萬逸塵 ，許孔亮 ，鄭仁朝 ，鄭裕國(guó)

（1 浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，生物有機(jī)合成技術(shù)研究浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310014；2 浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江 杭州 310014）

化學(xué)工業(yè)是國(guó)民經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。隨著社會(huì)進(jìn)步和人民生活水平的提高，對(duì)化學(xué)品精細(xì)化、高端化、多樣化的需求日益旺盛。作為傳統(tǒng)化學(xué)合成技術(shù)的補(bǔ)充，環(huán)境友好的生物合成技術(shù)正引起普遍關(guān)注，成為實(shí)現(xiàn)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的重要突破口［1-3］。近年來，隨著合成生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程等現(xiàn)代生物技術(shù)的進(jìn)步，國(guó)內(nèi)外研究人員開發(fā)了一系列高性能的工業(yè)菌種和細(xì)胞工廠，滿足對(duì)醫(yī)藥化學(xué)品、日用化學(xué)品、食品和飼料添加劑、農(nóng)藥及其中間體等多種化學(xué)品生產(chǎn)的需要［4-5］。然而，由于細(xì)胞代謝高度網(wǎng)絡(luò)化、生長(zhǎng)偶聯(lián)依賴等瓶頸問題，體內(nèi)生物合成（全細(xì)胞生物合成）的物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)化效率往往難以滿足高效生產(chǎn)化學(xué)品的需求［6-10］。

體外生物合成（無細(xì)胞生物合成）是指以純化的酶或細(xì)胞提取物為催化劑，制備所需化學(xué)品的一種合成方法。由于避開了胞內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的影響，體外生物合成展現(xiàn)了催化效率高、物質(zhì)轉(zhuǎn)化率高等顯著優(yōu)勢(shì)［11-13］，能夠有效滿足化學(xué)品工業(yè)生產(chǎn)的需要。此外，通過酶元件的設(shè)計(jì)與組裝調(diào)控構(gòu)建新的人工合成途徑，使其具有途徑設(shè)計(jì)多樣、可控性強(qiáng)和酶元件來源豐富等特點(diǎn)。近年來，國(guó)內(nèi)外眾多研究團(tuán)隊(duì)通過構(gòu)建化學(xué)品體外生物合成系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了多種化學(xué)品的體外生物合成，如糖類化學(xué)品［14］、有機(jī)酸類化學(xué)品［15］和醇類化學(xué)品［16］等。本文分析總結(jié)了體外生物合成途徑設(shè)計(jì)的兩個(gè)重要原則，包括原子經(jīng)濟(jì)性原則和能量最優(yōu)原則；介紹了體外生物合成中用于酶元件組裝的3類常見的生物大分子，包括連接肽、蛋白支架和DNA 等；并介紹了近年來生物體外合成在化學(xué)品生產(chǎn)中的應(yīng)用案例，包括氨基葡萄糖［14］、甘油葡萄糖 苷［17］、α-酮戊二酸［15］、丙酮 酸［18］、 乙醇［16］、丙二醇［19］、Islatravir［20］和氮霉素［21］等。通過對(duì)體外生物合成的途徑設(shè)計(jì)、酶元件的組裝方式以及具體應(yīng)用案例的綜述，本文最后對(duì)化學(xué)品體外生物合成的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 體外生物合成途徑設(shè)計(jì)

途徑設(shè)計(jì)是構(gòu)建整個(gè)體外生物合成系統(tǒng)的關(guān)鍵所在。然而，面對(duì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同的化學(xué)品，很難設(shè)計(jì)出一條體外生物合成的“通用”途徑［22］。只有不斷積累前人的經(jīng)驗(yàn)，解決途徑設(shè)計(jì)中存在的每一個(gè)困難，體外生物合成系統(tǒng)的構(gòu)建才能取得進(jìn)展［22］。體外生物合成的途徑設(shè)計(jì)可以參考兩個(gè)重要的原則，即原子經(jīng)濟(jì)性原則和能量最優(yōu)原則。

1.1 原子經(jīng)濟(jì)性原則

作為“綠色化學(xué)”的重要概念之一，原子經(jīng)濟(jì)性是指在化學(xué)品合成過程中，合成方法和工藝應(yīng)被設(shè)計(jì)成能將原料盡可能多地轉(zhuǎn)化到最終產(chǎn)物中［23］。在化學(xué)品體外生物合成途徑設(shè)計(jì)中，可以考慮以下幾點(diǎn)以滿足原子經(jīng)濟(jì)性的需要：①選擇與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似的起始原料以提高原料利用效率；②設(shè)計(jì)理論轉(zhuǎn)化率高的合成途徑以提高原料的轉(zhuǎn)化率；③選用合適的酶元件以提高反應(yīng)的催化效率［24］。

