趙建波，劉 峰，孫 亮

0 引言

慢性腦缺血缺氧能引起腦細(xì)胞損傷，甚至腦部病變，如腦組織水腫、軟化及壞死等[1]。而許多疾病，如腦梗死、頸部血管斑塊或堵塞、腦血管硬化等均可導(dǎo)致腦部缺氧，進(jìn)而損傷神經(jīng)細(xì)胞，加重病情[2-3]。因此，如何防治慢性腦部缺氧具有重要意義。尼莫地平(Nimodipine，NP)作為脂溶性的雙氫吡啶類鈣離子拮抗藥，易通過(guò)血腦屏障并與中樞神經(jīng)的特異受體結(jié)合，起到擴(kuò)張腦血管和增加腦血流量的作用[4]。在臨床上，NP已被應(yīng)用于保護(hù)缺血性神經(jīng)元、改善腦循環(huán)及治療血管性癡呆等[5]。LINK-A是長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)的家族成員之一，分子量約為1.5 kb，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)[6]。研究顯示，lncRNA LINK-A與多種腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展有關(guān)[7]。還有研究顯示，lncRNA LINK-A可能通過(guò)激活HIF1α信號(hào)通路改善糖尿病性腎病的治療[8]。但lncRNA LINK-A是否參與NP對(duì)缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以SK-N-SH細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)三氣培養(yǎng)箱構(gòu)建缺氧環(huán)境，觀察NP對(duì)缺氧神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，并探討lncRNA LINK-A在其中的作用，為臨床治療慢性腦缺氧提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 NP(貨號(hào)N149，純度≥98%)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，以DMSO配制母液；TUNEL染色試劑盒、噻唑藍(lán)(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)、磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution，PBS)、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司；MEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；lncRNA LINK-A過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自上海吉瑪公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；Bcl-2抗體、p-AKT抗體、AKT抗體及GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；抗兔IgG、HRP二抗購(gòu)自上海愛(ài)必信公司。

1.1.3 主要儀器 電子天平，美國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品；SpectraMax 190酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司產(chǎn)品；Centrifuge 5424 R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)eppendorf公司產(chǎn)品；Mx3000/Mx3005P 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器，美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；IX73倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；SQP-30/SQ三氣培養(yǎng)箱，天津瑪福爾科技有限公司產(chǎn)品；AI600凝膠成像儀，美國(guó)GE公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)環(huán)境 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞以含10%FBS和1%青-鏈霉素的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞正常培養(yǎng)環(huán)境為飽和濕度、37 ℃、95%空氣、5%CO2的培養(yǎng)箱。缺氧環(huán)境為飽和濕度、92%N2、5%CO2和3%O2的三氣培養(yǎng)箱。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 接種細(xì)胞于兩張96孔板中，每孔8×103個(gè)細(xì)胞。次日，配制含0、5、10、20、40、80、160 μmol/L NP的MEM培養(yǎng)基，取一個(gè)96孔板，每孔按100 μl上述培養(yǎng)基加入細(xì)胞中，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立調(diào)零孔，置于缺氧環(huán)境中。另一孔板每孔加入100 μl MEM培養(yǎng)基，作為對(duì)照置于正常環(huán)境中。細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)，每孔加入MTT (5 mg/ml)10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。而后棄去培養(yǎng)基和MTT混合液，每孔加入二甲基亞砜100 μl。用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定各孔的吸光度(OD)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建lncRNA LINK-A穩(wěn)定表達(dá)的SK-N-SH細(xì)胞 接種3×106個(gè)細(xì)胞于6孔板中，次日，取出帶綠色熒光標(biāo)簽的空載慢病毒液和lncRNA LINK-A過(guò)表達(dá)慢病毒液，分別稀釋20倍備用。配制含10 μg/ml Polybrene的MEM全培養(yǎng)基并替換舊培養(yǎng)基，將2種慢病毒液分別加入細(xì)胞中并設(shè)為空載對(duì)照組和LINK-A過(guò)表達(dá)組，以正常SK-N-SH細(xì)胞作為空白組。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，更換新的MEM全培養(yǎng)基，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期傳代于6 cm培養(yǎng)皿中，嘌呤霉素篩選細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞熒光表達(dá)情況，RT-qPCR檢測(cè)lncRNA LINK-A表達(dá)水平。

1.2.4 生化儀檢測(cè)細(xì)胞LDH釋放率 接種SK-N-SH細(xì)胞于2個(gè)6孔板中，每孔3×105個(gè)細(xì)胞。次日，將一孔板置于正常環(huán)境中，作為空白組；將另一孔板分為2組，分別為缺氧組和NP組，置于缺氧環(huán)境中。空白組和缺氧組以1‰DMSO處理，NP組以NP (20 μmol/L)處理，時(shí)間為24 h。另將轉(zhuǎn)染成功的空載對(duì)照組和LINK-A過(guò)表達(dá)組，以及相應(yīng)空白組細(xì)胞置于缺氧環(huán)境中24 h。按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定LDH水平，LDH釋放率(%)=上清液LDH值/(上清液LDH值+細(xì)胞內(nèi)LDH值)×100%。

