張曉龍，王晨蕓，劉延峰 ，李江華 ，劉龍，堵國成

（1 江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2 江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心，江蘇 無錫214122；3江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

生物制造技術(shù)最早可追溯到幾千年前，當(dāng)時(shí)人類已經(jīng)懂得使用天然微生物進(jìn)行釀酒制醋，但天然的生物制造系統(tǒng)已逐漸無法滿足當(dāng)下工業(yè)生產(chǎn)的需求，因此如何獲得綠色高效、多元穩(wěn)健的生物制造系統(tǒng)是目前亟待解決的關(guān)鍵問題之一。隨著基因編輯工具、多組學(xué)及生物信息學(xué)等技術(shù)的交叉發(fā)展，基于合成生物技術(shù)構(gòu)建非天然的高效生物制造系統(tǒng)變得日益簡便。本文首先概述了當(dāng)前常用于構(gòu)建高效生物制造系統(tǒng)的合成生物技術(shù)；其次，對(duì)大腸桿菌、芽孢桿菌屬、谷氨棒酸桿菌以及酵母屬等典型模式宿主制造系統(tǒng)的代謝特性與產(chǎn)品應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)探究。最后，對(duì)構(gòu)建高效生物制造系統(tǒng)的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

1 合成生物技術(shù)路線概述

合成生物學(xué)是基因組工程、酶工程、代謝工程和生物信息學(xué)等技術(shù)交叉發(fā)展形成的一門學(xué)科。在此，本文依據(jù)策略的目的性，將常見的合成生物技術(shù)劃分為以下4個(gè)模塊進(jìn)行簡要概述（圖1）：

圖1 高效生物制造系統(tǒng)的構(gòu)建Fig.1 Construction of high-efficiency biomanufacturing system

（1）合成途徑關(guān)鍵基因的代謝調(diào)控 提高合成途徑的代謝通量是代謝工程的關(guān)鍵目標(biāo)之一。首先，通過生物信息學(xué)確定目標(biāo)代謝物的合成途徑，并基于啟動(dòng)子工程、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）優(yōu)化、增加基因拷貝數(shù)等策略，強(qiáng)化關(guān)鍵基因的表達(dá)量，從而使得代謝通量更多地流向目的產(chǎn)物的代謝合成途徑。其次，抑制或敲除生物制造系統(tǒng)內(nèi)源性的支路競爭途徑。傳統(tǒng)的靜態(tài)調(diào)控策略雖然可以一定程度上優(yōu)化生物制造系統(tǒng)，但會(huì)導(dǎo)致新問題的出現(xiàn)，即生物制造系統(tǒng)自身生長與目標(biāo)產(chǎn)物代謝合成存在底物能量競爭矛盾。因此，為了進(jìn)一步構(gòu)建高效的生物制造系統(tǒng)，動(dòng)態(tài)調(diào)控策略應(yīng)運(yùn)而生。相比于靜態(tài)調(diào)控策略，基于響應(yīng)元件構(gòu)建的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)可以使得生物制造系統(tǒng)在特定時(shí)間點(diǎn)自發(fā)性地實(shí)現(xiàn)代謝通量的配比流向，從而平衡菌體生長與產(chǎn)品合成之間的底物能量競爭矛盾［1-2］。

（2）酶工程 豐度是“量”，活性是“質(zhì)”，豐度與活性共同決定了酶的“質(zhì)量”——催化效率。提高豐度雖可以一定程度上優(yōu)化酶的催化效率，但當(dāng)豐度提高至某一閾值后，酶的催化效率會(huì)無法繼續(xù)顯著提高，甚至?xí)霈F(xiàn)催化效率下降等現(xiàn)象，此時(shí)對(duì)酶進(jìn)行“質(zhì)”層面的優(yōu)化改造顯得尤為重要［3］。高催化活性的作用酶是高效生物制造系統(tǒng)的基石，其不僅可以提高產(chǎn)物代謝合成效率，同時(shí)有助于降低酶的豐度，從而緩解生物制造系統(tǒng)超負(fù)荷運(yùn)行的問題。酶工程主要包括基于結(jié)構(gòu)分析的半理性設(shè)計(jì)和基于定向進(jìn)化策略的非理性設(shè)計(jì)。半理性設(shè)計(jì)的優(yōu)勢在于其突變文庫較小，無需高通量篩選，但該策略受限于實(shí)驗(yàn)和模擬獲取酶蛋白結(jié)構(gòu)的數(shù)量和精確性?；诙ㄏ蜻M(jìn)化策略的非理性設(shè)計(jì)可以通過DNA shuffling、較大范圍的底物結(jié)合口袋關(guān)鍵氨基酸的飽和突變、胞內(nèi)外突變文庫的構(gòu)建等技術(shù)實(shí)現(xiàn)特定酶的定向進(jìn)化，建立合適的高通量篩選模型是非理性設(shè)計(jì)策略的關(guān)鍵。