圖1 參考原子經(jīng)濟(jì)性原則構(gòu)建的體外生物合成途徑Fig.1 Designing in vitro biosynthetic pathways via principle atom economy

除了代謝合成，生物體內(nèi)還存在將復(fù)雜的化學(xué)品代謝分解成簡(jiǎn)單分子的途徑。通過逆向構(gòu)建目標(biāo)化學(xué)品的分解途徑，篩選合適的酶元件，可實(shí)現(xiàn)由簡(jiǎn)單分子合成目標(biāo)化學(xué)品，該方法被稱為生物逆向合成（bioretrosynthesis）（圖 1 中）［29-30］。以2，3-二脫氧肌苷（去羥肌苷）的合成為例，Bachmann等［31］通過借鑒生物中肌苷分解成核糖的代謝路徑，在體外逆向構(gòu)建了以2，3-二脫氧核糖為底物，核糖激酶、磷酸戊糖變位酶和嘌呤核苷磷酸化酶為催化劑，設(shè)計(jì)了2，3-二脫氧肌苷的合成途徑。并通過對(duì)核糖激酶、磷酸戊糖變位酶和嘌呤核苷磷酸化酶的改造，提高了對(duì)非天然底物及中間體（2，3-二脫氧核糖）的選擇性并增加了底物周轉(zhuǎn)率，對(duì)2，3-二脫氧核糖的選擇性相較于改造前提升了9500 倍，同時(shí)2，3-二脫氧肌苷的產(chǎn)量也提升了50 倍。此外，Islatravir［20］、莫能菌素A（monension A）［32］等化學(xué)品的體外生物合成也借鑒了生物逆向合成的設(shè)計(jì)思路。

對(duì)于一些不改變起始原料的化學(xué)品合成路線，還可以重新設(shè)計(jì)其合成途徑，選擇合適的酶元件進(jìn)行催化，提高底物的轉(zhuǎn)化率以滿足原子經(jīng)濟(jì)性的需求（圖1 右）。以果糖的生產(chǎn)為例，目前工業(yè)上以淀粉為原料，通過淀粉水解酶和葡萄糖異構(gòu)酶兩種酶催化生產(chǎn)果糖，由于中間產(chǎn)物葡萄糖與終產(chǎn)物果糖的化學(xué)勢(shì)相近，導(dǎo)致該方法果糖的轉(zhuǎn)化率最高僅能達(dá)到50%左右。Moradian 等［22］重新設(shè)計(jì)了一條以淀粉為原料體外生物合成果糖的途徑，該路徑以淀粉磷酸化酶、葡萄糖變位酶、轉(zhuǎn)醛縮酶和3-磷酸甘油醛磷酸酶為催化劑，由于其中間體產(chǎn)物的化學(xué)勢(shì)都均高于果糖，且反應(yīng)均為可逆反應(yīng)，理論上其轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%。由于未篩選到對(duì)果糖-6-磷酸選擇性高的3-磷酸甘油醛磷酸酶，在最后一步選擇了對(duì)果糖-6-磷酸選擇性高的轉(zhuǎn)醛縮酶，并設(shè)計(jì)了基于3-磷酸甘油醛磷酸酶的甘油醛再生系統(tǒng)，使該體外生物合成系統(tǒng)的果糖∶葡萄糖比值達(dá)到了92∶8，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于商用的果糖生產(chǎn)途徑。Meng 等［33］通過借鑒前人的工作，將篩選到的對(duì)果糖-6-磷酸選擇性較好的熱穩(wěn)定性磷酸酶，與α-糖苷磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶3種酶聯(lián)用，最終使該淀粉磷酸化合成果糖的體外途徑的果糖∶葡萄糖比值達(dá)到2∶1。

此外，在化學(xué)品體外生物合成中，將多個(gè)酶組裝串聯(lián)在一起也是提高產(chǎn)物產(chǎn)率的方法之一［34］，能夠滿足體外生物合成的途徑設(shè)計(jì)中原子經(jīng)濟(jì)性的要求。酶催化串聯(lián)反應(yīng)源于大自然中生命有機(jī)體為了維持生命過程而進(jìn)化出的各種代謝通路，多酶催化串聯(lián)策略在復(fù)雜天然產(chǎn)物合成中的應(yīng)用已有相關(guān)綜述報(bào)道［35］。

