曹晨凱，李佳隆，張科春

（西湖大學(xué)工學(xué)院，浙江省海岸帶環(huán)境與資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310024）

合成生物學(xué)的一個重要目標(biāo)是優(yōu)化、重構(gòu)微生物的遺傳元件，使其能夠滿足人們對目標(biāo)產(chǎn)物合成的需求。通過基因調(diào)控，可將微生物轉(zhuǎn)變?yōu)楦咝У纳锕S［1］。20 世紀(jì)80 年代初，隨著重組DNA 技術(shù)的出現(xiàn)，以及人們認(rèn)識到微生物可以通過基因工程從本質(zhì)上成為生產(chǎn)燃料和化學(xué)品的小化工廠，代謝工程科學(xué)因此誕生［1］。代謝工程利用多基因重組技術(shù)對細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行改造，構(gòu)建新的代謝途徑生產(chǎn)特定產(chǎn)物。

1 一碳化合物同化途徑

數(shù)百年來，通用的石化原料主要為石油與天然氣。如今，全球每年因使用化石燃料產(chǎn)生的二氧化碳的排放量約為70 億噸，過量的溫室氣體排放會引發(fā)許多環(huán)境問題，例如，海平面上升、熱鹽環(huán)流減弱與珊瑚礁系統(tǒng)滅絕等［2-3］。因此，社會各界一直在尋找新綠色原料替代傳統(tǒng)化石原料。其中，以甲醇和甲酸為代表的一碳化合物（C1化合物）具有較大潛力，傳統(tǒng)的甲醇生產(chǎn)工藝是以煤為原料制備合成氣，而甲酸主要由二氧化碳通過高溫高壓、電解與水熱反應(yīng)轉(zhuǎn)化而來［4-5］。C1化合物也可以通過綠色低成本的方法制備，例如，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)與食品加工產(chǎn)業(yè)中，產(chǎn)生的有機(jī)物廢料經(jīng)過生物精煉后可轉(zhuǎn)變?yōu)樯锛状己图姿幔?-8］。然而，目前面臨的主要困難之一是缺少相應(yīng)的以C1化合物作為原料的生產(chǎn)技術(shù)。因此，相比于改造傳統(tǒng)石油化學(xué)工藝限制碳排放，合成生物學(xué)可以提供一種使用C1原料的思路：改造代謝途徑使微生物能夠同化C1原料，從而以C1化合物作為碳源進(jìn)行相應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)［9-10］。

傳統(tǒng)微生物發(fā)酵方法主要以葡萄糖、淀粉等為碳源。要以C1化合物為碳源，主要難點(diǎn)在于絕大部分常見野生型微生物無法大量同化C1化合物，以及甲醛等C1化合物對微生物的毒性會影響其生長。根據(jù)近期的發(fā)現(xiàn)，異源表達(dá)RuMP循環(huán)與絲氨酸循環(huán)的基因可以使細(xì)菌有能力代謝并同化C1化合物及其氧化物［11］。

1.1 核酮糖單磷酸循環(huán)

盡管甲基營養(yǎng)菌中用于吸收甲醇的核酮糖單磷酸（ribulose monophosphate，RuMP）循環(huán)與典型的磷酸戊糖途徑（HMP pathway）僅3 個酶不同［甲醇脫氫酶（Mdh）、6-磷酸己糖合酶（Hps）和6-磷酸-3-己糖異構(gòu)酶（Phi）］［12］，但構(gòu)建一個能有效利用甲醇作為唯一碳源的菌株卻是一個很大的挑戰(zhàn)。1961 年，Quayle 等完成了對于扭脫甲基桿菌AM1（Methylobacterium extorquensAM1）的分離和表征［13］，發(fā)現(xiàn)了C1化合物可以通過核酮糖單磷酸循環(huán)（RuMP cycle）的方式被吸收利用［14］。圖1（a）描述了RuMP、ED 與EMP 循環(huán)同化以甲醇為代表的C1化合物的途徑。在RuMP 循環(huán)中，甲醛通過與5-磷酸核酮糖（Ru5P）縮合進(jìn)入該循環(huán)，最終被轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖（F6P）。隨后F6P 通過Embden-Meyerhof-Parnas 途徑（EMP pathway）和Entner-Doudoroff 途徑（ED pathway）轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，進(jìn)而用于脂肪酸、膽固醇和酮體的合成以支持微生物的生長。近年來，許多在大腸桿菌中重構(gòu)核酮糖單磷酸循環(huán)途徑的相關(guān)研究被報道。例如，2016 年，Whitaker 等［15］將來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的NAD+依賴性的Mdh 酶和來自甲醇雙歧桿菌的RuMP 途徑的酶導(dǎo)入大腸桿菌中從而同化甲醇，實(shí)驗(yàn)使用13C 標(biāo)記（13C-labeling）證實(shí)了大腸桿菌菌株可以將甲醇轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)。同時，Kalyuzhnaya 等［16］發(fā)現(xiàn) RuMP 循環(huán)可有效支持微生物生長，這時需要消耗ATP 并在丙酮酸脫羧時生成乙酰輔酶A，從而導(dǎo)致一份C1以二氧化碳的形式損失。因此，當(dāng)RuMP循環(huán)中一份磷酸二羥丙酮磷酸酯生成乙酰輔酶A 時，一份碳單元會損失，導(dǎo)致過程中碳流回收率下降三分之一。對于克隆RuMP循環(huán)的微生物來說，僅依靠C1化合物無法有效補(bǔ)充損失的碳流，因此，Kalyuzhnaya 等提出需要進(jìn)一步重構(gòu)碳代謝流來保證其高效生長。2018 年，Meyer 等［17］通過計算引導(dǎo)的多重敲除方法來設(shè)計可吸收甲醇的大腸桿菌菌株，并實(shí)驗(yàn)證明了在經(jīng)改造和進(jìn)化后，菌株在指數(shù)增長過程中，甲醇顯著參與到核心代謝中（24%轉(zhuǎn)化為6-磷酸己糖）。Woolston等［18］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中再生的5-磷酸核糖不足以維持甲醇的同化過程，他們通過表達(dá)突變的核糖單磷酸途徑的景天酮糖雙磷酸酶（sedoheptulose bisphosphatase）解決了該問題。2020年，Chen 等［11］以代謝穩(wěn)健性為標(biāo)準(zhǔn)對大腸桿菌基因進(jìn)行了重排，經(jīng)人工進(jìn)化后得到了可有效利用甲醇作為唯一碳源的菌株，該甲基營養(yǎng)型大腸桿菌可以8 h的倍增時間生長，得到較高OD。通過RuMP循環(huán)，改良后的工程菌可脫離傳統(tǒng)的葡萄糖碳源生長模式，單一使用以甲醇為代表的C1化合物，在合成醇類等高附加值的有機(jī)物方向上，展現(xiàn)出一定的潛力。

