郭延華，周 平，王立民，王新華，劉守仁，皮文輝

(綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室/新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆 石河子 832000)

哺乳動物卵母細(xì)胞和早期胚胎對環(huán)境應(yīng)激非常敏感。 胚胎培養(yǎng)實驗室內(nèi)，關(guān)鍵設(shè)備之一是二氧化碳培養(yǎng)箱，配子/胚胎體外培養(yǎng)的大部分時間處于培養(yǎng)箱內(nèi)。 培養(yǎng)箱的主要功能是為配子和胚胎發(fā)育提供穩(wěn)定的環(huán)境。 為了達(dá)到這個目標(biāo)，培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)溫度、二氧化碳水平、pH 值、氧氣濃度和濕度/蒸發(fā)/介質(zhì)滲透壓；所有這些都會影響胚胎發(fā)育[1]。 大多數(shù)可用的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)部面積很大，而且日常工作需要頻繁開門，會擾亂箱內(nèi)平衡，降低培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

為了保持單元內(nèi)的環(huán)境穩(wěn)定，多數(shù)實驗室采用個人專用培養(yǎng)箱，減少分享空間，降低培養(yǎng)箱開門次數(shù)。 這樣做法降低設(shè)備利用效率，增加固定資產(chǎn)投資。

Vajta 等(1997)報道潛水艇孵育系統(tǒng)。 將含有胚胎的組織培養(yǎng)皿單獨包裹在不滲透二氧化碳、氧氣和氮氣的層壓箔袋中，并填充所需的氣體混合物，然后熱熔封閉，浸入循環(huán)控溫水浴中，以達(dá)到所需的培養(yǎng)期(最長7 d)。這樣，所有包裝好的培養(yǎng)皿都可以作為單獨的培養(yǎng)箱(“潛艇”)使用。該系統(tǒng)的優(yōu)點是溫度、濕度和氣體混合物穩(wěn)定；打開后這些參數(shù)可快速恢復(fù)；靈活使用不同的混合氣體；安全；成本低；降低污染風(fēng)險；清潔問題少；運輸方便[2,3]。

本文利用實驗室二氧化碳傳感器壞了的培養(yǎng)箱做恒溫容器，將含有早期胚胎的組織培養(yǎng)皿單獨放在1 L 的304 不銹鋼壓力罐中，并填充飽和濕度的標(biāo)準(zhǔn)混合氣體，關(guān)閉開關(guān)，密閉壓力罐，放入恒溫箱中，達(dá)到所需要的培養(yǎng)期7 d。該孵育系統(tǒng)創(chuàng)造的培養(yǎng)單元內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，每一個罐子都可以作為單獨的培養(yǎng)單元使用，具有潛水艇孵育系統(tǒng)表現(xiàn)出來的優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

卵母細(xì)胞體外成熟TCM199 試劑購自Gibco 公司。 體外操作液 (H199)、 早期胚胎體外培養(yǎng)發(fā)育液(SOFaai: NaCL 107.70 mM, KCL 7.15 mM, NaHCO325.00 mM, KH2PO40.30 mM, Na Lactate 3.32 mM,pyruvate 0.33 mM, CaCL2*2H2O 1.71 mM, Myo-inositol 2.77 mM, GlutaMAXTM1 mM, MEM non-essential amino acids 100×, Basal medium Eagles essential amino acids 50×, Gentamicin 50 mg/L, fatty acid free BSA 8 mg/mL)、電融合液和激活液(SOFaai+7%乙醇和SOFaai+2 μmoL/L 6-DMAP)均自配[4]。

1.2 實驗材料

1 L 304 不銹鋼壓力罐購自蘇州瑞祥電子商鋪。MIC-101 培養(yǎng)系統(tǒng)(Billups-rothenberg，世聯(lián)博研)，每個培養(yǎng)室的體積大約為8 L。 Heraeus 二氧化碳培養(yǎng)箱，該培養(yǎng)箱二氧化碳檢測器壞了，聯(lián)系廠家客服，反饋信息是該型號太古老，已經(jīng)停產(chǎn)，無法匹配對應(yīng)的二氧化碳檢測器，由于控溫系統(tǒng)正常，因此在實驗室當(dāng)恒溫箱使用。5% CO2、7% O2和88% N2標(biāo)準(zhǔn)混合氣體(上海偉創(chuàng)標(biāo)準(zhǔn)氣體有限公司)。 綿羊卵巢取自當(dāng)?shù)鼗钚笸涝讏觥?/p>

1.3 試驗方法

1.3.1 綿羊原代成纖維細(xì)胞饑餓培養(yǎng)