1.2 能量最優(yōu)原則

作為生物體內(nèi)最主要的能量來源，化學(xué)品體外生物合成中常需要三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的參與。能量最優(yōu)原則是指在途徑設(shè)計(jì)中，合成方法和工藝應(yīng)被設(shè)計(jì)成不需要額外添加ATP或盡可能少地使用ATP［22］。

目前已開發(fā)了許多非ATP 依賴型的化學(xué)品體外生物合成的路徑，降低了原有路徑的成本。以磷酸二羥基丙酮合成為例，原有的合成路線以二羥基丙酮為原料，在二羥基丙酮激酶的催化下合成磷酸二羥基丙酮，該方法會(huì)消耗大量ATP。Wang 等［36］設(shè)計(jì)了一個(gè)非ATP-依賴型的體外生物合成系統(tǒng)，用以合成磷酸二羥基丙酮［圖2（a）］。該系統(tǒng)以淀粉作為原料，通過α-葡聚糖磷酸化酶將其磷酸化為葡萄糖-1-磷酸，再通過磷酸葡萄糖變位酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、焦磷酸磷酸果糖激酶以及D-果糖-1，6-二磷酸醛縮酶合成磷酸二羥基丙酮。該體外生物合成途徑無需額外添加ATP 及輔酶，具有一定優(yōu)勢(shì)。

圖2 參考能量最優(yōu)原則構(gòu)建體外生物合成途徑Fig.2 Designing in vitro biosynthetic pathways via principle energy optimization

對(duì)于一些需要ATP 參與的體外生物合成系統(tǒng)，可以通過構(gòu)建ATP 的循環(huán)再生系統(tǒng)或者重新設(shè)計(jì)合成途徑以減少ATP 用量，降低生產(chǎn)成本［37-38］。Zhang 等［39］在設(shè)計(jì)由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸合成谷胱甘肽的體外生物合成路線中，加入了一個(gè)由聚磷酸激酶和聚磷酸組成的ATP 循環(huán)再生系統(tǒng) ［圖 2（b）］［40］，可以使生成的二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）重新轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP。相較于昂貴的ATP，體外反應(yīng)進(jìn)程中消耗的僅僅是低成本的聚磷酸。此外，還可以重新設(shè)計(jì)合成途徑來減少ATP 用量，以L-乳酸的合成為例，傳統(tǒng)體外合成生產(chǎn)L-乳酸的反應(yīng)路徑為Embden-Meyerhof 路線［41］，該路線第 1 步需將葡萄糖磷酸化，而該步驟需要消耗ATP。Okano 等［42］重新設(shè)計(jì)從葡萄糖生產(chǎn)L-乳酸的體外生物合成路線，新設(shè)計(jì)的路線不再磷酸化葡萄糖，而是使用葡萄糖脫氫酶、葡萄糖酸脫水酶、2-酮-3-脫氧葡萄糖酸醛縮酶、甘油酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)行催化，該路徑ATP 使用量比原路徑少50%，從而降低了成本。

2 體外生物合成元件組裝

作為體外生物合成的重要催化元件，酶具有催化效率高、底物專一性強(qiáng)、環(huán)境溫和等優(yōu)點(diǎn)。眾所周知，生物體的代謝過程由多種酶協(xié)同完成，胞內(nèi)酶可以形成復(fù)雜的多酶復(fù)合體，其催化反應(yīng)高度有序，從而提高其催化效率［43］。因此，在化學(xué)品體外生物合成中，可以利用生物大分子將酶元件組裝構(gòu)建成多酶復(fù)合體，以起到提高整體反應(yīng)速率、避免副反應(yīng)、提高產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率、消除中間產(chǎn)物抑制等作用［44-45］。目前比較常見的用于多酶組裝的生物大分子主要有連接肽、蛋白支架和DNA等（圖3）。

由于數(shù)據(jù)的前一半數(shù)據(jù)受循環(huán)卷積影響,所有有效數(shù)據(jù)為后一半數(shù)據(jù)。此時(shí),用近端值減去濾波輸出,便可得到第p塊的誤差信號(hào)e(p),用一塊內(nèi)的累加值對(duì)濾波器系數(shù)進(jìn)行更新,如式(8)所示:

圖3 用于多酶組裝的生物大分子Fig.3 Biomolecules for multi-enzyme assembly

2.1 基于連接肽的元件組裝

在自然界發(fā)現(xiàn)的一些多酶復(fù)合體中，酶與酶之間是由一小段多肽（連接肽）進(jìn)行連接的［46-47］。連接肽可將異源酶連接起來，使酶元件之間緊密貼近（圖3 左上）［45］，這種方式構(gòu)建的多酶系統(tǒng)可避免因多酶直接融合而產(chǎn)生的蛋白錯(cuò)誤折疊、活性降低甚至失活等問題［48］。Fan 等［49］在甲醇合成果糖-6-磷酸的體外合成系統(tǒng)中，使用柔性連接肽（GGGGS）3和（GGGGS）6將甲醇脫氫酶（methanol dehydrogenase，Mdh）、6-磷酸己糖合酶（hexulose-6-phosphate synthase，Hps）和 6-磷酸-3-己糖異構(gòu)酶（6-phospho-3-hexuloisomerase，Phi）順序連接，構(gòu)建了Mdh-Hps-Phi三酶組裝體。連接肽使酶與酶之間產(chǎn)生協(xié)同作用，提高了該體外合成系統(tǒng)的分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢(shì)，其甲醇氧化速率是游離酶混合物的5.8 倍，總反應(yīng)速率提升了 1.6 倍。Lerchner 等［50］使用較短的連接肽將2，2，6-三甲基環(huán)己烷二酮還原酶和ω-氨基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行組裝構(gòu)建多酶系統(tǒng)，用以催化異山梨醇（300 mmol/L）合成山梨醇二胺，其轉(zhuǎn)化率是游離酶混合物的2倍。

2.2 基于蛋白支架的元件組裝

在自然界中，蛋白支架（scaffoldin）是組成纖維小體結(jié)構(gòu)的多肽，其上的粘連蛋白（cohesin）可與錨定蛋白（dockerin）產(chǎn)生特異性親和結(jié)合［51-52］。通過在酶元件上設(shè)計(jì)連接錨定蛋白，在蛋白支架上設(shè)計(jì)與其對(duì)應(yīng)的粘連蛋白，可以構(gòu)建具有級(jí)聯(lián)順序的多酶系統(tǒng)，并通過底物通道效應(yīng)提高酶催化效率［53-54］。You 等［54］在 3-磷酸甘油醛合成果糖-6-磷酸的體外生物合成系統(tǒng)中，基于蛋白支架設(shè)計(jì)了磷酸丙糖異構(gòu)酶、醛縮酶、果糖-1，6-雙磷酸酶的多酶催化系統(tǒng)，其對(duì)果糖-6-磷酸的合成速率約是游離酶的10 倍，轉(zhuǎn)化率約為8 倍。Jeong 等［55］將β-瓊脂酶、脫水半乳糖苷酶和 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶通過設(shè)計(jì)的蛋白支架組裝成三酶復(fù)合結(jié)構(gòu)，并以D-半乳糖為原料合成D-塔格糖，D-塔格糖的濃度可高達(dá)4.2 g/L，與游離酶混合物相比，其產(chǎn)量增加了1.4倍。

2.3 基于DDNNAA的元件組裝

利用DNA 堿基之間的特異性結(jié)合，對(duì)其序列進(jìn)行設(shè)計(jì)可以自組裝成多種結(jié)構(gòu)，如DNA 支架［56］、DNA 折紙或 DNA 水凝膠［57］等。在體外生物合成中，利用酶表面具有的活性殘基與DNA 寡核苷酸序列間的生物結(jié)合，可以使不同酶組裝成多酶復(fù)合結(jié)構(gòu)，并控制其相對(duì)位置［58］。相較于上述兩種酶元件組裝方式，使用DNA 組裝多酶系統(tǒng)可以精準(zhǔn)控制酶的空間位置和酶之間的距離，降低傳質(zhì)阻力以達(dá)到最理想的催化效率［59］。Xin等［60］成功開發(fā)了一種新的DNA組裝策略，通過組裝葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶，催化葡萄糖高效轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸。這兩種酶被組裝在一個(gè)帶有支撐臂結(jié)構(gòu)的DNA 中，通過改變支撐臂的長(zhǎng)度控制中間產(chǎn)物的擴(kuò)散距離，使酶活相較于游離酶提高了88%。Fu等［61］在果糖-6-磷酸合成蘋果酸的體外合成系統(tǒng)中，將果糖-6-磷酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶組裝在一個(gè)DNA 支架上，并在酶之間設(shè)計(jì)了一個(gè)帶有輔助因子的擺動(dòng)DNA 臂。這種人工構(gòu)建的DNA 搖臂可以促進(jìn)底物在兩種偶聯(lián)的脫氫酶之間轉(zhuǎn)移，其酶活相比游離酶提高了25倍［62］。