（3）輔助系統(tǒng)優(yōu)化 除對(duì)相關(guān)代謝途徑的關(guān)鍵基因的調(diào)控表達(dá)外，調(diào)控適配優(yōu)化針對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的特異性輔助系統(tǒng)亦至關(guān)重要，其可以平衡輔因子循環(huán)、緩解蛋白合成壓力、毒性產(chǎn)生及解除副產(chǎn)物抑制等問題［4］。Gu 等［5］在產(chǎn) GlcNAc 的工程菌中重構(gòu)還原力代謝途徑，替換丙酮酸到乙酰輔酶A、蘋果酸到草酰乙酸等內(nèi)源代謝途徑，避免NADH 的過剩，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)氧化還原平衡，最終GlcNAc 的發(fā)酵產(chǎn)量提高了4.06 倍。另外，分子伴侶參與的蛋白加工輔助系統(tǒng)，對(duì)于酶蛋白的大量合成有重要意義［6］。設(shè)計(jì)構(gòu)建多重基因回路，采用細(xì)胞微室和蛋白自組裝等策略，可以顯著平衡產(chǎn)物代謝與細(xì)胞生長的代謝競爭，緩解代謝中間產(chǎn)物對(duì)生物制造系統(tǒng)自身的毒害性［7-8］。Wang等［9］開發(fā)了基于定量調(diào)控水蛭透明質(zhì)酸酶消除透明質(zhì)酸“莢膜層”的策略，解除了透明質(zhì)酸在胞外包裹細(xì)胞對(duì)其形態(tài)和代謝的影響，最終低分子量透明質(zhì)酸產(chǎn)量高達(dá)74.1 g/L。

（4）發(fā)酵過程控制與優(yōu)化 隨著合成生物技術(shù)的快速發(fā)展，單批次需要進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證的宿主數(shù)量愈發(fā)擴(kuò)增，如仍采用常規(guī)搖瓶或發(fā)酵罐直接進(jìn)行發(fā)酵性能驗(yàn)證，將會(huì)導(dǎo)致科研工作效率降低。因此逐漸形成了從96 孔板發(fā)酵規(guī)模開始，依次到500 mL 錐形瓶、1～5 L 玻璃無壓力發(fā)酵罐、10～50 L 不銹鋼壓力發(fā)酵罐小試、2～5 t 發(fā)酵中試、20～60 t發(fā)酵罐（或100 t級(jí)別發(fā)酵罐）的多級(jí)發(fā)酵驗(yàn)證過程。由于不同規(guī)模級(jí)別發(fā)酵設(shè)備的差異性，宿主在不同發(fā)酵規(guī)模過程中其生長代謝過程不盡相同，其最適的發(fā)酵過程參數(shù)亦需依據(jù)放大準(zhǔn)則進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化［10］。宿主、目標(biāo)產(chǎn)物及代謝工程改造策略的差異造成了發(fā)酵過程的高度特異性與復(fù)雜性，因此發(fā)酵過程的控制與優(yōu)化目前尚無高度普適性策略。

以上是當(dāng)前合成生物技術(shù)領(lǐng)域中應(yīng)用較為廣泛的4種策略，基于這幾種合成生物技術(shù)，研究人員已構(gòu)建出許多發(fā)酵性能優(yōu)異、魯棒性強(qiáng)的非天然生物制造系統(tǒng)。然而千里之行始于足下，構(gòu)建滿足需求的高效生物制造系統(tǒng)的首要任務(wù)則是選擇適合的天然宿主作為出發(fā)點(diǎn)，不同的天然宿主其代謝特性與適用范圍具有高度的差異性，如果最初的天然宿主選擇正確，采用合成生物技術(shù)對(duì)其進(jìn)行改造則事半功倍。因此，本文接下來將對(duì)目前典型模式宿主進(jìn)行概述，并對(duì)其優(yōu)劣勢與適用范圍進(jìn)行詳細(xì)比對(duì)總結(jié)。