1.2.5 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 將無(wú)菌蓋玻片置于六孔板中，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞。按“1.2.4”項(xiàng)中2種分組處理后PBS洗一遍，甲醇固定10 min，按說(shuō)明書進(jìn)行TUNEL染色，并以DAPI染核。熒光顯微鏡下觀察拍照并計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)lncRNA LINK-A表達(dá) 收集空白組、缺氧組和NP組細(xì)胞，采用TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度后，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)為cDNA，cDNA稀釋備用。將lncRNA LINK-A引物稀釋，利用RT-qPCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用2(-△△CT)法計(jì)算lncRNA LINK-A的表達(dá)水平?？蛰d對(duì)照組、LINK-A過(guò)表達(dá)組、相應(yīng)空白組也采用上述方法檢測(cè)LINK-A表達(dá)水平。

1.2.7 蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p-AKT和Bcl-2蛋白表達(dá) 按“1.2.4”項(xiàng)中2種分組處理后，細(xì)胞以RIPA裂解液(含磷酸酶和蛋白酶抑制劑)提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，制備蛋白樣品，并以30 μg/孔蛋白進(jìn)行上樣，PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃孵育AKT(1∶2 000)、p-AKT(1∶1 000)、Bcl-2(1∶2 000)及GAPDH(1∶4 000)抗體過(guò)夜，次日洗膜后孵育抗兔IgG HRP二抗(1∶4 000)1 h，洗膜后以ECL發(fā)光液于凝膠成像儀上成像。

2 結(jié)果

2.1 NP對(duì)缺氧神經(jīng)細(xì)胞存活率、LDH釋放率及l(fā)ncRNA LINK-A表達(dá)的影響 MTT結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞存活率降低(P<0.01)。10～50 μmol/L NP均可抑制缺氧誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞存活率下降(P<0.01)，其中，20 μmol/L NP的抑制效果最強(qiáng)，見(jiàn)圖1A。對(duì)照組、缺氧組及NP組LDH釋放率分別為18.6%±2.2%、69.5%±6.3%及42.9%±5.0%。與對(duì)照組比較，缺氧組LDH釋放率顯著升高(P<0.01)；與缺氧組比較，NP組LDH釋放率明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖1B。RT-qPCR結(jié)果顯示，對(duì)照組、缺氧組和NP組lncRNA LINK-A表達(dá)分別100%、33.6%±3.0%、538.3%±43.6%。相較于對(duì)照組，缺氧組lncRNA LINK-A表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與缺氧組相比，NP組lncRNA LINK-A表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖1C。

圖1 NP對(duì)缺氧神經(jīng)細(xì)胞活力、LDH釋放率及l(fā)ncRNA LINK-A表達(dá)的影響

2.2 NP抵抗缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡 TUNEL染法結(jié)果顯示，對(duì)照組、缺氧組和NP組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為12.60%±0.11%、65.50%±5.80%、40.62%±3.85%。與對(duì)照組相比，缺氧組細(xì)胞凋亡顯著增加(P<0.01)；與缺氧組比較，NP組細(xì)胞凋亡明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照組、缺氧組和NP組細(xì)胞凋亡水平

2.3 NP逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的p-AKT和Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào) 蛋白印記結(jié)果顯示，對(duì)照組、缺氧組和NP組p-AKT相對(duì)蛋白表達(dá)分別為100%、58.3%±6.5%、106.5%±8.6%，Bcl-2蛋白表達(dá)分別為45.6%±6.5%、10.2%±1.2%、96.6%±8.2%。與對(duì)照組相比，缺氧組細(xì)胞p-AKT和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；與缺氧組相比，NP組細(xì)胞p-AKT和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖3 對(duì)照組、缺氧組和NP組細(xì)胞p-AKT與Bcl-2相對(duì)蛋白表達(dá)

2.4 lncRNA LINK-A過(guò)表達(dá)抵抗缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放率增加 熒光顯微鏡觀察顯示，空載對(duì)照組和LINK-A過(guò)表達(dá)組均顯綠色熒光，見(jiàn)圖4A。RT-qPCR結(jié)果顯示，相較于空載對(duì)照組，LINK-A過(guò)表達(dá)組細(xì)胞lncRNA LINK-A表達(dá)明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)圖4B?？瞻讓?duì)照組、空載對(duì)照組和LINK-A過(guò)表達(dá)組LDH釋放率分別為73.6%±7.8%、70.5%±8.1%、32.3%±3.6%。與空載對(duì)照組相比，LINK-A過(guò)表達(dá)組LDH釋放率顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)圖4C。