3 體外生物合成的應(yīng)用前景

利用上述合成途徑和組裝策略，國(guó)內(nèi)外研究人員構(gòu)建了一系列的化學(xué)品體外生物合成系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了多種大宗化學(xué)品的綠色合成。本文將對(duì)糖類、有機(jī)酸、醇類及其他化學(xué)品的體外生物合成的應(yīng)用作舉例介紹，主要包括氨基葡萄糖、甘油葡萄糖苷、丙酮酸、α-酮戊二酸、丙二醇、乙醇、Islatravir和氮霉素等。

3.1 糖類化學(xué)品

氨基葡萄糖被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和制藥工業(yè)中［63］。目前用于生產(chǎn)氨基葡萄糖的方法主要有化學(xué)法和微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)法需要強(qiáng)酸水解且操作步驟繁雜，并伴有毒副產(chǎn)物產(chǎn)生［63］；微生物發(fā)酵法產(chǎn)生的氨基葡萄糖易被微生物代謝消耗，且產(chǎn)物積累會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)而致產(chǎn)量降低［63］。Meng 等［14］設(shè)計(jì)了一條氨基葡萄糖的體外生物合成路徑（圖4），該方法以淀粉/麥芽糊精和氨水為原料，α-糖苷磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶、氨基葡萄糖-6-磷酸磷酸酶為催化劑，當(dāng)麥芽糊精濃度為10 g/L 時(shí)，其氨基葡萄糖的產(chǎn)量可達(dá)7.9 g/L，對(duì)應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率為75.8%。為探究該體外生物合成路徑的工業(yè)應(yīng)用潛力，作者對(duì)該體系進(jìn)行了放大，當(dāng)麥芽糊精濃度為50 g/L時(shí)，其氨基葡萄糖的產(chǎn)量可達(dá)23.7 g/L。雖然該產(chǎn)量與目前微生物發(fā)酵法的最高水平（120 g/L 左右）還存在一定差距［64］，但是該氨基葡萄糖的體外合成路線具有催化效率高、原子經(jīng)濟(jì)性好和可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，展現(xiàn)出了一定的工業(yè)應(yīng)用前景。此外，Lv等［65］構(gòu)建了一條以蘑菇及植物中的幾丁質(zhì)為原料合成氨基葡萄糖的體外合成路線，通過甲殼素酶和脫乙酰酶（來源于Cyclobacterium marinum）兩步合成氨基葡萄糖，該方法以廢棄的植物資源為原料，具有一定的環(huán)保效益，同時(shí)可被甲殼類過敏的消費(fèi)者食用。

圖4 使用淀粉生產(chǎn)氨基葡萄糖的體外生物合成途徑Fig.4 In vitro biosynthesis pathway for conversion of starch and inorganic ammonia to glucosamine

甘油葡萄糖苷（α-glucosylglycerol）是由一分子甘油和一分子葡萄糖通過糖苷鍵形成的一種糖苷型化合物，可作為化妝品中的保濕劑［66-67］。Zhang 等［17］構(gòu)建了兩條甘油葡萄糖苷的體外生物合成路線。其中一條以蔗糖為原料，經(jīng)蔗糖磷酸酶、葡萄糖基甘油磷酸酶催化合成；另一條以麥芽糖為原料，經(jīng)麥芽糖磷酸酶、葡萄糖基甘油磷酸酶催化合成。通過對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，兩條途徑的轉(zhuǎn)化率均可高達(dá)97%，甘油葡萄糖苷產(chǎn)量高達(dá)452 g/L。

此外，果糖、2-脫氧-5-核糖、甘露糖等糖類化學(xué)品也可以通過體外生物合成方法進(jìn)行生產(chǎn)（表1）。

表1 糖類化學(xué)品的體外生物合成Tab.1 In vitro biosynthesis of carbohydrates and its derivatives,including glucosamine,N-acetyl glucosamine,glycerol glucoside,glucose-6-phosphate,fructose,fructose-6-phosphate,fructose-1,6-diphosphate,2-deoxy-5-ribose,d-tagatose,mannose and xylulose-5-phosphate.