2 典型模式宿主系統(tǒng)及適用范圍

2.1 大腸桿菌

發(fā)酵周期短、遺傳背景清晰、具有成熟的基因編輯工具以及多元化的代謝調(diào)控策略使得大腸桿菌成為最重要的非糖基化重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)（表1）［11-12］。大腸表達(dá)系統(tǒng)通常分為宿主、質(zhì)粒復(fù)制子、啟動(dòng)子（lac、tac、T7、araPBAD、pL 和cspA等）、親和標(biāo)簽（poly-Arg-tags、poly-His-tags、FLAG-tags、c-Myc-tags、Strep Ⅱ-tags 等短肽和麥芽糖結(jié)合蛋白MBP 等融合蛋白）［13］、裂解序列（腸激酶、凝血酶、Ⅹa 因子和TEV）、抗性標(biāo)記和終止子等［14］。

（1）宿主 BL21（DE3）菌株，Lon蛋白酶和胞外蛋白酶OmpT的缺失減少了內(nèi)源性蛋白酶對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響；其次，hsdSB突變使其失去DNA 甲基化和降解能力。AD949 菌株，其硫氧還蛋白還原酶（trxB）存在突變，有利于二硫鍵的形成。HMS174 菌株，DNA 重組和修復(fù)蛋白基因（recA）的突變，可以避免質(zhì)粒多聚體導(dǎo)致的質(zhì)粒低穩(wěn)定性問題。以上所述大腸桿菌宿主均含有λDE3系統(tǒng)，可以使用T7表達(dá)系統(tǒng)。

（2）質(zhì)粒 依據(jù)目的基因預(yù)期表達(dá)水平選擇具有不同復(fù)制子的質(zhì)粒。例如，野生型ColE1 為15～20 拷貝、pET 系列擁有衍生自 ColE1 的 pMB1復(fù)制子為15～60 拷貝、衍生自pMB1 的pUC 系列為500～700 拷貝。以上3 個(gè)系列的質(zhì)粒的復(fù)制子均來源于ColE1。為了實(shí)現(xiàn)雙質(zhì)粒共存，可以選擇10～12拷貝的帶有p15A復(fù)制子的pACYC和pBAD質(zhì)粒，甚至可以進(jìn)一步選擇拷貝數(shù)低于5 的pSC101質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)三質(zhì)粒共存。

（3）啟動(dòng)子 啟動(dòng)子在一定程度上決定了其控制基因的轉(zhuǎn)錄水平。lac 啟動(dòng)子作為初始啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度較弱，而由色氨酸啟動(dòng)子的-35 區(qū)和lac啟動(dòng)子的-10 區(qū)組成的tac 啟動(dòng)子，其表達(dá)強(qiáng)度顯著提高。T7啟動(dòng)子是應(yīng)用較為廣泛的啟動(dòng)子之一，基于T7溶菌酶或者lac O 機(jī)制可以設(shè)計(jì)構(gòu)建誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)。嚴(yán)格誘導(dǎo)型啟動(dòng)子araPBAD，AraC 蛋白具有阻遏/激活雙重作用，無阿拉伯糖時(shí)，AraC 蛋白通過結(jié)合阻遏抑制轉(zhuǎn)錄；存在阿拉伯糖時(shí)，AraC 蛋白激活并促進(jìn)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄［15］。低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子cspA，當(dāng)溫度為15 ℃時(shí)該啟動(dòng)子開始表達(dá)［16］。高溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PR，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，熱敏型阻遏蛋白CI857結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄，當(dāng)溫度升至37 ℃時(shí) PR啟動(dòng)子開始表達(dá)［17］。

