唐可人，李盼，段夢琪，張健，張芳芳，王珍梅，董世雄，強巴央宗，商鵬*

(1. 西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2. 黑龍江省大慶市杜爾伯特蒙古族自治縣一心鄉(xiāng)畜牧水產(chǎn)中心，黑龍江 大慶 163000)

脂肪不僅作為動物機體重要的能量來源之一，同時在畜禽肉產(chǎn)品中與瘦肉率和肉品質(zhì)具有密切聯(lián)系。通常情況下，動物脂肪合成和代謝是脂肪沉積的一種平衡狀態(tài)，脂肪沉積的增加或減少會影響肉品質(zhì)[1]。因此，豬脂肪沉積能力已成為影響豬肉品質(zhì)最關(guān)鍵因素[2]。動物機體脂肪沉積與代謝受多基因調(diào)控，目前已經(jīng)報道的與脂肪沉積和代謝的基因主要包括脂肪細(xì)胞決定和分化因子1(ADD1)、脂肪和肥胖相關(guān)基因(FTO)、脂肪酸合成相關(guān)酶、脂肪酸分解相關(guān)酶等[3]。本研究團隊前期對藏豬和大約克豬肌肉組織進行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)(RNA-seq測序技術(shù))和蛋白質(zhì)組學(xué)(isobaric tags for relative and absolute quantifi-cation, iTRAQ蛋白質(zhì)譜技術(shù))的聯(lián)合分析，確定了中鏈酰基輔酶A脫氫酶(acyl-CoA dehydrogenase，ACADM)為脂肪沉積性狀關(guān)鍵差異表達基因[4]。

ACADM是4個?；o酶A脫氫酶(ACAD)之一，由9種已知蛋白質(zhì)組成，主要參與催化中鏈脂肪酸的β-氧化[5]。ACADM基因位于SSC6上的QTL區(qū)間，因此它可能是一個與肥胖和生長性狀相關(guān)的重要候選基因[6]，該基因的缺乏會引起機體分解中鏈脂肪酸能力下降和肝功能異常，甚至?xí)?dǎo)致動物死亡[7]。Mitsuyoshi等[8]通過對從74例非酒精性脂肪性肝病活檢標(biāo)本的ACADM基因轉(zhuǎn)錄水平定量分析，發(fā)現(xiàn)患者的表達水平顯著高于對照組，且隨病情發(fā)展顯著降低，這與該基因的脂肪變性和脂肪沉積有關(guān)。因此，本試驗以脂肪型豬種(藏豬)和瘦肉型豬種(大約克豬)為研究對象，對ACADM基因起始密碼子上游1 kb區(qū)域進行了多態(tài)性分析；并采用RT-qPCR技術(shù)檢測ACADM基因在肝臟、背脂、背最長肌和心臟組織中的表達差異，聯(lián)合其背膘厚和背最長肌組織中肌內(nèi)脂肪含量進行相關(guān)性分析，旨在初步探究ACADM基因?qū)ωi脂肪沉積性狀的影響，以期為開發(fā)脂肪沉積性狀有效遺傳標(biāo)記及育種工作提供一定的思路和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以藏豬和大約克豬為研究對象，藏豬來源于西藏農(nóng)牧學(xué)院教學(xué)實習(xí)牧場，大約克豬來源于林芝市銀豐農(nóng)牧科技有限公司養(yǎng)殖場。共采集118份藏豬和大約克豬耳組織(藏豬58頭，大約克豬60頭)，置于75%酒精中，-20 ℃冰箱保存，用于DNA提取。隨機挑選180日齡藏豬和大約克豬各10頭，無親緣關(guān)系，相同的日糧水平，自由采食的模式飼養(yǎng)。屠宰后，按照文獻[9]三點法測定背膘厚；采集肝臟、背脂、心臟和背最長肌組織，液氮速凍，-80 ℃保存，用于RNA提取。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA制備

采用苯酚-氯仿法從耳組織中提取總DNA，將其溶解在RNase-Free ddH2O中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，DP171221)提取總RNA；采用一步法cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化科技有限公司，KR180123)對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，將所得合格的cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 單核苷酸多態(tài)性(SNPs)篩選與基因分型引物設(shè)計

下載GenBank中豬ACADM(登錄號NC_010448.4)基因起始密碼子上游1 kb區(qū)域DNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成，TE緩沖液溶解，4 ℃保存。