圖1 RuMP途徑、ED途徑、EMP途徑（a）和絲氨酸循環(huán)（b）［19］Fig.1 C1 compound assimilation through ribulose-5-phosphate(RuMP),ED(Entner-Doudoroff),EMP(Embden-Meyerhof-Parnas)pathway(a)and serine cycle(b)[19]

1.2 絲氨酸循環(huán)

絲氨酸循環(huán)（serine cycle）是一條經(jīng)自然進(jìn)化形成、對氧氣供應(yīng)不敏感的代謝途徑，如圖1（b）所示。絲氨酸循環(huán)通過絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶固定由5，10-亞甲基四氫葉酸攜帶的C1化合物；其碳同化過程經(jīng)歷二碳、三碳、四碳代謝過程最終生成乙酰輔酶A。其中，二碳代謝過程為乙醛酸通過轉(zhuǎn)氨過程轉(zhuǎn)化為甘氨酸；三碳代謝過程為甘氨酸轉(zhuǎn)化為絲氨酸并進(jìn)一步脫水轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）；四碳代謝過程為PEP 進(jìn)一步羥化生成草酰乙酸（OAA），隨后分裂為兩個二碳單元完成循環(huán)并輸出最終產(chǎn)物乙酰輔酶A。因此，絲氨酸循環(huán)可以從多組C1化合物合成乙酰輔酶A 而不會造成碳損失。2018 年，Yu 等［19］發(fā)現(xiàn)僅構(gòu)建 RuMP 循環(huán)很難支持微生物在只有C1化合物的環(huán)境下生長，為了補(bǔ)充碳流，他們在大腸桿菌中表達(dá)了改進(jìn)的扭脫甲基桿菌AM1 中的絲氨酸循環(huán)，使得改良后的工程菌能夠同化C1化合物，從而提高了乙酰輔酶A 的產(chǎn)量。然而，對于絲氨酸循環(huán)循環(huán)系統(tǒng)，每生產(chǎn)一份乙酰輔酶A 需要消耗3個ATP分子。這降低了生物質(zhì)和產(chǎn)量，因?yàn)榇蟛糠諧1底物需要被氧化以產(chǎn)生所需的ATP 而不是被同化為生物質(zhì)。因此，對于使用絲氨酸循環(huán)同化C1化合物的微生物來說，仍需要關(guān)注優(yōu)化ATP 補(bǔ)充從而達(dá)到高效生長與生產(chǎn)。

1.3 其他同化一碳化合物的天然途徑

除了RuMP 循環(huán)及絲氨酸循環(huán)外，一些甲酸、甲烷營養(yǎng)菌中還存在著同化一碳化合物的其他天然途徑［20］。例如Methanococcus maripaludis在利用二氧化碳或甲酸生產(chǎn)甲烷的過程中存在一個中間體甲基THMPT，甲基THMPT 會在一氧化碳脫羧酶/乙酰輔酶A合酶復(fù)合物的幫助下結(jié)合一個CO和一個 CoA 直接合成乙酰輔酶 A［21］。又比如Cupriavidus necator可以利用 1，5-二磷酸核酮糖（ribulose-1，5-bisphosphate，RuBP）結(jié)合二氧化碳，在1，5-二磷酸核酮糖羧/加氧酶的作用下轉(zhuǎn)化成磷酸甘油醛［22］。由于提供的能量和還原力的不足，想要利用這些途徑同化一碳化合物進(jìn)行生產(chǎn)難度很大。

1.4 以C1化合物作為底物進(jìn)行生產(chǎn)

通過RuMP 或絲氨酸循環(huán)，可以形成一個C1化合物為底物的同化平臺，從而改進(jìn)傳統(tǒng)的化學(xué)合成工藝。例如，甲基營養(yǎng)型大腸桿菌在生物燃料方面可成為一個有潛力的工程菌株。通?；瘜W(xué)合成方法需要復(fù)雜的反應(yīng)條件，使用C1化合物建立碳碳鍵的化學(xué)方法需要高溫和高壓［23］，建立這樣的反應(yīng)條件往往伴隨著巨大的投資，反應(yīng)時使用的物料也通常為具有高碳排放量的化石燃料。相反，生物合成的反應(yīng)條件則更溫和，改良后的工程菌利用絲氨酸循環(huán)、RuMP 循環(huán)及甲醇縮合循環(huán)將C1化合物導(dǎo)向其他代謝途徑并最終轉(zhuǎn)化為相應(yīng)產(chǎn)物，例如，碳鏈更長的化合物、氨基酸、代謝中間產(chǎn)物等。采用重新設(shè)計代謝系統(tǒng)的方法來改造微生物，可以提高產(chǎn)量和生產(chǎn)率，從而大幅度降低對原材料需求、工廠規(guī)模與運(yùn)營成本［24］；相較于傳統(tǒng)方法，這種新的碳循環(huán)在使用成本與環(huán)境保護(hù)方面更具潛在優(yōu)勢。目前通過甲基營養(yǎng)型大腸桿菌合成特定化合物仍然是一個挑戰(zhàn)，表1總結(jié)了目前由甲基營養(yǎng)性菌發(fā)酵生產(chǎn)的特定有機(jī)醇與有機(jī)酸的產(chǎn)量與方法，例如丁醇、甲羥戊酸（MEV）、γ-氨基丁酸（GABA）、2-羥基異丁酸、3-羥基異丁酸、D-乳酸等。其中，甲羥戊酸是萜類化合物的重要平臺化合物［29］；其中，GABA 在哺乳動物中充當(dāng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，并參與控制神經(jīng)元的生長和成熟。是作為調(diào)節(jié)GABA-谷氨酸平衡紊亂的重要治療藥物［31］。然而，目前可同化甲醇的天然微生物的代謝途徑同樣涉及二氧化碳的損失或ATP 的消耗［32］。因此，當(dāng)克隆RuMP和絲氨酸循環(huán)時仍然需持續(xù)優(yōu)化碳流以提高效率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雖然大腸桿菌通過基因克隆的方法能以C1化合物作為唯一碳源生長，但一些氧化型的C1化合物如甲醇、甲醛等對于微生物存在一定毒性。當(dāng)微生物生長進(jìn)入平臺期時，過量存在的C1化合物會引起DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)（DNA protein crosslinking）［11］。若使用這類甲基營養(yǎng)性大腸桿菌進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，仍需提高其對C1化合物的耐受性。2018 年，Cui 等［29］通過對 α-變形桿菌甲基桿 菌 AM1 （α-proteobacteriumMethylobacterium extorquensAM1）使用自適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化（ALE，adaptive laboratory evolution）的方法提高了甲基營養(yǎng)性菌對甲醇的耐受性，同時得到了2.27 g/L 甲羥戊酸（MEV）的產(chǎn)量。同樣，微生物對發(fā)酵產(chǎn)物的耐受性也可以嘗試通過類似ALE的方法提高［26］。雖然利用C1化合物平臺生產(chǎn)有機(jī)醇與有機(jī)酸仍然具有挑戰(zhàn)性，但這項(xiàng)工作為微生物固碳提供了思路與可能性。