3.2 有機(jī)酸類化學(xué)品

α-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)和氨基酸合成的重要中間體，可作為膳食補(bǔ)充劑、傷口愈合類化合物的原料以及雜環(huán)化學(xué)合成的基礎(chǔ)原料［75］。目前，α-酮戊二酸一般使用琥珀酸和草酸二乙酯與氰醇進(jìn)行化學(xué)合成，其產(chǎn)率約為75%，但由于使用有毒的原料，該方法會(huì)產(chǎn)生有毒的廢物（如氰化物）［76］。環(huán)境友好的生物合成可作為化學(xué)法的替代方式，但體內(nèi)生物合成需要精確控制其培養(yǎng)條件［77］（如硫胺素和氮濃度、pH和通氣量等），且產(chǎn)生的丙酮酸和其他有機(jī)酸等副產(chǎn)物會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，Beer 等［15］設(shè)計(jì)了類糖醛酸的氧化途徑，該方法以葡萄糖醛酸為底物，使用尿酸鹽脫氫酶、草酸鹽脫水酶、5-酮-4-脫氧葡萄糖酸脫水酶和α-酮戊二酸半醛脫氫酶催化合成α-酮戊二酸（圖5）。這種體外生物合成方式所需酶級(jí)聯(lián)步驟較短，并且單次反應(yīng)只消耗兩個(gè)單位的NAD+。由于最后一步由α-酮戊二酸半醛脫氫酶催化的氧化反應(yīng)為不可逆反應(yīng)，因此總反應(yīng)的熱力學(xué)平衡強(qiáng)烈傾向于產(chǎn)物。在添加輔酶循環(huán)再生系統(tǒng)后，10 g/L 的D-葡萄糖醛酸可生產(chǎn)2.8 g/L的α-酮戊二酸。

圖5 使用D-葡萄糖醛酸生產(chǎn)α-酮戊二酸的體外生物合成途徑Fig.5 In vitro biosynthesis pathway for conversion of D-glucuronic acid to α-ketoglutarate

丙酮酸是一種酸性較弱的有機(jī)酸，作為生物細(xì)胞糖代謝及體內(nèi)多種物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化的重要中間體，在藥品、食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療等行業(yè)有重要的作用。Honda等［18］利用甲殼素為原料構(gòu)建了丙酮酸的體外生物合成系統(tǒng)，使用了12種嗜熱酶，其中包括3-磷酸甘油醛脫氫酶、不依賴輔因子的磷酸甘油酸突變酶、烯醇化酶和丙酮酸激酶等。在添加了輔酶再生系統(tǒng)、ATP再生系統(tǒng)與腺苷酸激酶后，丙酮酸產(chǎn)量提高到了2.1 mmol/L（底物濃度為0.5 mg/mL）。

此外，乳酸［41］、D-2-氨基丁酸［78］、半胱氨酸［28］、葡糖二酸［79］等有機(jī)酸類化學(xué)品也可以通過體外生物合成方法進(jìn)行生產(chǎn)（表2）。

表2 有機(jī)酸類化學(xué)品的體外生物合成Tab.2 In vitro biosynthesis for organic acid chemicals,including α-ketoglutarate,pyruvate,lactic acid,D-2-aminobutyric acid,cysteine and glucaric acid

3.3 醇類化學(xué)品

乙醇是一種常用的化學(xué)品，在化工、醫(yī)療、食品、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中都有廣泛的用途［80］。在乙醇的微生物發(fā)酵生產(chǎn)中，菌體對(duì)溫度和溶劑條件的低耐受性是導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化效率低下的主要原因。Guterl等［16］構(gòu)建了以葡萄糖為原料合成乙醇的體外生物合成系統(tǒng)，該系統(tǒng)首先以葡萄糖脫氫酶、二羥酸脫水酶、2-酮-3-脫氧葡萄糖酸醛縮酶、甘油醛脫氫酶為催化劑構(gòu)建了葡萄糖合成丙酮酸的高效中間體平臺(tái)，再利用丙酮酸脫羧酶與乙醇脫氫酶催化丙酮酸催化合成乙醇（圖6）。當(dāng)葡萄糖濃度為25 mmol/L時(shí)，乙醇的濃度經(jīng)19 h 可達(dá)到28.7 mmol/L。此外，基于丙酮酸的中間體平臺(tái)，該路徑還可用于異丁醇的生產(chǎn)，經(jīng)23 h 的酶催化，19.1 mmol/L 的葡萄糖可轉(zhuǎn)化為10.3 mmol/L的異丁醇。