無菌操作取3 歲齡薩福克公羊耳部皮膚組織，清洗剪碎，培養(yǎng)于DMEM +10% FBS+雙抗溶液中。 原代培養(yǎng)每隔3 d 換液1 次，5 d 后成纖維細(xì)胞生長至約90%，胰酶消化離心洗滌，用DMEM+10% FBS 的培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每3 d 換液1 次，傳3 代凍存。 解凍細(xì)胞接種于24 孔板培養(yǎng)，長至80%時候，用PBS 清洗2 遍，換成2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔3 d 換液一次，饑餓培養(yǎng)至第6 d，胰酶消化，2 500 r/mim 離心收集至1.5 mL EP 管，100 μL 2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞以備供核。

1.3.2 綿羊體細(xì)胞克隆

新鮮卵巢組織置于約30 ℃生理鹽水保溫瓶中，在120 min 內(nèi)運到實驗室進(jìn)行處理。卵巢在PBS 中清洗2 遍，放入含有60 IU/mL 肝素的Hepes 緩沖TCM-199 采卵液的培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀片切割卵巢表面的濾泡。 選擇致密卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，在Hepes 緩沖TCM-199 中洗滌2 遍。 每組50 個COCs在 400 μL NaHCO3緩沖 TCM-199 中成熟，TCM-199 成熟液中添加 10%(V:V) 胎牛血清 (FBS)、2 mM GlutaMAXTM、0.3 mM 丙酮酸鈉、0.1 mM 半胱氨酸、5 μg/mL 促 卵泡激 素、5 μg/mL 黃體生成激素、1 μg/mL β-雌二醇，并將其置于38.6 ℃的5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

COCs 成熟21～22 h，在含1 mg/mL 透明質(zhì)酸酶的Hepes 緩沖TCM-199 中去除卵丘細(xì)胞。 所有剩余的操作都在38 ℃的熱板上進(jìn)行。 挑選第一極體排出的優(yōu)質(zhì)成熟卵母細(xì)胞備用。 在60 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)制作操作液滴 (M199+25 mmoL/L Hepes+20% FBS+7.5 μg/mL CB) 并覆蓋石蠟油。 去核和注核在顯微操作臺上進(jìn)行。 重構(gòu)的卵母細(xì)胞-供核細(xì)胞復(fù)合體在成熟液中培養(yǎng)30 min ；然后在融合液(0.3 moL/L 甘露醇+0.5 mmoL/L Hepes+0.1 mmoL/L CaCl2+0.1 mmoL/L MgCl2)中進(jìn)行電融合，條件為直流脈沖場強(qiáng)25 kV/cm、時程20 μs、次數(shù)2 次。 電融合每批5～8 枚/次。 卵子/供核細(xì)胞復(fù)合體電融合后培養(yǎng)45 min 觀察融合情況， 剔除沒有融合的復(fù)合體。 重構(gòu)胚繼續(xù)培養(yǎng)2 h 進(jìn)行激活處理，7%乙醇7 min、2 μmoL/L 6-DMAP 4 h激活。 清洗重構(gòu)胚后，轉(zhuǎn)入平衡好的發(fā)育液SOFaai 中。 含有重構(gòu)胚的培養(yǎng)皿放于培養(yǎng)罐(1 L 304 不銹鋼壓力罐或MIC-101 培養(yǎng)系統(tǒng))內(nèi)，充入經(jīng)過蒸餾水的混合標(biāo)氣(5% CO2、7% O2和88% N2)。 充氣后密閉罐子，置于38.6 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，第7 d 取出打開罐子，檢查囊胚率。

1.3.3 孤雌胚胎的制作

將成熟24 h 去除顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞，用7%乙醇7 min、2 μmoL/L 6-DMAP 4 h 進(jìn)行激活處理。 然后移入 SOFaai 清洗 3 遍。 將孤雌胚胎置于平衡好的發(fā)育液 SOFaai 中，38.6 ℃、5% CO2、7% O2和 88% N2飽和濕度的密封培養(yǎng)罐(1 L 304 不銹鋼壓力罐或MIC-101 培養(yǎng)系統(tǒng))培養(yǎng)，培養(yǎng)第7 d 檢查囊胚率。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用卡方 (X2) 檢驗分析，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 孤雌激活胚胎體外發(fā)育結(jié)果

2020 年7 月采集屠宰場綿羊卵巢獲取卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞成熟后孤雌激活，獲得的孤雌激活胚胎培養(yǎng)于不同的培養(yǎng)罐中，通過第7 d 的囊胚率，確定不同培養(yǎng)罐對孤雌激活胚胎體外發(fā)育的影響。 3 個重復(fù)共308 枚孤雌激活胚胎發(fā)育結(jié)果見表1。結(jié)果表明，在304 不銹鋼罐和MIC-101 培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)，孤雌激活胚的囊胚發(fā)育率沒有差異(26.45% vs 24.84%，P＞0.05)。