表1 由甲基營養(yǎng)性菌發(fā)酵生產(chǎn)特定有機(jī)醇與有機(jī)酸實(shí)例Tab.1 Summary of methylotrophic production data

2 木糖代謝途徑為代表的非磷酸化途徑

2.1 木糖的代謝途徑

木質(zhì)組織中的半纖維素是地球上最豐富的生物質(zhì)資源之一，與生產(chǎn)第一代生物燃料的原料玉米、甘蔗相比，半纖維素可以很好地緩和“糧食與燃料沖突”的問題［33-34］，因此，由可再生半纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)的第二代生物燃料有希望作為常規(guī)化石燃料的可持續(xù)替代品［35-38］。半纖維素水解的主要產(chǎn)物是葡萄糖和木糖，雖然木糖是植物細(xì)胞壁中含量第二高的糖，占木質(zhì)生物質(zhì)總碳水化合物的35%，但是由于存在葡萄糖的代謝阻遏，在利用葡萄糖和木糖同時發(fā)酵時，即使使用高濃度的木糖，其利用率仍然很低。而木質(zhì)纖維素水解液中往往是混合糖體系，這種低效發(fā)酵的問題限制了木質(zhì)生物燃料的商業(yè)生產(chǎn)，是利用木糖作為發(fā)酵原料需要面臨的重大挑戰(zhàn)。木質(zhì)纖維素水解體系中還常帶有弱酸、呋喃、苯酚和醛等副產(chǎn)物，對菌株生長有明顯的抑制作用［39］，因此開發(fā)對抑制劑有高耐受性的菌株也是一個很有潛力的方向。最近，Li 等［40］利用適應(yīng)性進(jìn)化的方法提高了菌株對抑制劑的耐受性，并且進(jìn)一步提高了木糖的利用率；Liu 等［41］則通過雜交的方法使木糖發(fā)酵菌株獲得了對抑制劑的耐受性。

自然界中至少存在以下5 種木糖的代謝途徑（圖2）。在大腸桿菌（Escherichia coli）中［42-43］，木糖首先被木糖異構(gòu)酶（XylA）異構(gòu)化成為木酮糖，通過木酮糖激酶（XylB）磷酸化成為5-磷酸木酮糖（X5P）后進(jìn)入磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway），其下游的6-磷酸果糖（F6P）和3-磷酸甘油醛（G3P）均可通過糖酵解途徑（glycolysis）進(jìn)入三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）。在丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中還存在磷酸轉(zhuǎn)酮酶途徑（phosphoketolase pathway）［44-45］，能將5-磷酸木酮糖裂解為乙酰磷酸（acetyl-P）和3-磷酸甘油醛。在釀酒酵母及某些真菌中［46］，木糖的異構(gòu)化分為兩步，首先由木糖還原酶還原成為木糖醇（xylitol），再經(jīng)過木糖醇脫氫酶氧化生成木酮糖，最后由磷酸化途徑進(jìn)入磷酸戊糖途徑。以三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵中間產(chǎn)體α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，2-KG）作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，以上的木糖磷酸化途徑均需要10個以上的酶促反應(yīng)，且最終2-KG 的理論摩爾產(chǎn)率也僅有83%。第4種途徑是Weimberg途徑，這是一種非磷酸化的途徑，最早由Weimberg［47］于1961年在脆弱假單胞菌（Pseudomonas fragi）中發(fā)現(xiàn)。木糖首先由木糖脫氫酶（XylB）脫氫生成木糖醇內(nèi)酯，再由木糖醇內(nèi)酯酶（XylC）開環(huán)生成木糖酸，木糖酸被木糖酸脫水酶（XylD）脫水生成2-氧代3-脫氧木糖酸，后者經(jīng)過2-氧代-3脫氧木糖酸脫水酶（XylX）進(jìn)一步脫水生成2-酮戊二酸半醛，最后經(jīng)過2-酮戊二酸半醛脫氫酶（XylA）脫氫生成2-KG。該途徑僅通過5 個酶促步驟就能將木糖以100%的理論產(chǎn)率生成2-KG。第5 種途徑是 Dahms 途徑，1974 年，Dahms［48］在一種未分類的假單胞菌中發(fā)現(xiàn)其包含了D-木糖脫氫酶、D-木糖醛酸脫水酶和一種新的醛縮酶（YghH/YagE），該酶可以將2-氧代-3脫氧木糖酸裂解為丙酮酸和乙醇醛。該途徑在2-氧代-3-脫氧木糖酸處與Weimberg途徑分開，經(jīng)脫羧酶裂解后生成丙酮酸，丙酮酸脫羧后生成乙酰輔酶A 進(jìn)入TCA 循環(huán)。對比這5種途徑，非磷酸化途徑顯然較磷酸化途徑步驟更少，理論內(nèi)源代謝中間體2-KG 的產(chǎn)率更高，因此，開發(fā)非磷酸化途徑在生物生產(chǎn)中具有可觀的潛力［49］。