（4）親和標(biāo)簽和裂解標(biāo)簽 親和標(biāo)簽poly-His-等可用于Western blot 或樹脂純化，麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）、N-利用底物蛋白A（NusA）、硫氧還蛋白（Trx）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、泛素蛋白（ubiquitin）、類泛素蛋白修飾分子SUMO和鈣結(jié)合蛋白Fh8 等，可以增加目的蛋白溶解度。由于MBP 具有內(nèi)在伴侶活性，其促溶效果比GST更加顯著，且MBP 可以與直鏈淀粉-瓊脂糖結(jié)合，GST 可以與谷胱甘肽-瓊脂糖結(jié)合，因而具有這兩種標(biāo)簽的融合蛋白可通過親和色譜進(jìn)一步純化。Fh8 在去除標(biāo)簽后仍擁有較好的溶解性，而其他標(biāo)簽在去除后無法預(yù)測最終的溶解度［18］。此外，β折疊標(biāo)簽可以使蛋白在鈣存在的條件下選擇性沉淀，類彈性蛋白多肽標(biāo)簽（ELP）可以通過轉(zhuǎn)變溫度的可逆沉淀來純化蛋白［19］。由于帶His 標(biāo)簽的TEV具有高特異性，切割后僅留下絲氨酸或甘氨酸殘基，其已成為應(yīng)用最廣泛的裂解序列［20］。表達(dá)毒性蛋白時(shí)，一方面可以通過選取弱化表達(dá)強(qiáng)度的C41（DE3）菌株；另一方面則可以選取Lpp、LamB 和LTB 等分泌型信號(hào)肽［21］或借助二硫鍵異構(gòu)酶Ⅰ（DsbA）的信號(hào)肽序列通過信號(hào)識(shí)別顆粒（SRP）途徑將毒性蛋白表達(dá)分泌至細(xì)胞周質(zhì)空間［22-23］。相比于細(xì)胞質(zhì)，大腸桿菌的周質(zhì)空間更有利于二硫鍵的形成，因此含有二硫鍵的蛋白更適合表達(dá)分泌至周質(zhì)空間［24］。強(qiáng)化分子伴侶ClpB、GroES-GroEL、DnaK、DnaGrpE 等的表達(dá)會(huì)顯著提高蛋白表達(dá)質(zhì)量［25］。低溫培養(yǎng)的生物制造系統(tǒng)不僅可以降低蛋白質(zhì)的合成速率，而且可以減弱蛋白疏水相互作用導(dǎo)致的聚集性，有助于蛋白折疊質(zhì)量的提高［26］。

盡管大腸桿菌是表達(dá)異源蛋白最常用的表達(dá)系統(tǒng)，然而其適用范圍仍存在一定的局限性。大腸桿菌不適用于表達(dá)需要翻譯后修飾的蛋白，例如二硫鍵異構(gòu)化、酯化、糖基化、脯氨酸順反異構(gòu)化、磷酸化或硫酸化等［27］。大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)也不適于表達(dá)膜蛋白，以及大于60 kDa 的蛋白［14］。為了解決天然大腸桿菌宿主的蛋白表達(dá)缺陷，基于合成生物技術(shù)，通過基因工程優(yōu)化其二硫鍵形成系統(tǒng)，并引入異源糖基化、磷酸化和乙?；到y(tǒng)，增強(qiáng)其表達(dá)部分需要翻譯后修飾蛋白的能力［28-30］。

同樣的，大腸桿菌也是制備生物制品的理想底盤細(xì)胞。弱化TCA 循環(huán)，強(qiáng)化糖酵解途徑，內(nèi)源性代謝產(chǎn)物如丙酮酸［31］、蘋果酸［32-33］、乙酰輔酶A［34］等均可在大腸桿菌內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)。Huang 等［35］以大腸桿菌 W3110 為出發(fā)菌株，通過敲除轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MetJ、強(qiáng)化途徑酶MetA 表達(dá)使得L-甲硫氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量高達(dá)9.75 g/L。Yang等［36］首次在大腸桿菌BL21（DE3）實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為底物從頭合成N-乙酰神經(jīng)氨酸（NeuAc），并設(shè)計(jì)構(gòu)建了響應(yīng)NeuAc 的生物傳感器進(jìn)行代謝調(diào)控，NeuAc 的發(fā)酵產(chǎn)量提高至8.31 g/L。大腸桿菌不僅在代謝合成內(nèi)源性化合物領(lǐng)域具有強(qiáng)大的工業(yè)潛力，其在重構(gòu)異源合成途徑以代謝生產(chǎn)非內(nèi)源性產(chǎn)物領(lǐng)域也具有極大的應(yīng)用前景。例如，類胡蘿卜素［37］、檸檬烯［38］、丹參素［39］等萜類化學(xué)物均在大腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)了代謝合成。

2.2 芽孢桿菌屬

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌等宿主以其出色的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)、惡劣環(huán)境耐受性強(qiáng)而被廣泛應(yīng)用［29，40］。相比于大腸桿菌極易形成不溶性包涵體、潛在的脂多糖和內(nèi)毒素風(fēng)險(xiǎn)［41］，芽孢桿菌屬宿主具有食品安全等優(yōu)勢。

枯草芽孢桿菌是堿性絲氨酸蛋白酶與中溫淀粉酶制備生產(chǎn)的首選生物制造系統(tǒng)，其也被廣泛用于核苷酸、維生素、表面活性劑、維生素B2復(fù)合物核黃素［42］、透明質(zhì)酸［43］以及抗生素（例如桿菌肽和枯草桿菌素）的發(fā)酵生產(chǎn)。此外，由于枯草芽孢桿菌具有典型的芽孢形成能力、細(xì)胞分裂以及生物膜系統(tǒng)，其亦成為微生物機(jī)理研究的典型模式微生物之一［44］。