圖6 使用葡萄糖生產(chǎn)乙醇的體外生物合成途徑Fig.6 In vitro biosynthesis pathway for conversion of glucose to ethanol

1，3-丙二醇是生產(chǎn)不飽和聚酯、多種藥物及中間體、表面活性劑和乳化劑的原料［81］。傳統(tǒng)上以甘油為原料發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法由于體內(nèi)復(fù)雜的 代 謝 路 徑 ， 僅 能 達(dá) 到 60% 的 產(chǎn) 率［81-82］。Rieckenberg 等［19］構(gòu)建了由甘油生產(chǎn) 1，3-丙二醇的體外生物合成路徑，以甘油脫水酶、丙二醇氧化還原酶同工酶和氫化酶為催化劑，構(gòu)建了兩步級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中氫化酶作為輔因子再生模塊可消耗氧氣為體外生物合成系統(tǒng)供給NADPH，該體外生物合成途徑有著很高的原子經(jīng)濟(jì)性（轉(zhuǎn)化率接近100%）。同時(shí)，通過添加輔酶維生素B12、ATP和鎂，延長(zhǎng)了甘油脫氫酶的耐久性，相比于發(fā)酵過程，該路徑可簡(jiǎn)化在工業(yè)化生產(chǎn)中下游的分離步驟。

此外，正丁醇、異丁醇、肌醇、二氨基山梨醇等醇類化學(xué)品也可以通過體外生物合成方法進(jìn)行生產(chǎn)（表3）。

3.4 其他化學(xué)品

除了上述3 類大宗化學(xué)品，體外生物合成系統(tǒng)還可用于合成其他具有不同結(jié)構(gòu)和功能的化學(xué)品，包括一些復(fù)雜的天然產(chǎn)物和藥物，如Islatravir、氮霉素、異戊二烯、間苯三酚和柚皮素等（表4）。

表4 其他化學(xué)品的體外生物合成Tab.4 In vitro biosynthesis for other chemicals,including isoprene,phloroglucinol,islatravir,naringenin,deoxyinosine,cytidine-5-monophosphate,azomycin,3-hydroxybutyryl limonene,pinene,hinokene and L-glutathione

核苷型類似物Islatravir 是一種人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）逆轉(zhuǎn)錄酶易位抑制劑，目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)研究，有望用于HIV 暴露前的預(yù)防感染，以及降低治療的給藥頻率［89］。由于需要構(gòu)建多個(gè)保護(hù)基以保護(hù)Islatravir 的活性基團(tuán)和2-脫氧核糖核苷的立體選擇性，目前多種化學(xué)合成路線均需要長(zhǎng)達(dá) 12～18 步的合成步驟［90］。默克公司的Huffman 等［20］在細(xì)菌核苷補(bǔ)救途徑的啟發(fā)下，采用逆向合成思路（圖1），設(shè)計(jì)了一條無需保護(hù)基步驟的Islatravir 的體外生物合成路線，該方法以脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶、磷酸突變酶、嘌呤核苷磷酸化酶等酶為催化劑，以2-乙炔基甘油為原料，經(jīng)過三步催化步驟合成Islatravir（圖7）。通過優(yōu)化酶催化的各個(gè)路徑，首次實(shí)現(xiàn)了Islatravir 的體外規(guī)?；铣?，其總產(chǎn)量高達(dá)51%，純度高達(dá)95%。

圖7 Islatravir的體外生物合成途徑Fig.7 In vitro biosynthesis pathway for conversion of ethynyl glycerol,acetaldehyde and guanine to islatravir

氮霉素（azomycin）是一種硝基咪唑類抗生素藥物，是目前治療厭氧細(xì)菌感染的最有效的藥物之一。Eguchi 等［91］發(fā)現(xiàn)在菌株Streptomyces eurocidicus中，L-精氨酸可通過2-氨基咪唑轉(zhuǎn)化為氮霉素。受前人工作的啟發(fā)，Hedges 和Ryan［21］以L-精氨酸為原料，吡哆醛-5-磷酸依賴型精氨酸氧化酶、二氫二吡啶甲酸合酶、胍基乙醛脫水酶、鐵氧化酶為催化劑，首次構(gòu)建了氮霉素的體外生物合成系統(tǒng)，該工作為今后體外生物合成氮霉素或其他硝基咪唑類化學(xué)品提供了借鑒。