表1 ACADM基因5′側(cè)翼區(qū)引物信息

1.4 RT-qPCR引物設(shè)計

下載GenBank中豬的ACADM(登錄號XM_003359209.1)mRNA序列，以RNF7(登錄號NM_001245011.1)為內(nèi)參基因[10]，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合成，TE緩沖液溶解，4 ℃保存。

表2 ACADM基因和RNF7基因?qū)崟r熒光定量引物信息

1.5 基因型頻率與等位基因頻率檢測

采用Sanger測序法對ACADM基因起始密碼子上游1 kb區(qū)域DNA序列進行混池測序檢測，每個品種各10頭，用Chromas Pro和DNAMAN 6.0軟件進行序列比對分析，篩選SNPs位點后，擴大樣本進行個體測序，測序工作由上海生工生物工程有限公司完成，統(tǒng)計基因型頻率與等位基因頻率。分別對ACADM基因2個突變位點進行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點在http://jaspar.binf.ku.dk/網(wǎng)站上進行搜索。

1.6 RT-qPCR分析

以cDNA為模板，對ACADM和RNF7基因利用Eppendorf Mastercycler PCR儀進行擴增，每個樣品點設(shè)置3個重復(fù)。20 μL反應(yīng)體系，包括SYBR Green Mix(北京天根生化科技有限公司，F(xiàn)P171206)10 μL，上、下游引物(10 μmol /L)各1 μL，RNase-free water 7 μL，cDNA模板1 μL。熒光定量PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，80 ℃檢測熒光，共38個循環(huán)。樣品mRNA的相對表達量使用2-ΔΔCt法[11]進行計算。

1.7 肌內(nèi)脂肪含量測定

采用傳統(tǒng)索氏抽提法測定肌內(nèi)脂肪含量，參照文獻[12]，最后計算每個樣品的肌內(nèi)脂肪含量值。

1.8 統(tǒng)計與分析

利用SPSS 18.0軟件分別對ACADM基因表達量進行雙因素(品種和組織)分析以及背膘厚、ACADM基因背最長肌表達量與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù))分析，使用Pearson chi-square對ACADM基因的基因型頻率和等位基因頻率進行顯著性檢驗，測定結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNPs篩選

在ACADM基因起始密碼子上游1 kb區(qū)域共發(fā)現(xiàn)2個多態(tài)性位點(圖1a、圖1b)，分別在起始密碼子上游101和569 bp位置發(fā)現(xiàn)C/G突變，記為C-101G(圖1a)和C-569G(圖1b)。

a.C-101G位點； b.C-569G位點

2.2 ACADM基因多態(tài)性位點基因型頻率和等位基因頻率分布分析

由表3可知，在品種內(nèi)，C-101G和C-569G的基因型分布在藏豬和大約克豬中均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)；在品種間，C-101G和C-569G位點的基因型頻率呈極顯著差異(P<0.01)，藏豬群體中的優(yōu)勢基因型均為CC型，大約克豬群體中的優(yōu)勢基因型為GG型。

通過網(wǎng)站轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測發(fā)現(xiàn)SNPs位點堿基突變前后部分轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點消失和新轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)藏豬ACADM基因5′側(cè)翼區(qū)2個SNPs位點C-101G突變后存在Tcf12、KLF5、KLF1、KLF4等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點；C-569G突變后存在CEBPA、CEBPB、Rxra等多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，這些位點大多參與動物機體生長發(fā)育，調(diào)控脂肪沉積和低氧誘導(dǎo)因子信號通路，這可能與ACADM基因的表達調(diào)控有關(guān)。

2.3 不同組織中ACADM mRNA定量分析比較

由圖2可見，藏豬肝臟、背脂、背最長肌和心臟組織中ACADM mRNA水平均極顯著高于大約克豬(P<0.01)。

2.4 藏豬、大約克豬屠宰胴體重與背膘厚檢測比較

由表4可見，180日齡藏豬屠宰胴體重極顯著低于大約克豬(P<0.01)；藏豬的背膘厚極顯著高于大約克豬(P<0.01)。

表3 藏豬、大約克豬ACADM基因多態(tài)性位點基因型頻率和等位基因頻率分析

**表示P<0.01

表4 藏豬、大約克豬屠宰胴體重與背膘厚檢測比較

2.5 藏豬、大約克豬肌內(nèi)脂肪含量測定

由表5可見，180 日齡藏豬背最長肌肌內(nèi)脂肪含量極顯著高于大約克豬(P<0.01)。

表5 藏豬、大約克豬背最長肌肌內(nèi)脂肪含量比較 %

2.6 背最長肌ACADM基因表達量與背膘厚、肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)性分析