地衣芽孢桿菌是高溫淀粉酶制備生產(chǎn)的最佳生物制造系統(tǒng)，其在高溫培養(yǎng)環(huán)境中擁有極佳的液化和糊化特性。早在1973 年，地衣芽孢桿菌就已被發(fā)現(xiàn)其能表達(dá)天然高溫淀粉酶［45］，之后Declerck 等［46］對(duì)其耐高溫特性進(jìn)行了關(guān)鍵氨基酸解析，拓寬其工業(yè)應(yīng)用范圍［47］。此外，地衣芽孢桿菌還被用于銀納米顆粒［48-49］、生物絮凝劑［50］、聚γ-谷 氨 酸［51］、 2，3-丁 二 醇 的 生 物 合 成［52-53］。2004 年 ， Veith 等［54］對(duì) 具 有 工 業(yè) 應(yīng) 用 潛 能 的Bacillus licheniformisDSM13 菌株進(jìn)行基因組規(guī)模測序，清晰的遺傳背景為其后續(xù)CRISPR 基因編輯調(diào)控工具開發(fā)［55-56］等領(lǐng)域的研究奠定了基礎(chǔ)。

解淀粉芽孢桿菌常用于中性或堿性蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)［57］。Sha等［58］以解淀粉芽孢桿菌NS為出發(fā)宿主，通過采用模塊化工程策略，抑制副產(chǎn)物的代謝合成，阻斷目標(biāo)產(chǎn)物降解途徑，推動(dòng)了低分子量聚γ-谷氨酸生物合成進(jìn)展。此外，解淀粉芽孢桿菌也可用于表面活性素［59-60］、果聚糖［61］、S-腺苷甲硫氨酸［62］以及銀納米顆粒［63］的生物合成。

2.3 谷氨酸棒桿菌

谷氨酸棒桿菌是一種革蘭氏陽性、非致病性的土壤細(xì)菌，其具有耗糖迅速、易高密度發(fā)酵［64］、無碳源分解代謝阻遏效應(yīng)［65］、對(duì)有毒醇和芳香族化合物有較高耐受性［66-67］等代謝特性。

作為較為成熟的生物制造系統(tǒng)，谷氨酸棒桿菌的表達(dá)系統(tǒng)、基因編輯工具、代謝調(diào)控策略已有較為全面的研究［68］。谷氨棒酸桿菌內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)pVWEx1、 pEKEx3 和 pECXT99A 三個(gè) 質(zhì) 粒共存 ，可用于多途徑模塊化工程，以及多種調(diào)控元件的表達(dá)優(yōu)化［69-70］，基于sacB 標(biāo)記的條件致死的基因編輯方法［71］、基于Cre/loxP 系統(tǒng)的基因編輯策略［72］以及基于 CRISPR 的基因編輯工具［73］均能夠用于構(gòu)建更加高效的谷氨棒酸桿菌制造系統(tǒng)。谷氨酸棒桿菌是L-谷氨酸和L-賴氨酸等氨基酸的優(yōu)勢底盤細(xì)胞，近期研究表明其也擁有成為透明質(zhì)酸優(yōu)勢底盤細(xì)胞的潛力，通過途徑關(guān)鍵酶優(yōu)化表達(dá)水平，以及解除產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的包裹效應(yīng)，透明質(zhì)酸達(dá)到74.1 g/L［9］。此外，基于谷氨酸棒桿菌可以吸收和利用各種芳香族化合物，因此通過合成生物技術(shù)對(duì)其進(jìn)行改造后有望成為高效的芳香族化合物制造系統(tǒng)［70，74］。