圖2 不同微生物的木糖代謝途徑Fig.2 Metabolic pathways of xylose in different microorganisms

2.2 釀酒酵母及運(yùn)動發(fā)酵單胞菌在木糖發(fā)酵方面的研究進(jìn)展

釀酒酵母具有耐酸、穩(wěn)健性好的優(yōu)點(diǎn)，適合工業(yè)化發(fā)酵，是一種重要的真核模式生物［50］。酵母利用木糖發(fā)酵的研究主要集中在酵母自身的還原-脫氫酶途徑，以及外源表達(dá)的異構(gòu)酶途徑這兩個方面［51］。前者由于木糖還原酶需要輔因子NADPH 而木糖醇脫氫酶需要輔因子NAD+，該途徑的過表達(dá)會導(dǎo)致輔因子失衡。為解決這個問題，改變木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的輔因子偏好，調(diào)整它們的表達(dá)水平，操作內(nèi)源性氧化還原酶的途徑和引入異源NADH 依賴的反應(yīng)等方式都是可行的策略［52-53］。Zha 等［54］通過進(jìn)化工程，提高了利用還原-脫氫酶途徑從木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量。后者的木糖異構(gòu)酶在催化反應(yīng)時具有一步轉(zhuǎn)化、不依賴輔因子的優(yōu)點(diǎn)，而且不會積累木糖醇，在生產(chǎn)乙醇時更有優(yōu)勢。然而只有少數(shù)異源木糖異構(gòu)酶可以在釀酒酵母中功能性表達(dá)，而且酶的活性普遍偏低，篩選出高活性的木糖異構(gòu)酶是該途徑面臨的一個瓶頸問題。最近，Hou 等［55］及Katahira 等［56］在牛瘤胃和昆蟲腸道內(nèi)容物的基因組文庫中鑒定出了具有高體內(nèi)活性的木糖異構(gòu)酶。在近幾十年中，一些工程菌株在纖維素水解物中的發(fā)酵性能通過各種工程方法得到顯著增強(qiáng)［57-59］。然而，低效的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)、葡萄糖的代謝阻遏、下游途徑效率低等都是限制木糖發(fā)酵的因素，因此設(shè)計沒有葡萄糖抑制的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者克服葡萄糖的代謝阻遏進(jìn)一步提高葡萄糖和木糖共同發(fā)酵時的利用率是開發(fā)釀酒酵母轉(zhuǎn)化木糖的一個重要方向［60-62］。Zha 等［63］在釀酒酵母中外源表達(dá)了來自的Neurospora crassa的編碼纖維糊精轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的CDT-1基因，細(xì)胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的GH1-1基因和來自Scheffersomyces stipitis的編碼木糖還原酶的XYL1基因，減輕了葡萄糖的抑制。

運(yùn)動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）比釀酒酵母有更高的乙醇耐受性，而且發(fā)酵時的碳源轉(zhuǎn)化率很高，也是發(fā)酵乙醇的常用菌種。雖然運(yùn)動發(fā)酵單胞菌本身沒有木糖代謝通路，但是可以通過異源表達(dá)木糖代謝途徑的方式來克服。運(yùn)動發(fā)酵單胞菌以木糖和葡萄糖的混合物作為原料發(fā)酵時，木糖代謝途徑同樣會受到葡萄糖的抑制。為解決葡萄糖的抑制問題，Dunn等［64］構(gòu)建了減輕葡萄糖代謝阻遏的工程菌株，減少了木糖醇的產(chǎn)量從而改善木糖的發(fā)酵效率。除了抑制問題，木糖的運(yùn)輸也是阻礙運(yùn)動發(fā)酵單胞菌有效利用木糖的瓶頸問題。據(jù)報道，野生運(yùn)動發(fā)酵單胞菌運(yùn)輸木糖用的是GLF（葡萄糖促進(jìn)擴(kuò)散蛋白），該蛋白對葡萄糖具有更高的親和力而導(dǎo)致葡萄糖對木糖的競爭性抑制［65］。Dunn 等［65］高表達(dá)異源的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Young 等［66］改造己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以增加該蛋白對木糖的親和力，從木糖轉(zhuǎn)運(yùn)的角度入手，分別提高了木糖在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌和酵母中的利用率。最近，Sarkar 等［67］利用ALE 方法得到了比親本利用率高1.65 倍的進(jìn)化菌株，并且在此基礎(chǔ)上引入木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，得到了在用雙糖發(fā)酵的條件下，木糖比利用率［2.04 g/（g·h）］與葡萄糖［2.49 g/（g·h）］相當(dāng)?shù)木?，產(chǎn)物乙醇滴度也達(dá)到了47.4 g/L［68］。

2.3 木糖非磷酸化代謝途徑的研究進(jìn)展

Tai等［69］利用木糖非磷酸化途徑在大腸桿菌內(nèi)構(gòu)建了阿拉伯糖和半乳糖醛酸的非磷酸化途徑。通過敲除編碼異檸檬酸脫氫酶的基因（ICD）以切斷2-KG 的供應(yīng)，從而構(gòu)建α-酮戊二酸營養(yǎng)缺陷型的菌種作為篩選平臺，在該菌中轉(zhuǎn)入Weimberg 途徑相關(guān)的酶可以篩選對D-木糖、L-阿拉伯糖和D-半乳糖醛酸利用率更高的菌株。同時利用該平臺從Burkholderia xenovorans菌中鑒定出了一個活性更強(qiáng)的非磷酸化木糖操縱子。這是首次在大腸桿菌內(nèi)通過完全非磷酸化途徑將D-木糖、L-阿拉伯糖和D-半乳糖醛酸同化為生物燃料的報道。Liu等［70］也通過6 個酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了從木糖到1，4-丁二醇的生產(chǎn)途徑。Wang等［71］在此基礎(chǔ)上引入二醇脫水酶來優(yōu)化2-KG 下游生成1，4-丁二醇的途徑，從木糖出發(fā)從頭合成了209 mg/L的1，4-丁二醇。Wang等［72］在大腸桿菌中利用該途徑最終實(shí)現(xiàn)了3，4-二羥基丁酸的生產(chǎn)。盡管這些非磷酸化代謝途徑僅僅經(jīng)過不到6個酶促步驟，且理論摩爾產(chǎn)率都高達(dá)100%，但非磷酸化代謝途徑的生物合成效率仍然不是很理想。