圖4 lncRNA LINK-A過(guò)表達(dá)對(duì)缺氧神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放率的影響

2.5 lncRNA LINK-A過(guò)表達(dá)抵抗缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡 空白對(duì)照組、空載對(duì)照組和LINK-A過(guò)表達(dá)組在缺氧環(huán)境中生長(zhǎng)24 h，TUNEL染色結(jié)果顯示，各組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為44.7±4.1、48.6±5.12、28.8±1.83。與空載對(duì)照組相比，LINK-A過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡顯著降低(P<0.01)，空白對(duì)照組與空載對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 lncRNA LINK-A過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)p-AKT和Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào) 蛋白印記結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、空載對(duì)照組和LINK-A過(guò)表達(dá)組p-AKT相對(duì)蛋白表達(dá)分別為100%、98.9%±8.9%、426.3%±40.6%，Bcl-2蛋白表達(dá)分別為82.3%±8.0%、85.5%±8.9%、356.6%±38.2%。空白對(duì)照組和空載對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與空載對(duì)照組相比，LINK-A過(guò)表達(dá)組p-AKT和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

圖5 空白對(duì)照組、空載對(duì)照組和LINK-A過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡情況

圖6 lncRNA LINK-A過(guò)表達(dá)對(duì)p-AKT和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

腦缺氧指氧的供應(yīng)或利用不能達(dá)到腦組織代謝需要的最低水平而出現(xiàn)不同程度的腦功能障礙，而慢性腦缺氧會(huì)造成不可逆轉(zhuǎn)的腦損害，甚至腦死亡[9]。許多因素可引起腦缺氧，如腦血管硬化、腦梗死、手術(shù)損傷、腫瘤、炎癥等[10]。通常情況下，慢性腦缺氧會(huì)引起線粒體功能障礙、鈣離子超載、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等一系列病理變化，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11-12]。研究顯示，神經(jīng)細(xì)胞凋亡與神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默癥和肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥等疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13-14]。因此，防治缺氧性神經(jīng)細(xì)胞損傷或凋亡對(duì)于改善或預(yù)防腦血管或腦神經(jīng)相關(guān)疾病具有重要臨床意義。

SK-N-SH細(xì)胞為人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，具有神經(jīng)細(xì)胞的特性和腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的能力，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)研究。本研究以SK-N-SH細(xì)胞作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)10～50 μmol/L NP可抵抗缺氧誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞存活率降低，而且20 μmol/L NP的效果最佳，提示NP對(duì)缺氧環(huán)境中的SK-N-SH細(xì)胞具有保護(hù)作用，由于20 μmol/L NP藥效最佳，該濃度的NP被選用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NP處理可抵抗缺氧誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞LDH釋放率和凋亡增加。LDH存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，而缺氧損傷后細(xì)胞膜通透性改變，LDH易滲出細(xì)胞外，導(dǎo)致LDH釋放率增加[15]，提示NP可減輕缺氧誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞損傷和凋亡。相關(guān)分子研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞Bcl-2和p-AKT蛋白表達(dá)下調(diào)，而NP可逆轉(zhuǎn)上述蛋白表達(dá)變化。Bcl-2作為抗凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮抗凋亡作用[16]。研究顯示，AKT的磷酸化激活可減少細(xì)胞凋亡[17]。提示NP可能通過(guò)誘導(dǎo)缺氧神經(jīng)細(xì)胞p-AKT和Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)抵抗細(xì)胞凋亡。

缺氧條件下，SK-N-SH細(xì)胞LINK-A表達(dá)顯著降低，而NP處理能上調(diào)LINK-A表達(dá)水平。提示LINK-A可能在NP減緩缺氧誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞損傷中發(fā)揮作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證LINK-A的生物學(xué)功能，本研究成功構(gòu)建了LINK-A過(guò)表達(dá)的SK-N-SH細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA LINK-A過(guò)表達(dá)能抑制缺氧誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞LDH釋放和細(xì)胞凋亡，還能上調(diào)Bcl-2和p-AKT蛋白表達(dá)。提示lncRNA LINK-A可能作為Bcl-2和p-AKT蛋白的上游調(diào)控因子，參與抵抗缺氧誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞凋亡。

綜上所述，NP可能通過(guò)lncRNA LINK-A誘導(dǎo)p-AKT和Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，從而抵抗缺氧誘導(dǎo)的SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞凋亡。但本研究?jī)H僅是體外缺氧模擬實(shí)驗(yàn)，還有待于進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。