2.4 釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母

2.4.1 釀酒酵母

作為典型真核模式菌株，釀酒酵母具有較好的pH 與滲透壓耐受性，使其成為生產(chǎn)生物能源、蛋白、類異戊二烯、脂肪酸和脂肪醇、芳香族化合物等生物制品的重要宿主。相比于大腸桿菌等原核生物，釀酒酵母具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器，在異源表達(dá)蛋白酶尤其是細(xì)胞色素P450 酶時(shí)具有原核生物無法比擬的優(yōu)勢。其次，釀酒酵母的遺傳背景和胞內(nèi)代謝調(diào)控機(jī)制具有高度的可知性、完整性與系統(tǒng)性。例如釀酒酵母染色體復(fù)制機(jī)制解析［75］，釀酒酵母氮源代謝、磷酸代謝等機(jī)制解析［76］，釀酒酵母氧化應(yīng)激凋亡機(jī)制研究［77］，釀酒酵母蛋白質(zhì)復(fù)合物和互作研究［78-80］，釀酒酵母孢子形成過程解析［81］，釀酒酵母細(xì)胞壁動(dòng)態(tài)感知和調(diào)控過程解析［82］，終止子文庫［83］、轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫［84］、釀酒酵母數(shù)據(jù)庫［85］等，這些研究報(bào)道極大提升了釀酒酵母的工業(yè)化應(yīng)用前景。

釀酒酵母常用的啟動(dòng)子主要為組成型強(qiáng)啟動(dòng)子主要為TEF1 和GPD，以及半乳糖誘導(dǎo)型的GAL1 啟動(dòng)子。質(zhì)粒分為附加型質(zhì)粒（Yep），是基于內(nèi)源性2 μ 復(fù)制起點(diǎn)的高拷貝質(zhì)粒，以及著絲粒質(zhì)粒（YCp），是基于自主復(fù)制序列（ARS）和酵母著絲粒序列（CEN）的組合的低拷貝質(zhì)粒。釀酒酵母具有強(qiáng)大的DNA 組裝能力，50 bp堿基重疊即可組裝3～5 個(gè)基因的10 kb 片段，125 bp 堿基重疊即可組裝8個(gè)基因約19 kb的片段［86-87］。

釀酒酵母作為理想的生物制造系統(tǒng)之一，其被廣泛應(yīng)用于生物能源、食品、醫(yī)藥化工等領(lǐng)域。

（1）生物能源 為了緩解糧食危機(jī)，開發(fā)以非食品原為底物的第二代生物乙醇制備技術(shù)是實(shí)現(xiàn)資源可持續(xù)化的有效途徑之一［88］。來源于玉米秸稈、木片和農(nóng)業(yè)殘留物的木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物含有60%～70%的葡萄糖以及30%～40%的木糖，天然微生物在存在葡萄糖的條件下會(huì)限制木糖的利用效率，因此高效代謝木糖是將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源最重要的前提條件。釀酒酵母沒有內(nèi)源性的木糖代謝途徑，基于合成生物技術(shù)引入木糖還原酶（XR）、木糖醇脫氫酶（XDH）、木糖異構(gòu)酶（XI）重構(gòu)木糖代謝途徑，使得釀酒酵母可以將木糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟就牵竽就窃趦?nèi)源性木酮糖激酶（XK）的催化下生成5-磷酸木酮糖從而進(jìn)入磷酸戊糖途徑。釀酒酵母偏好葡萄糖作為碳源，并且擁有復(fù)雜的葡萄糖感知和調(diào)控機(jī)制［89］，為了實(shí)現(xiàn)木糖和葡萄糖的同時(shí)高效利用，適配木糖代謝途徑關(guān)鍵酶表達(dá)水平、維持胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)尤為重要。Hou 等［90］通過引入異源不受葡萄糖抑制的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Meyerozyma guilliermondii來源的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mgt05196p 的突變體N360F），在葡萄糖存在的條件下釀酒酵母的木糖攝取速率依然顯著提高。

（2）乙酰輔酶A 乙酰輔酶A 是重要的生物制品，可以衍生合成多種化學(xué)品。釀酒酵母內(nèi)的乙酰輔酶A代謝機(jī)制較為復(fù)雜，兩個(gè)乙酰輔酶A合成酶（ACS1 和ACS2）的活性被嚴(yán)格調(diào)控，ACS1 被葡萄糖抑制，ACS2 在葡萄糖為碳源時(shí)表達(dá)，基于此，Kozak 等［91］在釀酒酵母內(nèi)重構(gòu)來源于沙門氏菌的突變體ACS 和醛脫氫酶（ALD6），顯著提高乙酰輔酶A的代謝池。

（3）萜類化合物 萜類化合物是由多個(gè)單元的焦磷酸異戊烯基焦磷酸酯（IPP）及其異構(gòu)體焦磷酸二甲基烯丙酯（DMAPP）組成的有機(jī)化合物。相比于大腸桿菌，釀酒酵母更適合表達(dá)涉及細(xì)胞色素P450 酶的萜類代謝途徑途徑。MVA 途徑是釀酒酵母中唯一的IPP 合成途徑，并且具有很高的合成效率，且IPP 理論上可占細(xì)胞干重的5%。香葉醇［92］、檸檬烯［93］、人參皂苷［94］、青蒿酸［95］等萜類化合物均已在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了高效合成，其中青蒿酸作為合成生物學(xué)里程碑式的產(chǎn)物，其在釀酒酵母內(nèi)的發(fā)酵產(chǎn)量高達(dá)25 g/L。2019 年Keasling 等［96］以釀酒酵母作為底盤細(xì)胞，首次成功實(shí)現(xiàn)了大麻素及其相關(guān)衍生物的異源代謝合成。

