8113細(xì)胞總蛋白，BCA法定量。取30μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳，隨后將分離的細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，在室溫條件用Western封閉液孵育30 min，棄去封閉液，用Western洗滌液洗膜10 min，重復(fù)3次，然后用已稀釋的抗LATS1、GAPDH、CyclinD1、P21、Ecadherin和MMP-2蛋白的Ⅰ抗，室溫條件孵育2 h，Western洗滌液再次洗膜后，用稀釋好的Ⅱ抗室溫條件孵育1 h。利用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒ECL顯影，以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件分析目的蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 miR

-

590在口腔鱗癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)

口腔鱗癌組織中miR-590的表達(dá)水平為（0.73±0.07），與癌旁組織的（0.30±0.03）比較顯著降低（

t

=40.715，

P

＜0.001）。

2.2 抑制miR

-

590對(duì)細(xì)胞Tca

-

8113增殖、遷移、侵襲的影響

anti-miR-590組Tca-8113細(xì)胞miR-590的表達(dá)與anti-miR-NC組比較顯著下調(diào)（

P

＜0.05），表明成功構(gòu)建抑制miR-590表達(dá)的Tca-8113細(xì)胞株。與anti-miR-NC組比較，anti-miR-590組Tca-8113細(xì)胞活力、遷移和侵襲數(shù)目、Cyclin D1和MMP-2蛋白表達(dá)量顯著降低，P21和E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著升高（

P

＜0.05），見圖1、表1、表2。提示，抑制miR-590能夠抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

圖1 抑制miR-590對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Tca-8113增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

表2 抑制miR-590對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Tca-8113遷移、侵襲的影響/±s

2.3 miR

-

590靶向調(diào)控LATS1表達(dá)

生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-590的靶基因顯示，miR-590可以和LATS1的3"UTR相結(jié)合。與miR-NC和WT-LATS1共轉(zhuǎn)染組比較，miR-590 mimics和WT-LATS1共轉(zhuǎn)染后Tca-8113細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性顯著下降（

P

＜0.05）；與anti-miR-NC和MUT-LATS1共轉(zhuǎn)染組相比較，miR-590 mimics和MUT-LATS1共轉(zhuǎn)染后Tca-8113細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。miR-590組Tca-8113細(xì)胞LATS1蛋白表達(dá)量為（0.06±0.01），與miR-NC組的（0.17±0.02）相比顯著降低（

P

＜0.05）；anti-miR-590組Tca-8113細(xì)胞LATS1蛋白表達(dá)量為（0.58±0.05）與anti-miR-NC組的（0.19±0.02）相比顯 著升高（

P

＜0.05）（

F

=547.059，

P

＜0.05）。見圖2、表3。以上結(jié)果表明，LATS1是miR-590的靶基因，miR-590可負(fù)性調(diào)控LATS1表達(dá)。

表1 抑制miR-590對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Tca-8113增殖的影響/±s

圖2 miR-590靶向調(diào)控LATS1表達(dá)：A為L(zhǎng)ATS1的3"UTR含有miR-590的互補(bǔ)序列；B為miR-590調(diào)控LATS1的表達(dá)

2.4 過(guò)表達(dá)LATS1對(duì)細(xì)胞Tca

-

8113增殖、遷移、侵襲的影響

pcDNA3.1-LATS1組Tca-8113細(xì)胞LATS1蛋白表達(dá)量與pcDNA3.1組比較顯著降低，表明過(guò)表達(dá)LATS1的Tca-8113細(xì)胞株構(gòu)建成功。與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-LATS1組Tca-8113細(xì)胞活力、遷移和侵襲數(shù)目、Cyclin D1和MMP-2蛋白表達(dá)量顯著降低（

P

＜0.05），P21和E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著升高（

P

＜0.05），見圖3、表4、表5。提示，過(guò)表達(dá)LATS1能夠抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。注：E-cadherin為上皮鈣黏素，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶2。

表3 miR-590靶向調(diào)控LATS1表達(dá)的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)/±s

圖3 過(guò)表達(dá)LATS1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Tca-8113增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

表4 過(guò)表達(dá)LATS1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Tca-8113增殖的影響/±s

表5 過(guò)表達(dá)LATS1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Tca-8113遷移、侵襲的影響/±s

