龍 珍, 李曉玉, 李秀玲, 柳軍凱, 聶建輝, 李長坤, 李月琪, 黃濤宏, 黃維金*

(1.島津企業(yè)管理(中國)有限公司,北京 100020;2.中國食品藥品檢定研究院,衛(wèi)生健康委員會生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室,國家藥品監(jiān)督管理局生物制品質量研究與評價重點實驗室,北京 102629;3.中國科學院分離分析化學重點實驗室,中國科學院大連化學物理研究所,遼寧 大連 116023)

宮頸癌是威脅女性健康的第四大常見惡性腫瘤類疾病,同時也是女性因癌癥而死亡的主要原因之一[1]。據統(tǒng)計,每年有45.3萬例宮頸癌案例報道[2],該疾病造成每年25萬例死亡[3]。感染人乳頭瘤病毒(HPV)是導致宮頸癌的主要原因,在大約95%的宮頸惡性病變樣本中檢出人乳頭瘤病毒DNA[4]。HPV疫苗是預防宮頸癌最有效的手段之一。研究顯示,9價HPV疫苗(如Gardasil?9)可有效預防97%的癌前病變損傷[5]。

HPV疫苗由HPV病毒樣顆粒(VLP)的原液與適當比例鋁佐劑結合制成。HPV成熟的VLP是直徑為50～55 nm并具有三角形剖分數(T)等于7的20面體對稱結構[6,7]。HPV疫苗中的VLP由重組技術表達。重組技術表達的VLP是由360份主要衣殼蛋白(L1)單體聚合而成的星狀五聚體(即殼粒,capsomere)。HPV病毒衣殼由72個殼粒通過相互作用組裝而成,其超微結構和免疫原性與天然HPV病毒類似[8,9]。目前上市的HPV疫苗由不同型別的VLP純化制成。例如,英國葛蘭素史克公司生產的HPV疫苗Cerarix?由HPV16/18 2種型別的VLP制成;美國默沙東公司HPV疫苗Gardasil?9由HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58 9種型別的VLP制成。在中國,除萬泰滄海外,還有9家企業(yè)15個品種的HPV疫苗處在研發(fā)階段。

VLP原液的質量(純度、顆粒度分布、VLP含量等)直接影響HPV疫苗的安全性和有效性。VLP的純度指VLP原液含有的總蛋白質中VLP所占的質量分數。VLP顆粒大小通常不是一個固定的數值,而是在一定數值范圍內。VLP含量是VLP原液中VLP的濃度。Folin-酚法(Lowry法)是疫苗領域常用的蛋白質含量測定方法,可有效實現(xiàn)疫苗原液中總蛋白質含量的測定。但該方法需要復雜的衍生步驟,耗時較長且自動化程度低,無法實現(xiàn)樣品的高通量檢測[10,11]。此外,該方法不僅可以衍生VLP還可以衍生其他具有衍生官能團的小分子物質。因此,檢測結果可能會受基質干擾以及衍生效率的影響,從而導致結果偏差。Long等[12]發(fā)展了基于液相色譜-串聯(lián)質譜的蛋白質含量測定方法,用于百日咳疫苗中抗原蛋白的含量測定。本實驗室[13]也發(fā)展了基于液相色譜-串聯(lián)質譜的2價HPV疫苗中HPV16/18抗原蛋白的含量測定。液相色譜-串聯(lián)質譜法靈敏度高,選擇性好,可用于復雜基質中抗原蛋白的含量測定,但前處理時間較長。體積排阻色譜(SEC)具有分離小分子基質和大分子目標化合物的作用,可用于排除小分子基質對大分子目標化合物檢測的干擾。在過去幾十年間,SEC被用作一種高分子表征技術,如高分子聚合物和蛋白質的分子量分布檢測[14,15]。該技術也用作HPV原液中VLP顆粒度分布的檢測,如Mach等[16]采用體積排阻色譜表征VLP顆粒度分布檢測以及加熱前后VLP的變化情況?，F(xiàn)有SEC能有效監(jiān)測VLP大小和分布是否符合預期,但無法用于VLP含量的測定。本文發(fā)展了一種基于SEC的方法,用于HPV疫苗原液中VLP的含量測定以及HPV疫苗中游離VLP的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

生物惰性液相色譜系統(tǒng),包括LC-20Ai高壓二元泵、脫氣機、SIL-20AC自動進樣器、CTO-20AC柱溫箱、SPD-M20A紫外檢測器,所有流路均為聚醚醚酮(PEEK)材質,LabSolutions工作站用于數據處理。以上儀器和軟件均購自島津公司(日本)。Allegra?64R離心機購自貝克曼公司(美國)。