為解決木糖低效發(fā)酵的問題，Wang等［73］研究了其中3 種木糖代謝途徑，發(fā)現(xiàn)異構(gòu)酶途徑和Weimberg 途徑之間存在協(xié)同作用。前者雖然生產(chǎn)2-KG 效率低下但是能夠提供足量的乙酰輔酶A，而后者恰恰相反。他們證明兩種途徑在前體供應(yīng)中是相互補(bǔ)充的。以戊二酸作為終產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用異構(gòu)酶途徑和Weimberg 途徑時戊二酸的產(chǎn)量僅104 mg/L 和209 mg/L，而結(jié)合使用兩種途徑時戊二酸的產(chǎn)量達(dá)到了602 mg/L，甚至超過了從葡萄糖代謝途徑獲得的戊二酸產(chǎn)量（420 mg/L），該項(xiàng)工作提供了一種提高木糖代謝效率的新穎策略。Bai 等［74］針對 D-木糖和 L-阿拉伯糖篩選了最有效的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，合成了高效的木糖操縱子，利用非磷酸化途徑實(shí)現(xiàn)了中康酸的高產(chǎn)合成，該工作表明運(yùn)輸系統(tǒng)可能是非磷酸化代謝途徑利用過程中的限速步驟之一。

自20 世紀(jì)中葉以來，非磷酸化代謝一直未見廣泛應(yīng)用。得益于新平臺的開發(fā)，更多的非磷酸化基因簇得以確定，這也擴(kuò)大了可利用代謝途徑的數(shù)量。并且，這些酶中的許多酶尚未經(jīng)過蛋白質(zhì)工程研究或選擇性進(jìn)化，因此在未來有很大的發(fā)展空間。使用半纖維素等生物質(zhì)作為發(fā)酵原料，實(shí)際上為微生物提供了一種混雜多種糖的發(fā)酵體系。在該體系中，理想狀態(tài)下葡萄糖主要用于細(xì)胞生長，而木糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸則直接用于產(chǎn)品生產(chǎn)。引入非磷酸化代謝是提高糖利用效率的一種方法，但是需要將這些屬性與菌株工程結(jié)合起來，以提高菌株對半纖維素生物質(zhì)水解產(chǎn)物中存在的抑制物（例如乙酸）的適應(yīng)性［75］。

3 酮酸/氨基酸途徑

3.1 Ehrlich 途徑

酵母和乳酸菌在食品發(fā)酵中除了生成乙醇，還常常伴隨著脂肪醇和芳香醇的形成，這些物質(zhì)被稱為雜醇，發(fā)酵食品獨(dú)特的風(fēng)味和香氣正是由此而來［76］。這些雜醇的代謝途徑由Ehrlich 首次提出［77］：最開始氨基酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下生成α-酮酸，由于這些α-酮酸不能重新定向到中心代謝中去，在被排除體外之前經(jīng)由Ehrlich 途徑的脫羧酶脫去CO2成為對應(yīng)的醛，而后經(jīng)還原成為雜醇或進(jìn)一步氧化得到相應(yīng)的雜酸。

上述步驟中的脫羧不可逆，是該途徑的決速步驟。釀酒酵母中的5 個脫羧酶基因（PDC1、PDC5、PDC6、ARO10和THI3）中，前 3 個編碼丙酮酸脫羧酶［78-80］。Vuralhan 等［81］發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母中ARO10是唯一的適用于Ehrlich 途徑的脫羧酶基因，其轉(zhuǎn)錄譜與培養(yǎng)物中的β-酮酸脫羧酶活性密切相關(guān)；他們運(yùn)用遺傳、生理和生化方法對Arop10p 進(jìn)行全面表征，證實(shí)其是一種具有廣泛底物特異性的脫羧酶［82］。Iraqui 等［83］發(fā)現(xiàn)ARO80的36bp 上游激活序列對于促進(jìn)芳香族氨基酸轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)是必要且充分的，證明Aro80p 是介導(dǎo)芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶和脫羧酶的轉(zhuǎn)錄激活因子。Mojzita等［84］證明Thi3p 參與釀酒酵母中硫胺素穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，而且與 Pdc1p、Pdc5p、Pdc6p 和 Aro10p 定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不同，Nosaka 等［85］觀察到 Thi3p 定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，證明Thi3p 可能起調(diào)節(jié)作用而非催化作用。在乳酸菌中KCDA編碼一種β-酮酸脫羧酶，被證明也具有廣泛的底物特異性，且對支鏈α-酮酸表現(xiàn)出的活性最高［86］。

3.2 酮酸途徑

然而，天然的Ehrlich 途徑合成的雜醇濃度較低，不適用于生產(chǎn)。為了探究該途徑用于生產(chǎn)的潛力，Atsumi等［87］在2008年開發(fā)了一種通過酶的組合和優(yōu)化來生產(chǎn)C3～C5醇類的策略。該策略合成醇的路徑首先是將2-酮酸通過2-酮酸脫羧酶（KDC）脫羧轉(zhuǎn)化為少一個碳原子的醛，然后通過醇脫氫酶（ADH）還原為醇（圖3）。由于脫羧酶在植物、酵母和真菌中常見，而細(xì)菌中很少見［88］，他們篩選了來自釀酒酵母、乳酸菌和丙酮酸梭菌內(nèi)的5 種KDC，結(jié)果證明來自釀酒酵母的ARO10和來自乳酸菌的KIVD 具有較好的脫羧活性和較寬的底物范圍，且KIVD 的催化活性更高。通過KIVD，合成了1-丙醇、1-丁醇、異丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和 2-苯基乙醇。3-甲基-1-丁醇［89］、異丁醇［90］和 2-甲基-1-丁醇［91］的生產(chǎn)也在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化。

圖3 酮酸/氨基酸途徑合成醇、二醇Fig.3 Ketoacid/amino acid pathway for production of alcohol and diol

Zhang 等［92］通過設(shè)計 2-異丙基蘋果酸合酶的鏈延伸活性，從而合成碳鏈更長的酮酸，這個鏈延長的反應(yīng)來自于亮氨酸的生物合成，其作用是將酮異戊酸轉(zhuǎn)化為酮異己酸。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)僅僅突變反應(yīng)的第1 個酶2-異丙基蘋果酸合酶是必需的，隨后的酶由于其非特異性催化的特點(diǎn)可以接受更大的底物，然后再基于上述的酮酸途徑，構(gòu)建了生產(chǎn)C5～C8的長鏈醇的代謝通路。

除了醇之外，酮酸途徑還能用來生產(chǎn)羧酸。Xiong 等［93］通過對2-酮酸脫羧酶的工程選擇性和對雜合醛脫氫酶的篩選，構(gòu)建了同時產(chǎn)生C5和C6酸的合成途徑。特別地，異戊酸的產(chǎn)量達(dá)到32 g/L（0.22 g/g的葡萄糖產(chǎn)率），達(dá)到了理論產(chǎn)率的58%。