表1 不同孵育器對孤雌胚胎體外發(fā)育的影響

2.2 克隆重構(gòu)胚胎體外發(fā)育結(jié)果

2020 年10 月采集屠宰場綿羊卵巢獲取卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞成熟21～22 h，經(jīng)去核、注核和激活處理后，獲得的重構(gòu)胚胎培養(yǎng)于不同的培養(yǎng)罐中，通過第7 d 的囊胚率，確定不同培養(yǎng)罐對重構(gòu)胚胎體外發(fā)育的影響。4 個重復(fù)共948 枚重構(gòu)胚胎發(fā)育結(jié)果見表2。結(jié)果表明，304 不銹鋼罐和MIC-101 培養(yǎng)系統(tǒng)中，克隆重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率沒有差異(16.07% vs 16.84%，P＞0.05)。

表2 不同孵育器對重構(gòu)胚體外發(fā)育的影響

在體式顯微鏡下觀察，兩個培養(yǎng)系統(tǒng)中囊胚形態(tài)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和孵化效果沒有差異(見圖1)，初步說明MIC-101 和304 不銹鋼罐孵育系統(tǒng)材質(zhì)都能滿足早期胚胎體外培養(yǎng)需求。圖1 是用手機(jī)在體視鏡目鏡中拍攝的照片。

圖1 重構(gòu)胚在不同孵育器內(nèi)的發(fā)育

3 討 論

幾乎所有被調(diào)查物種的輸卵管和子宮中的氧氣濃度都明顯低于大氣中的氧氣濃度(分別為1.5%～6%和21%)[5]。 牛[6]、豬[7]和綿羊[8]早期胚胎體外培養(yǎng)使用簡單的培養(yǎng)基(非共培養(yǎng)體系)，在低氧(5%～8%)環(huán)境下培養(yǎng)同大氣環(huán)境下比較，發(fā)育效果和囊胚質(zhì)量更優(yōu)，改善了胚胎妊娠率。低氧濃度應(yīng)該是包括人類在內(nèi)的所有哺乳動物胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)的原則[9]，而且全球基本形成共識[5]。

MIC-101 培養(yǎng)系統(tǒng)(見圖2)已經(jīng)被許多實驗室采用，進(jìn)行細(xì)胞、胚胎或其它生物體培養(yǎng)，創(chuàng)造了實驗所需的氣象環(huán)境，氣體濃度保持恒定，濕度不變，培養(yǎng)皿也與潛在的污染物隔離。 MIC-101 允許在預(yù)定的確切條件下進(jìn)行實驗。 可以根據(jù)需要改變氣體濃度、濕度或溫度，使用方便。

304 不銹鋼罐(見圖2)材質(zhì)同多數(shù)二氧化碳培養(yǎng)箱不銹鋼內(nèi)套一樣，所以材質(zhì)方面滿足胚胎培養(yǎng)。實驗中使用的1 L 304 不銹鋼罐，單價300 元左右，價格便宜。 腔體1 L，較MIC-101 系統(tǒng)更小(約8 L)，使用時節(jié)省標(biāo)準(zhǔn)混合氣體，占用恒溫箱內(nèi)部的空間更小，提高實驗室設(shè)備利用率。 在一個封閉的系統(tǒng)中，50 mL 的混合氣體可以滿足200 枚牛胚胎從受精卵到囊胚期7 d 的需要[2]。 因此，如果只進(jìn)行胚胎培養(yǎng)，可以采用更小體積的不銹鋼罐。

不銹鋼罐與MIC-101 或?qū)訅翰啾龋梢猿惺芤欢ǖ膲毫Α?壓力造成胚胎應(yīng)激，適宜的應(yīng)激可能改善胚胎質(zhì)量[10]。 因此，用304 不銹鋼罐作為早期胚胎培養(yǎng)的孵育器，可以為研究壓力對胚胎體外發(fā)育的影響提供裝置基礎(chǔ)。

圖2 兩種孵育器實物圖

4 結(jié) 論

本實驗結(jié)果表明，在5% CO2、7% O2、88% N2標(biāo)準(zhǔn)混合氣體、飽和濕度和38.6 ℃環(huán)境條件下，不銹鋼罐孵育器和MIC-101 孵育器比較，孤雌激活胚胎的囊胚發(fā)育率26.45% vs 24.84%；重構(gòu)胚胎的囊胚發(fā)育率16.07% vs 16.84%，差異都不顯著(P＞0.05)。 說明304 不銹鋼罐組合標(biāo)準(zhǔn)混合氣體和恒溫箱，是一種價格便宜、易用、環(huán)境穩(wěn)定的早期胚胎體外培養(yǎng)孵育系統(tǒng)。