2.5 抑制LATS1能逆轉(zhuǎn)抑制miR

-

590對(duì)細(xì)胞Tca

-

8113增殖、遷移、侵襲的抑制作用

與anti-miR-NC組比較，anti-miR-590組Tca-8113細(xì)胞LATS1、P21和E-cadherin蛋白的表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活力、遷移和侵襲數(shù)目、Cyclin D1和MMP-2蛋白表達(dá)量顯著降低（

P

＜0.05）；與anti-miR-590+si-NC組比較，antimiR-590+si-LATS1組Tca-8113細(xì)胞LATS1、P21和E-cadherin蛋白的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞活力、遷移和侵襲數(shù)目、Cyclin D1和MMP-2蛋白表達(dá)量顯著升高（

P

＜0.05），見圖4、表6、表7。以上結(jié)果表明，抑制LATS1能購(gòu)逆轉(zhuǎn)抑制miR-590對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響。

3 討論

近年來(lái)，口腔鱗癌的發(fā)病機(jī)制受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注。Fu等研究發(fā)現(xiàn)，miR-155通過(guò)調(diào)控p27Kip1表達(dá)能夠調(diào)控口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞的增殖、周期和凋亡；Rastogi等研究表明下調(diào)miR-377通過(guò)靶向組蛋白去乙?；?（HDAC9）促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和遷移。此外，Wang等研究者指出miR-139-5p通過(guò)靶向同源盒A9（HOXA9）抑制口腔鱗癌細(xì)胞的發(fā)生和進(jìn)展。以上研究表明，miRNA在口腔鱗癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，探索與口腔鱗癌相關(guān)的miRNA，對(duì)口腔鱗癌的臨床診療意義重大。

圖4 抑制LATS1能逆轉(zhuǎn)抑制miR-590對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Tca-8113增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

miR-590表達(dá)異常是惡性腫瘤中常見的分子事件。miR-590在結(jié)腸癌中呈高表達(dá)，其與腫瘤臨床病理分期分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并通過(guò)抑制Wnt抑制因子1（WIF1）和分泌性蛋白Dikkopf-1（DKK1）表達(dá)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖起正性調(diào)控作用；在肝癌細(xì)胞中，miR-590也呈高表達(dá)，下調(diào)miR-590可引起肝癌細(xì)胞周期阻滯，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，增加細(xì)胞的化療敏感性；此外，miR-590在卵巢癌中也發(fā)揮癌基因作用。然而，在乳腺癌細(xì)胞中，miR-590表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-590可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在控制乳腺癌進(jìn)展和骨轉(zhuǎn)移方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值；過(guò)表達(dá)miR-590還可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-590在口腔鱗癌組織中表達(dá)水平顯著升高，抑制miR-590表達(dá)能夠抑制Cyclin D1、MMP-2蛋白，促進(jìn)P21和E-cadherin蛋白表達(dá)，進(jìn)而降低口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。以上研究首次揭示了miR-590在口腔鱗癌進(jìn)展中的作用。

表6 抑制LATS1能逆轉(zhuǎn)抑制miR-590對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Tca-8113增殖的影響/±s

表7 抑制LATS1能逆轉(zhuǎn)抑制miR-590對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Tca-8113遷移、侵襲的影響/±s

為了解miR-590調(diào)控口腔鱗癌的分子機(jī)制，用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行miR-590靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，LATS1是miR-590的潛在靶基因。LATS1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的激酶，其與白血病、星形細(xì)胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤相關(guān)。在腎癌中，沉默LATS1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性表型，促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在口腔鱗癌中，LATS1基因通過(guò)啟動(dòng)子甲基化而下調(diào)，LATS1的表達(dá)下調(diào)與腫瘤的大小、分化程度以及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-590可靶向負(fù)性調(diào)控LATS1的表達(dá)。過(guò)表達(dá)LATS1可抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。實(shí)驗(yàn)表明，抑制LATS1顯著減弱抑制miR-590對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用。提示miR-590通過(guò)靶向LATS1參與對(duì)口腔鱗癌進(jìn)展的調(diào)控。

綜上所述，miR-590在口腔鱗癌組織中呈高表達(dá)，抑制miR-590通過(guò)靶向LATS1可抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，從而阻礙口腔鱗癌進(jìn)展。miR-590有望成為口腔鱗癌的新的診療靶點(diǎn)。