3.3 氨基酸途徑

氨基酸生產(chǎn)方法主要有蛋白質(zhì)水解、化學(xué)合成及微生物發(fā)酵。隨著技術(shù)不斷革新，氨基酸的市場份額也逐年增長。Wendisch 等［94］預(yù)計全球氨基酸需求在2017—2022 年期間將以5.6%的年增長率增長，到2022 年將達(dá)到256 億美元，其中動物飼料氨基酸為增長最快的市場。各種氨基酸中年產(chǎn)量最高的谷氨酸在2020 年的年產(chǎn)量高達(dá)321萬噸。

由于酮酸途徑本身建立在氨基酸合成途徑上，而氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本組成單位，也是幾乎所有微生物的主要內(nèi)源性代謝產(chǎn)物之一，故氨基酸途徑具有很好的生物體相容性，利用氨基酸途徑在諸如酵母/枯草芽孢桿菌和熱纖梭狀芽孢桿菌內(nèi)的工作也都有報道［95-97］。

基于氨基酸的代謝，類似3.2 節(jié)中的酮酸途徑，Wang 等［98］于 2020 年提出了一種合成 C3～C5ω-二醇的策略：首先將帶電氨基酸α位的羧基由脫羧酶脫去得到ω-氨基酸或者ω-二胺，然后通過氧化還原反應(yīng)將氨基和羧基轉(zhuǎn)化為ω-羥酸，最后經(jīng)過一步酶促反應(yīng)還原ω-羥酸生成ω-二醇（圖3）。這項(xiàng)工作中不僅提供了直接從7種氨基酸合成C3～C5ω-二醇的平臺，也驗(yàn)證了從糖到二醇途徑的可行性。由于CAR 對ω-羥酸的高效催化，使得上游氨基酸到ω-羥酸的步驟是這一途徑的瓶頸，為進(jìn)一步改善該平臺的實(shí)用性，需對上游通路進(jìn)行優(yōu)化?？尚械氖侄沃饕校和ㄟ^進(jìn)行其他遺傳操作提高微生物宿主中的氨基酸通量；或者直接將宿主替換為成熟的氨基酸高產(chǎn)菌株（如谷氨酸棒狀桿菌）實(shí)現(xiàn)；篩選更加高效的代謝酶來消除瓶頸。

除此之外，帶電氨基酸作為原料也被報道用于生產(chǎn)ω-羥酸、二羧酸、二胺和內(nèi)酰胺等［99-100］。例如，Yu 等［101］過量表達(dá)來源于共生梭菌（Clostridium symbiosm）的2-羥基戊二酸脫氫酶基因（HGDH）、2-羥基戊二酰輔酶A 脫水酶基因（HGDAB）、谷氨酸輔酶A 轉(zhuǎn)移酶基因（GCTAB）和酸性氨基球菌（Acidaminococcus fermentans）的2-羥基戊二酰輔酶A 脫水酶基因（HGDC）構(gòu)建了谷氨酸生物合成途徑，通過表達(dá)來自密螺旋體（Treponema denticola）的混雜反式雙鍵-CoA 還原酶基因（TER）和大腸桿菌的硫酯酶基因（TESA）成功生產(chǎn)了戊二酸。值得注意的是，與之前的酮酸途徑、氨基酸途徑不同，該途徑中沒有CO2損失，具有100%的碳效率。然而，該途徑的一個缺點(diǎn)是由于2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶的氧敏感性，其僅在厭氧條件下有生物活性。為了解決這個問題，厭氧誘導(dǎo)的NAR的啟動子被選用于表達(dá)編碼2-羥基戊二酰輔酶A 脫水酶及其激活因子的HGDABC基因，通過好氧-厭氧兩階段法生長得到的菌株可產(chǎn)生0.0116 g/L的戊二酸［102］。

4 β-氧化逆循環(huán)途徑

4.1 β-氧化途徑

β-氧化（β-oxidation，BOX）是生物體內(nèi)代謝脂肪酸的常見代謝途徑［103-104］。首先脂肪酸由?；o酶A合成酶活化生成酰基輔酶A硫酯；然后，?；o酶A 脫氫酶使用FAD 將酰基輔酶A 硫酯氧化為β-反式烯?；o酶A；接著通過烯?；o酶A 水合酶將其加成為3-羥基?；o酶A；3-羥基?；o酶A 經(jīng)由其脫氫酶氧化為3-氧代?；o酶A；最后經(jīng)由相應(yīng)的硫解酶分解成乙酰輔酶A 和碳原子減少2的?；o酶A。

4.2 β-氧化逆循環(huán)

利用β-氧化循環(huán)的逆途徑可以構(gòu)建許多生產(chǎn)特定產(chǎn)物的平臺［105-109］。Dellomonaco 等［110］證明BOX 的逆循環(huán)途徑（reversal ofβ-oxidation pathway，RBO）可用作合成直鏈醇、脂肪酸、1，3-二醇、3-羥基羧酸、3-氧代醇、3-氧代酸、反式-2-烯醇、反式-2 烯酸的代謝平臺（圖4）。他們首先敲除編碼分解代謝物阻遏因子Crp、全局調(diào)節(jié)蛋白ArcA 的基因，解除了其對β-氧化作用的調(diào)控，再通過引入乙酰乙酸代謝調(diào)劑蛋白AtoC 和脂肪酸代謝調(diào)節(jié)蛋白FadR 的突變體，實(shí)現(xiàn)了編碼大腸桿菌β-氧化循環(huán)的Fad 和Ato 調(diào)節(jié)子的組成型表達(dá)。另外，敲除了消耗乙酰輔酶A 并產(chǎn)生乙酸、乙醇和琥珀酸的競爭途徑。由于天然的3-氧代?；?CoA硫解酶是限速步驟，過表達(dá)編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶（途徑起始）和L-1，2，2-丙二醇氧化還原酶（用于將丁醛轉(zhuǎn)化為正丁醇）的天然YQEF和FUCO基因。由此生產(chǎn)了14 g/L 的正丁醇，每克葡萄糖的產(chǎn)量為0.33 g 的正丁醇。基因敲除和基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，YqeF（乙酰乙酰輔酶A 硫解酶）、FadB（3-羥?；o酶A 脫氫酶/烯酰輔酶A水合酶）和YdiO（潛在的輔酶酰基輔酶A 脫氫酶）主要催化反向β-氧化循環(huán)的反應(yīng)。因?yàn)槠鹗继兼満驮鲩L單元都由乙酰輔酶A 提供，故Dellomonaco 等檢測到的直鏈醇和長鏈脂肪酸都含有偶數(shù)個數(shù)的碳原子。在補(bǔ)充丙酸作為碳鏈的起始分子時，則可以檢測到碳鏈數(shù)為奇數(shù)的脂肪酸。