4 總結(jié)與展望

21 世紀(jì)以來，以合成生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程為代表的現(xiàn)代生物技術(shù)的迭代進(jìn)步，為化學(xué)品體外生物合成的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的保障。以美國(guó)和歐盟為代表的發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)在化學(xué)品體外生物合成領(lǐng)域的發(fā)展快速，我國(guó)在該領(lǐng)域內(nèi)的自主創(chuàng)新也展現(xiàn)出強(qiáng)勁活力。然而，作為一種新興的綠色合成方式，化學(xué)品體外生物合成還處于技術(shù)發(fā)展的初期階段，目前還存在一定的挑戰(zhàn)，具體表現(xiàn)如下：

（1）化學(xué)品體外生物合成的途徑設(shè)計(jì)困難?；瘜W(xué)品體外生物合成技術(shù)現(xiàn)有的發(fā)展多是基于自然界中已發(fā)現(xiàn)的生物合成途徑。然而，絕大部分化學(xué)品并沒有天然合成途徑，這給很多化學(xué)品體外生物合成的途徑設(shè)計(jì)帶來了一定困難。

（2）化學(xué)品體外生物合成的關(guān)鍵酶元件缺乏。酶元件是構(gòu)建化學(xué)品體外生物合成途徑的關(guān)鍵，然而，很多理論轉(zhuǎn)化率很高的途徑，由于缺少合適的酶元件，難以達(dá)到預(yù)期的效果。

（3）化學(xué)品體外生物合成的成本較高。很多化學(xué)品體外生物合成需要ATP 及輔酶的參與，然而，昂貴的ATP 及輔酶原料極大增加了體外生物合成的成本。同時(shí)，酶在體外的穩(wěn)定性和可重復(fù)使用率較差，也是造成體外生物合成的成本居高不下的重要原因之一。

針對(duì)上述化學(xué)品體外生物合成技術(shù)存在的挑戰(zhàn)，筆者分析總結(jié)了體外生物合成途徑設(shè)計(jì)的兩個(gè)重要原則，包括原子經(jīng)濟(jì)性原則和能量最優(yōu)原則；介紹了體外生物合成中用于酶元件組裝的3類常見生物大分子，包括連接肽、蛋白支架、DNA等；并對(duì)近年來體外生物合成在化學(xué)品生產(chǎn)中的應(yīng)用案例作了介紹，包括氨基葡萄糖、甘油葡萄糖苷、丙酮酸、α-酮戊二酸、乙醇、1，3-丙二醇、Islatravir和氮霉素等。最后，筆者對(duì)化學(xué)品體外生物合成的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望，具體如下：

（1）隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，可以使用人工智能技術(shù)對(duì)代謝路徑進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析和理論計(jì)算，以篩選出最優(yōu)的途徑供體外生物合成使用。

（2）隨著非理性設(shè)計(jì)到理性設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)改造技術(shù)以及新酶設(shè)計(jì)能力的不斷提高，希望可以快速獲得具有理想催化功能的關(guān)鍵酶元件供體外生物合成使用。此外，還可通過酶元件與綠色環(huán)保的化學(xué)催化劑串聯(lián)/并聯(lián)使用，實(shí)現(xiàn)化學(xué)品的體外綠色合成。

（3）開發(fā)輔因子再生系統(tǒng)或者人工仿生輔酶，降低輔因子的使用成本。同時(shí)，期望通過重構(gòu)體外生物合成的途徑，設(shè)計(jì)出不需要ATP 或輔酶參與的路線，以降低化學(xué)品體外生物合成的成本。

（4）開發(fā)具備工業(yè)應(yīng)用前景的酶固定化或自組裝技術(shù)，提高酶在體外生物合成系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，增加酶的回收和重復(fù)使用率，降低體外生物合成的成本。

總之，隨著體外生物合成設(shè)計(jì)能力的不斷提高，體外生物合成的途徑設(shè)計(jì)將朝著智能化、高效化發(fā)展，化學(xué)品體外合成的效率也將逐步提高，體外生物合成有望涵蓋所有化學(xué)品的生物合成。同時(shí)，也希望通過合成生物學(xué)技術(shù)的輔助，使化學(xué)品體外生物合成的成本不斷降低，并成為未來化學(xué)品合成的主要方式之一。