（4）芳香族化合物 芳香族化合物衍生自酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸三種芳香族氨基酸［97］。芳香族氨基酸主要通過由糖酵解途徑的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和磷酸戊糖途徑的赤蘚糖-4-磷酸（E4P）為前體合成分支酸（chorismate）的莽草酸途徑（shikimate pathway），分支酸進(jìn)一步生成鄰氨基苯甲酸（anthranilate）和苯甲酸酯（prephenate），而鄰氨基苯甲酸生成色氨酸，苯甲酸酯生成苯丙氨酸和酪氨酸。色氨酸可進(jìn)一步衍生形成喹啉生物堿（喜樹堿）和吲哚生物堿（長春堿），而苯丙氨酸和酪氨酸進(jìn)一步衍生形成類黃酮（柚皮素）、芪類（白藜蘆醇）和芐基異喹啉生物堿（嗎啡）［98］。Luttik等［99］通過引入對(duì)酪氨酸抑制不敏感的ARO4酶，將釀酒酵母胞內(nèi)苯丙氨酸和酪氨酸濃度提高3倍。

（5）蛋白質(zhì)合成 據(jù)估計(jì)，在營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長至對(duì)數(shù)期的釀酒酵母，每個(gè)細(xì)胞平均擁有200 000 個(gè) 核 糖 體 和 15 000～60 000 條 mRNA（30%為核糖體蛋白），受限于可用核糖體數(shù)量，每秒合成約13 000 個(gè)蛋白質(zhì)分子。翻譯延伸因子是胞內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)之一，含量可達(dá)105～106［100］。因此，釀酒酵母是疫苗、醫(yī)用蛋白生物合成的重要宿主，目前釀酒酵母作為生物制造系統(tǒng)已成功應(yīng)用于乙型肝炎表面抗原、胰島素、胰高血糖素、尿酸氧化酶、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和血小板衍生生長因子等物質(zhì)的生物合成，但是，釀酒酵母蛋白質(zhì)糖基化過高、較低的蛋白表達(dá)能力成為其擴(kuò)大工業(yè)應(yīng)用范圍的主要限制因素［101］。

2.4.2 巴斯德畢赤酵母

極佳的蛋白分泌能力、優(yōu)異的翻譯后修飾（糖基化與二硫鍵）以及胞外內(nèi)源性蛋白極少使得畢赤酵母成為異源蛋白表達(dá)的理想生物制造系統(tǒng)之一。2009 年 de Schutter 等［102］首次對(duì)畢赤酵母進(jìn)行全基因組的解析。畢赤酵母擁有極強(qiáng)的甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子AOX1，啟動(dòng)子AOX1 啟動(dòng)子被甲醇強(qiáng)誘導(dǎo)，被葡萄糖、甘油和乙醇抑制。山梨醇不會(huì)抑制或誘導(dǎo)AOX1 啟動(dòng)子，因此與甲醇混合補(bǔ)料，可以提高細(xì)胞密度和生產(chǎn)速率。畢赤酵母在表達(dá)木聚糖酶、甘露聚糖酶和漆酶等半纖維素酶方面擁有顯著優(yōu)勢，特別是表達(dá)含糖基化的酶時(shí)，目的蛋白酶會(huì)具有更好的熱穩(wěn)定性，從而減少工業(yè)處理步驟中的冷卻過程，節(jié)約能源和時(shí)間。此外，畢赤酵母作為生物制造系統(tǒng)也被廣泛應(yīng)用于人促紅細(xì)胞生成素、磷脂酶C、人超氧化物歧化酶、胰蛋白酶、人血清白蛋白、膠原蛋白和人單克隆抗體等醫(yī)用蛋白的生物合成［103］。

典型模式宿主系統(tǒng)及適用范圍總結(jié)于表1。

表1 典型模式宿主系統(tǒng)及適用范圍總結(jié)Tab.1 Summary of various typical model organism system and their scope of application