圖 4 β-氧化逆循環(huán)［110］Fig.4 Reversal of β-oxidation[110]

Clomburg 等［111］利用硫解酶（BktB）和硫酯酶（YdiI）結(jié)合其他β-氧化逆循環(huán)相關(guān)的酶構(gòu)建了RBS，并構(gòu)建了基于cumate 誘導(dǎo)的表達(dá)雙鍵還原酶的體系，從而建立了能夠生成C6～C10羧酸的平臺。在此基礎(chǔ)上額外表達(dá)不動桿菌SE19 的ChnD、ChnE 以及AlkBGT 對產(chǎn)物進(jìn)一步氧化，也為合成ω官能化羧酸如羥基酸、二元酸等提供了途徑，使產(chǎn)品進(jìn)一步多元化。例如，Clomburg等［111］通過過量表達(dá)Cupriavidus necator的硫解酶（BktB）大腸桿菌的雙功能3-羥酰基-CoA 脫氫酶/脫水酶（FadB）和反式雙鍵-CoA 還原酶（Ter）在大腸桿菌內(nèi)構(gòu)建了β-氧化逆循環(huán)。在此基礎(chǔ)上，通過異源表達(dá)烷烴單加氧酶、醇脫氫酶和醛脫氫酶實(shí)現(xiàn)了ω-氧化，在大腸桿菌中從甘油生產(chǎn)了0.17 g/L的1，6-己二酸。

Cheong等［112］發(fā)現(xiàn)，除了乙酰輔酶A以外，丙?；o酶A和乙醇酰輔酶A均能夠用作鏈增長單元參與β-氧化逆循環(huán)，他們將這些單元與不同的底物結(jié)合使用，從該途徑中生產(chǎn)了高達(dá)18 種不同的化合物。這也為該途徑用于合成特定非天然產(chǎn)物提供了生產(chǎn)策略。

相較于脂肪酸合成途徑［113-114］，β-氧化逆循環(huán)途徑在合成正構(gòu)醇時更有效率。前者低效率的原因在于合成丙二酰-ACP，2個碳原子供體用于鏈延長以及?；?ACP 中間體使用時，均需要轉(zhuǎn)化為游離酸并且再?；缓蟛拍苓€原為醇，這些步驟都是ATP 消耗的步驟，所以前者能量的利用效率不高。

5 聚酮化合物合酶途徑

5.1 PKS的種類及Ⅰ型PKS的反應(yīng)機(jī)理

PKS 是聚酮化合物合酶（polyketide synthase pathway），一共分為3 種類型，Ⅰ型PKS 是具有催化能力的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成模塊組合成的大合酶［115］。典型的Ⅰ型PKS最少包含一個負(fù)責(zé)建立單體選擇和負(fù)載的酰基轉(zhuǎn)移酶（AT）域，一個帶有40 個磷酸鳥嘌呤臂來攜帶新生聚酮鏈的酰基載體蛋白（ACP）域和一個酮合酶（KS）催化脫羧克萊森縮合反應(yīng)以延長碳鏈的結(jié)構(gòu)域。PKS巨合酶也可能包含幾個可選的催化結(jié)構(gòu)域，例如酮還原酶（KR）、脫水酶（DH）、烯酰還原酶（ER）和甲基轉(zhuǎn)移酶（CMT）。這些模塊順序組合在一起，可以單向或者迭代地連接各種?；o酶A的鏈增長單元。Ⅱ型PKS最少包含兩個酮合酶異二聚體（KS的α-亞基和β-亞基）和一個ACP結(jié)構(gòu)域，主要催化芳香聚酮化合物的生物合成［116］。Ⅲ型PKS 結(jié)構(gòu)簡單，是一種能夠重復(fù)使用的酮合酶（KS），該單一的KS域可以執(zhí)行Ⅰ型和Ⅱ型PKS基本域的所有功能［117］。

3 種 PKS 中對Ⅰ型 PKS 研究最為深入［118］。類似于脂肪酸的生物合成，PKS 在負(fù)載了?；?ACP中間體和酰基輔酶A 單元之間進(jìn)行克萊森縮合反應(yīng)，然后通過輔助結(jié)構(gòu)改變β-羰基的還原度，聚酮化合物通過KS 的巰基接受上游的ACP 的硫酯，進(jìn)行的硫酯交換反應(yīng)從上一個模塊轉(zhuǎn)移到下一個模塊，最后通過硫酯酶（TE）結(jié)構(gòu)域?qū)⒕弁衔飶难b配線中釋放出來，隨后通過下游的酶進(jìn)行后修飾，從而可以生產(chǎn)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的多種產(chǎn)品（圖5、圖6）［119-122］。

圖5 Ⅰ型PKS裝配線Fig.5 Assembly line of type Ⅰpolyketide synthase

圖6 以合成己二酸為例的PKS途徑Fig.6 PKS pathway for production of adipic acid

5.2 PKS產(chǎn)物多樣性的探索

天然PKS產(chǎn)物的多樣性主要來自于不同的氧化過程、環(huán)化方式以及后續(xù)的PKS 修飾。天然的AT結(jié)構(gòu)域的底物通常為丙二酰輔酶A和甲基丙二酰輔酶A，極少數(shù)情況下為乙基丙二酰輔酶A。Kalkreuter 等［123］對吡咯霉素 PKS 最后兩個模塊的AT結(jié)構(gòu)域進(jìn)行活性位點(diǎn)突變，改變了其對底物的選擇性，使其能夠特異性結(jié)合非天然的鏈增長單元（丙二酰類似物），首次合成了帶有兩個非天然鏈增長單元的全長聚酮化合物。Eng 等［124］使用含有混雜負(fù)載AT 的脂霉素合酶作為模型，在合成短鏈β-羥基酸的時候通過KR 交換將α-甲基的立體化學(xué)變化由反式變?yōu)榉词健argar 等［125］重新設(shè)計了部分還原的PKS模塊，通過還原回路的交換產(chǎn)生飽和的β-碳，在這項(xiàng)工作中他們使用鏈霉菌J1074 產(chǎn)生了165 mg/L的短鏈脂肪酸（2，4-二甲基戊酸）。Lünne等［126］在Claviceps purpurea中過表達(dá)聚酮化合物合酶的基因PKS7，生產(chǎn)了檸檬酸、檸檬酸乙酯等產(chǎn)品。Hagen 等［127］提出了一種通過質(zhì)譜監(jiān)測的方式來對每個模塊執(zhí)行的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行表征，從而能有效指導(dǎo)組裝PKS的功能系統(tǒng)。他們在一個PKS中的擴(kuò)展模塊部分引入了多種PKS 簇的異源還原結(jié)構(gòu)域，通過篩選的方式得到了一個能夠?qū)㈢牾］o酶A 和丙二酰輔酶A 合成己二酸的PKS。這些工作很大程度上擴(kuò)展了PKS平臺的綜合潛力。