磷酸氫二鈉(98%)、磷酸二氫鈉(98%)、磷酸(85%)、氯化鈉(99.99%)購自Sigma公司(美國)。低吸附離心管購自Merck公司(美國)。超純水由Milli-Q系統(tǒng)制備(Millipore公司,美國)。SHIMSEN Ankylo SEC-300色譜柱(300 mm×7.8 mm,3 μm)購自島津技邇公司。9個型別的HPV原液(包括HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58)、鋁佐劑和HPV疫苗由中國食品藥品檢定研究院提供。HPV疫苗樣品由廠家1(4個批次)、廠家2(4個批次)和廠家3(4個批次)提供。HPV原液和HPV疫苗均存儲于4 ℃冰箱。

1.2 樣品前處理

取疫苗樣品于低吸附離心管中,以14 000 r/min轉速離心10 min,取上清液進樣分析。

1.3 HPLC條件

色譜柱為SHIMSEN Ankylo SEC-300柱(300 mm×7.8 mm,3 μm);柱溫為30 ℃;流動相為含300 mmol/L氯化鈉和50 mmol/L磷酸鹽(pH 7.0)的水溶液;流速為1 mL/min;檢測波長為280 nm;進樣體積為10 μL;自動進樣器溫度為4 ℃。

2 結果與討論

2.1 實驗條件考察

2.1.1色譜柱考察

與小分子分析相比,蛋白質等大分子分析對色譜柱的要求更高。除內徑、長度、粒徑、比表面積、鍵合相和鍵合密度等參數以外,鍵合相和基質之間的親水層鍵合工藝以及固定相孔徑也對蛋白質的色譜行為有較大影響。由于蛋白質的特殊性質(強疏水性和強電荷性),用于蛋白質分析的體積排阻色譜往往需要在固定相基質和鍵合相之間涂覆/鍵合親水層,用于屏蔽蛋白質與基質之間的非特異性吸附,從而減少蛋白質在色譜柱上的死吸附,提高方法的靈敏度和穩(wěn)定性。由于親水層的工藝不同,不同廠家的色譜柱對蛋白質的吸附程度不同。本文考察了兩種不同親水層鍵合工藝的蛋白質分析SEC柱。最終選擇能為考察樣品提供較好峰面積重復性的SHIMSEN Ankylo SEC色譜柱進行后續(xù)的方法優(yōu)化。以含量為1 276、319、159 μg/mLHPV6的VLP樣品為例,采用SHIMSEN Ankylo SEC色譜柱分離分析,每種含量分別進樣5次,獲得的峰面積RSD均不超過5%。采用相同規(guī)格的另一品牌的SEC色譜柱時,峰面積RSD超過20%。

除親水層的鍵合工藝,SEC柱的孔徑也是影響蛋白質色譜行為的重要因素。本文分別考察了孔徑為30、50和100 nm的色譜柱(SHIMSEN Ankylo SEC-300、SEC-500、SEC-1000(300 mm×7.8 mm,3 μm))。VLP顆粒分布的表征通常使用大孔徑SEC柱,如孔徑為100 nm的SEC柱[16],如圖1所示,HPV6的VLP顆粒在SHIMSEN Ankylo SEC-1000柱上具有較好的分布,在6～11 min期間均有VLP的信號,但色譜峰較寬,導致靈敏度較低,不適合VLP的定量分析。色譜柱SEC-300和SEC-500均可實現(xiàn)VLP與小分子干擾物質的分離,以及VLP的快速洗脫,但SEC-300色譜柱可提供更窄的色譜峰,有利于提高檢測靈敏度。因此,以SHIMSEN Ankylo SEC-300柱為固定相,用于HPV的VLP分析。VLP并非單一尺寸的顆粒,在SEC色譜柱上存在一定的顆粒度分布,因此會導致色譜峰并非對稱的高斯峰。

圖 1 采用SEC-300、SEC-500和SEC-1000柱時HPV6的VLP色譜圖Fig.1 Chromatograms of virus-like particle (VLP) for human papilloma virus 6 (HPV6) using SEC-300,SEC-500 and SEC-1000 columns

2.1.2流動相組成考察

離子強度的增加有利于屏蔽蛋白質與色譜柱之間的靜電作用,從而改善峰形,減少死吸附和提高響應。本文考察了不同濃度(150、300和500 mmol/L)氯化鈉溶液對VLP峰形的影響。固定緩沖鹽磷酸鹽的濃度(50 mmol/L)和pH值(7.0),隨著氯化鈉濃度從150 mmol/L增加至300 mmol/L,HPV6峰高隨之增加。再增加氯化鈉濃度,峰高無顯著變化。因此,以300 mmol/L氯化鈉(含50 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽)為流動相。