3 展 望

基于合成生物技術(shù)對(duì)現(xiàn)有天然存在的生物制造系統(tǒng)進(jìn)行目的性的改造，使其滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求的高版本底盤細(xì)胞是解決資源可持續(xù)化發(fā)展的重要途徑之一［104-105］。本文簡述了合成生物技術(shù)的研究發(fā)展，并著重總結(jié)了當(dāng)前典型模式菌株的代謝特性及其應(yīng)用范圍，然而目前構(gòu)建高效的生物制造系統(tǒng)仍然在以下方面值得進(jìn)一步探索：

（1）制定合成生物技術(shù)工具元件標(biāo)準(zhǔn)的必要性 目前，合成生物技術(shù)發(fā)展處于快速發(fā)展的初級(jí)階段，合成生物技術(shù)新工具和新策略開發(fā)速度較快，然而大部分合成生物學(xué)元件處于缺乏行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)約束的自由定義的狀態(tài)，導(dǎo)致業(yè)內(nèi)共享難度較大，不利于合成生物學(xué)的長久發(fā)展。因此，應(yīng)為在特定條件下的特定目的制定標(biāo)準(zhǔn)化工具元件，以其作為基準(zhǔn)來標(biāo)注新工具和新策略的有效性，便于科研創(chuàng)新的原創(chuàng)性和健康發(fā)展。

（2）制定合成生物技術(shù)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的必要性隨著基因編輯和高通量自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的發(fā)展，合成生物技術(shù)領(lǐng)域的數(shù)據(jù)量呈現(xiàn)爆發(fā)式的增長，如何統(tǒng)計(jì)、分析和使用數(shù)據(jù)成為新時(shí)代合成生物所面臨的重要問題。盡管目前發(fā)表刊物已經(jīng)加強(qiáng)對(duì)原始數(shù)據(jù)的要求，但是如何強(qiáng)化數(shù)據(jù)的有效性仍然具有挑戰(zhàn)。例如，僅改動(dòng)一個(gè)基因、一個(gè)微量元素、一個(gè)培養(yǎng)溫度，都可能會(huì)對(duì)目的數(shù)據(jù)產(chǎn)生巨大的影響。因此，制定數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)有助于從紛繁眾多的數(shù)據(jù)中擇取有效數(shù)據(jù)具有重要作用。

（3）開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化工作平臺(tái)的必要性 合成生物學(xué)是一門背景復(fù)雜、學(xué)科交叉的前沿生命科學(xué)學(xué)科，為了探究表象特征背后復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，往往需要大量的有效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，一般情況下，越大量的有效數(shù)據(jù)意味著越接近真相本質(zhì)。為此，開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化工作平臺(tái)，不僅可以顯著提高數(shù)據(jù)量，而且可以避免人為因素引入的非必要誤差。

（4）開發(fā)更加精細(xì)化、多元化、全局化、普適化的合成生物技術(shù) 目前的合成生物技術(shù)設(shè)計(jì)和應(yīng)用方面仍存在調(diào)控范圍局限、普適性差、手段單一等缺點(diǎn)，而對(duì)于非典型模式宿主而言，基因編輯工具不足、代謝調(diào)控策略的滯后性都將導(dǎo)致生物制造系統(tǒng)構(gòu)建效率低下，嚴(yán)重限制了如極端微生物等非典型模式宿主的應(yīng)用。因此，開發(fā)更加精細(xì)化、多元化、全局化、普適化的合成生物技術(shù)具有重要意義。

（5）簡便、系統(tǒng)的構(gòu)建高效的生物制造系統(tǒng)典型的模式宿主其代謝機(jī)理研究雖較為成熟，但卻呈現(xiàn)出模塊化、孤立化的特點(diǎn)。當(dāng)對(duì)某一基因節(jié)點(diǎn)進(jìn)行代謝改造時(shí)，往往會(huì)帶來非預(yù)期范圍內(nèi)的結(jié)果。機(jī)器學(xué)習(xí)與合成生物技術(shù)的交叉發(fā)展有望讓構(gòu)建高效的生物制造系統(tǒng)變得全面、系統(tǒng)、簡便。建立全細(xì)胞數(shù)學(xué)模型，將細(xì)胞全局?jǐn)?shù)字化。基于全細(xì)胞數(shù)學(xué)模型構(gòu)建高效的生物制造系統(tǒng)時(shí)，可以進(jìn)行“自上而下”的預(yù)測-輸入代謝改造策略后輸出全局預(yù)期結(jié)果，或進(jìn)行“自下而上”模擬-輸入預(yù)期改造結(jié)果輸出所需的代謝改造策略。