6 總結(jié)與展望

本文描述了構(gòu)建人工代謝途徑以實(shí)現(xiàn)生物合成有機(jī)醇和有機(jī)酸的一些進(jìn)展。

雖然甲醇這類一碳有機(jī)物可從二氧化碳或者農(nóng)業(yè)食品加工業(yè)的廢料之中制備，成本較低，在大腸桿菌內(nèi)構(gòu)建RuMP循環(huán)為異養(yǎng)微生物固碳、有機(jī)廢料再利用提供了一種新的策略。但由于除扭脫甲基桿菌以外的多數(shù)菌對甲醇不耐受，利用甲醇作碳源進(jìn)行生物發(fā)酵仍然是一個巨大挑戰(zhàn)。

木糖廣泛存在于農(nóng)林業(yè)廢棄物中，利用木糖作為發(fā)酵原料也是一直以來研究的熱點(diǎn)。木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物用于發(fā)酵時混合糖對木糖利用率的抑制以及水解產(chǎn)物中對微生物的抑制物問題是該途徑面臨的一個挑戰(zhàn)。木糖的非磷酸化途徑酶促步驟少，碳原子的理論利用率高，將非磷酸化代謝引入宿主的代謝網(wǎng)絡(luò)有望提高木糖的代謝效率。

有機(jī)醇和有機(jī)酸是常見的生物燃料和重要的化工原料，其中乙醇是目前常見的生物燃料［128］，然而，隨著技術(shù)進(jìn)步，生產(chǎn)具有更好的燃燒性能的長鏈醇及脂肪酸替代乙醇將是未來生物質(zhì)能源的一個重要方向。近期報道中利用酮酸或氨基酸途徑生產(chǎn)醇、二醇和脂肪酸的平臺生產(chǎn)產(chǎn)率仍然較低，其商業(yè)化仍然面臨著酶催化活性低、代謝通量不足等挑戰(zhàn)。但這些平臺的出現(xiàn)擴(kuò)大了產(chǎn)物的多樣性，并為有機(jī)酸和有機(jī)醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的思路。

近年來人們通過表達(dá)編碼酰基-ACP 硫酯酶的異源基因，借由脂肪酸合成途徑來生產(chǎn)游離態(tài)脂肪酸。但是由于脂肪酸合成途徑遵循FAS 絡(luò)合物的重復(fù)循環(huán)催化，因此直接合成某個特定產(chǎn)物極具挑戰(zhàn)性。對比脂肪酸合成途徑，β-氧化逆循環(huán)途徑中由3-氧代?；o酶硫醇酶催化的用于鏈延長的非脫羧性克萊森縮合反應(yīng)直接消耗了乙酰輔酶A作為延伸單元。因此，β-氧化逆循環(huán)途徑的應(yīng)用規(guī)避了乙酰輔酶A 的耗能的羧化步驟，具有能量和還原當(dāng)量利用率高的優(yōu)點(diǎn)。目前為止，該途徑應(yīng)用面臨的最大挑戰(zhàn)是反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)量不高。乙酰輔酶A在β-氧化逆循環(huán)途徑中作為鏈增長單元，而同時又是細(xì)胞碳代謝中的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物。因此，未來宿主菌株的工程操作可能集中在作為該酶底物的?；o酶A和乙酰輔酶A的過量生產(chǎn)上，結(jié)合用下游的反應(yīng)步驟快速除去產(chǎn)物3-氧代?；o酶A的措施以及釋放的輔酶A 的有效循環(huán)措施，將大大增加合成代謝方向的通量。

通過PKS 系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)特定產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)生物學(xué)和合成生物學(xué)方面都是巨大的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。總的來說，由于其多模塊的特性，PKS 提供了一個通用的合成平臺。盡管全基因組測序的進(jìn)展導(dǎo)致PKS 不斷地被發(fā)現(xiàn)，但是很多PKS 的產(chǎn)物仍然不為人所知。而且由于PKS 復(fù)合體具有異常大的空間尺寸和柔韌性，很難對完整的PKS 酶及其相關(guān)催化狀態(tài)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。酶-底物的識別，模塊結(jié)構(gòu)域之間的相互作用等都是制約PKS 下一步研究的難題。盡管如此，PKS 平臺仍然不失為合成特定有機(jī)酸的一個有效方法。

以上的多條代謝途徑多來源于微生物的內(nèi)源代謝，因此可以探索廣泛的生物體作為生產(chǎn)宿主。這些合成途徑中的各項(xiàng)反應(yīng)種類繁多，諸如鏈增長、氧化、還原、環(huán)化等，所以理論上以特定分子為目標(biāo)建立新的代謝途徑是可行的。建立目標(biāo)產(chǎn)品的人工代謝途徑，可以類比有機(jī)合成，根據(jù)化學(xué)合成的路線進(jìn)行逆向分析，同時結(jié)合生物體內(nèi)的天然分子，利用酶的催化將前體與產(chǎn)物連接，從而搭建合成途徑。其中前體與底物之間的催化過程通常不是天然的，需要引入新的酶來催化該過程。這些酶可以是從多種異源的蛋白質(zhì)中篩選出來，也可以由催化類似反應(yīng)的同工酶對底物的非特異性來實(shí)現(xiàn)，還可以通過蛋白質(zhì)工程對酶進(jìn)行設(shè)計得到。由此構(gòu)建得到的人工代謝途徑再經(jīng)過代謝工程技術(shù)的優(yōu)化，從而得以提高產(chǎn)量和產(chǎn)率，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成。

可以預(yù)期，隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，元件庫的不斷擴(kuò)充，各項(xiàng)技術(shù)的日漸成熟，人工代謝途徑的設(shè)計、構(gòu)建和優(yōu)化將更加便捷、合理、高效。這將為生物合成有機(jī)醇和有機(jī)酸領(lǐng)域帶來重大突破，推動產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。