2.1.3流動相pH值考察

流動相的pH值會影響固定相和蛋白質的帶電情況。本文考察了在流動相pH 3.0和pH 7.0的條件下,VLP的出峰情況。相對于采用pH 3.0的流動相,采用pH 7.0的流動相,VLP響應更強?？赡艿脑蚴墙M成HPV的VLP的L1蛋白等電點(PI)大多在8.0左右。蛋白質PI由在線蛋白質等電點查詢軟件ProtParam計算(https://web.expasy.org/protparam/)。中性條件下,固定相與蛋白質之間的靜電吸引作用減弱,有利于蛋白質的洗脫。

習近平總書記指出，共青團必須把鞏固和擴大黨執(zhí)政的青年群眾基礎作為政治責任，把最大多數的青年緊緊凝聚在黨的周圍。黨旗所指就是團旗所向。青工政治輪訓猶如紅熱的熔爐，猶如剛毅的磨石，將始終聽黨話、堅定跟黨走，印刻為石化青年身上不可磨滅的紅色基因。

2.2 方法學考察

本文從線性范圍、檢出限(LOD)、定量限(LOQ)和重復性對發(fā)展的方法進行了考察。

2.2.1線性范圍

取9種型別HPV的VLP原液,用流動相稀釋,在表1濃度范圍內配制工作曲線溶液。每種型別的VLP工作曲線不少于5個濃度點,每個濃度樣品進樣3次。為了更為準確的測得待測樣品濃度,本研究線性曲線的最高濃度點和最低濃度點以待測樣品濃度為參考進行制定。以每個濃度所得VLP的峰面積與對應濃度進行線性回歸,得線性方程見表1。該方法可為9種型別HPV的VLP提供較好的線性,可用于該濃度范圍內樣品中VLP的含量測定。

2.2.2檢出限和定量限

以工作曲線的最低濃度點對應的樣品為母液,用流動相稀釋。當樣品所得信噪比接近但不低于3和10時,該濃度作為檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。9種型別VLP的LOD和LOQ見表1。

表1 9種VLP顆粒的線性范圍、線性方程、相關系數(R2)、檢出限和定量限Table 1 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients (R2),LODs and LOQs for the nine types of VLP

2.2.3重復性

2.3 9種型別VLP穩(wěn)定性分析

與鋁佐劑吸附的VLP相比,未經鋁佐劑吸附的VLP(即HPV原液)穩(wěn)定性較差,容易出現(xiàn)降解等現(xiàn)象。將本文方法用于新生產的HPV原液中VLP的含量測定,獲得HPV原液中原始的VLP濃度。將該樣品于4 ℃環(huán)境下放置一周后,再次測試VLP濃度,與VLP的原始濃度相比,4 ℃放置一周后的VLP出現(xiàn)了明顯的降解,尤其是HPV18和HPV58兩種型別的VLP,降解率分別高達62.6%和41.5%。該結果表明，未經鋁佐劑吸附的VLP具有熱不穩(wěn)定性,生產所得VLP需低溫保存或盡快用鋁佐劑處理。該方法靈敏度可滿足原液中VLP的濃度測試和VLP穩(wěn)定性測試。

Lowry法是測試蛋白質含量常用的方法。該方法通過磷鉬酸試液衍生蛋白質后,測試650 nm處衍生物的吸光度,從而測試樣品中蛋白質的含量。磷鉬酸試液不僅可以衍生蛋白質,還可以衍生很多小分子干擾物質。大部分衍生后的小分子干擾物質會導致吸光度降低,少數衍生后的小分子干擾物質導致吸光度升高。為了降低這些干擾物質對測試結果的影響,通常需要在測試之前進行蛋白沉淀等除雜質操作。

與Lowry法相比,本方法具有自動化程度高、無小分子干擾、檢測通量高等優(yōu)點。

2.4 鋁佐劑吸附后樣品中游離VLP分析

鋁佐劑對VLP的吸附完整性與疫苗的質量息息相關。本次共檢測來自3個廠家的12批次樣品,典型色譜圖見圖2。死時間附近可檢測到明顯的小分子基質,但VLP出峰位置處無明顯響應。說明被檢測廠家均能提供較好的鋁佐劑吸附工藝,可實現(xiàn)VLP的良好吸附。

圖 2 鋁佐劑吸附后的VLP樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of the VLP sample which reacted with Al adjuvant

3 結論

本文發(fā)展了一種基于體積排阻色譜的定量檢測HPV原液中VLP的方法。該方法與Lowry法相比,具有干擾少、自動化程度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點,適合高通量的樣品分析。本方法可用于HPV原液中VLP的含量測定,對比不同存儲條件下HPV原液中VLP的含量變化,為探索HPV原液存儲條件提供參考數據。同時,本方法還可用于疫苗上清液中游離VLP的分析,從而實現(xiàn)監(jiān)測鋁佐劑對VLP吸附的完整性。