ACADM基因在背最長肌中的mRNA相對表達量與背膘厚呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.92；與肌內(nèi)脂肪含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.93。

3 討論

ACADM 是中鏈脂肪酸(C4-C12直鏈)β-氧化的關(guān)鍵酶，在維持能量平衡中起著重要作用，通過將?；o酶A轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A單元，以作為其他組織的能量來源[13]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，在藏豬與長白豬的背最長肌組織中，棕櫚酸、棕櫚油酸和花生酸具有顯著的差異，同時飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸2個豬種也具有顯著的差異，但是在中鏈脂肪酸上，現(xiàn)階段并沒有藏豬的相關(guān)報道[14-15]。有研究報道，ACADM基因在動物各個組織中均有表達，在肝臟、骨骼肌和心臟等組織中高表達[16]，與本研究的結(jié)果基本一致。Ji等[17]通過檢測延邊黃牛和延黃牛ACADM基因在不同組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)其在牛的多個組織中均有表達，在肝臟中的表達水平顯著高于其他組織，且在牛脂肪組織中表達水平顯著高于背最長肌，與本試驗中藏豬的結(jié)果趨于一致，而與大約克豬的表達模式在肝臟組織中略有差異?？赡苁怯捎诖蠹s克豬在人工高強度選育下，脂肪沉積能力明顯下降[18]。藏豬是我國青藏高原特有的原始地方品種，至今還未開展系統(tǒng)的選育工作[19]。藏豬具有慢生長速度和高脂肪沉積能力的特點，大約克豬具有快生長速度和高瘦肉率的特性[20]，兩者具有明顯的差異。通過對藏豬和大約克豬背膘厚和肌內(nèi)脂肪含量測定發(fā)現(xiàn)，藏豬極顯著高于大約克豬，完全符合其品種特性。Wang等[21]通過脂肪沉積相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)ACADM基因是導(dǎo)致藏豬高脂肪沉積能力的原因之一。本試驗中，藏豬在肝臟、背脂、心臟和背最長肌組織中mRNA的表達水平均極顯著高于大約克豬，說明ACADM基因的mRNA的表達量與脂肪沉積能力呈正相關(guān)，進一步證實了ACADM基因可能影響豬的脂肪沉積性狀。

本試驗在ACADM基因起始密碼子上游1 kb區(qū)域發(fā)現(xiàn)了2個新的SNPs(C-101G和C-569G)位點，且在品種間C-101G和C-569G位點的基因型頻率呈極顯著差異。通過轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測后發(fā)現(xiàn)在C-101G位點突變前后出現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)錄因子KLF5編碼的蛋白，該蛋白與機體的脂肪沉積有關(guān)，是脂肪細(xì)胞分化正轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵因子[22-23]。這可能是導(dǎo)致藏豬脂肪沉積能力強、肌內(nèi)脂肪含量高的原因之一。在C-569G位點突變前后出現(xiàn)了新的CEBPA基因結(jié)合位點，該基因?qū)游镏炯?xì)胞分化、發(fā)育和脂肪沉積有重要作用，是控制脂肪沉積和肌內(nèi)脂肪生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[24-25]。因此推測這2個SNPs位點可能是影響豬脂肪沉積能力的重要調(diào)控位點，但具體調(diào)控機制和功能尚需進一步研究，下一步將開展不同基因型個體和脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)性分析。

4 結(jié)論

綜上所述，本試驗通過對藏豬和大約克豬ACADM基因起始密碼子上游1 kb區(qū)域DNA序列的多態(tài)性和不同組織中ACADM基因mRNA表達量的檢測，以及背膘厚和肌內(nèi)脂肪含量測定分析，發(fā)現(xiàn)ACADM基因mRNA的表達量與背膘厚、肌內(nèi)脂肪含量呈顯著正相關(guān)，該基因可能是影響脂肪沉積性狀及肉品質(zhì)的重要候選基因，推測C-101G和C-569G這2個SNPs位點可能是影響豬脂肪沉積能力的重要調(diào)控位點，為進一步開展ACADM基因?qū)ωi脂肪沉積的調(diào)控機制研究提供了重要支撐。