康瑞芬 王 猛 沈家鯤 金曉明 李春梅

(南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，南京210095)

霉菌毒素是由多種自然界中真菌產(chǎn)生的高度多樣化的次級代謝產(chǎn)物，會污染食物和飼料，導致人和動物霉菌毒素中毒[1]。T-2毒素屬于單端孢霉烯族A類化合物，主要由鐮刀菌屬產(chǎn)生，如梨孢鐮刀菌、枝孢鐮刀菌、擬孢鐮刀菌和三線鐮刀菌等[2]。在單端孢霉烯族霉菌毒素中，雖然T-2毒素的檢出率較低，但其毒性最強，且廣泛存在于大麥、小麥、燕麥和玉米等谷物中[3]，嚴重危害家畜健康，影響畜牧業(yè)的發(fā)展，因此受到廣泛關注。T-2毒素的產(chǎn)生及飼料和食品的污染程度與多種因素有關，如遺傳因素、環(huán)境溫濕度、底物溫濕度和氧氣含量[4]。作物在田間生長期間以及收割后儲存不當均會產(chǎn)生T-2毒素。

T-2毒素在歐洲聯(lián)盟國(EU)是谷物樣品中常見的污染物，人和動物被暴露T-2毒素的風險大大增加，因此對人和動物的健康構成了威脅[5]。對來自22個歐洲國家的20 519個飼料和谷物樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)谷物中特別是燕麥和燕麥產(chǎn)品中存在T-2和HT-2毒素[6]。Gruber-Dorninger等[7]進行的10年全球飼料中真菌毒素含量調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，19%的樣品被T-2毒素污染。中國飼料樣品中T-2毒素的污染率為79.5%，這些樣品中T-2毒素的含量最高為735 ng/g[8]。Morcia等[9]報告指出，從2011年至2014年，意大利大麥樣品中T-2毒素和HT-2毒素的陽性率在22%～53%。在對克羅地亞、波斯尼亞和黑塞哥維那的一項研究發(fā)現(xiàn)，在340個未加工燕麥樣品中，T-2毒素的檢出率為86.1%，T-2毒素的含量最高為304.2 μg/kg[10]。T-2和HT-2毒素也是英國有機和傳統(tǒng)燕麥中最常檢出的鐮刀菌毒素，超標率分別為84%和92%[11]。

T-2毒素的主要毒性機制為通過與60S核糖體亞基上的肽基轉移酶相互作用抑制蛋白質(zhì)合成，誘導細胞發(fā)生核糖體應激反應，激活c-Jun N端激酶(JNK)/p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)，參與機體的許多生理過程，如破壞細胞穩(wěn)態(tài)，抑制細胞生長和分化，引起細胞凋亡[12]。小腸是營養(yǎng)物質(zhì)主要的吸收部位，也是抵御外界物質(zhì)的第1道物理屏障，對維持動物的健康至關重要[13]。豬空腸上皮細胞(intestinal porcine epithelial cells, IPEC-J2)是從沒有喂食的新生仔豬空腸中分離的細胞系，保留了腸道上皮的性質(zhì)，可作為研究腸上皮固有功能的簡便模型[14]。該細胞系具備非轉化、非致瘤的特點，可分泌黏液素，產(chǎn)生細胞因子和趨化因子[15]，表達與免疫系統(tǒng)相關的蛋白質(zhì)，例如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[16]。因此，IPEC-J2被廣泛用于研究外源物質(zhì)對腸道免疫功能、通透性和創(chuàng)傷后愈合能力的影響[17-18]。Pinton等[19]發(fā)現(xiàn)動物攝入T-2毒素污染的飼料后，會誘發(fā)胃腸道發(fā)生壞死性病變。Goossens等[20]發(fā)現(xiàn)T-2毒素處理IPEC-J2，會降低細胞跨膜電阻(TEER)值，增加細胞通透性，破壞腸道屏障。Verbrugghe等[21]發(fā)現(xiàn)T-2毒素處理IPEC-J2，鼠傷寒沙門氏菌跨IPEC-J2單層的轉運明顯增加，說明細胞屏障被破壞。Romero等[22]發(fā)現(xiàn)T-2毒素降低結直腸腺癌細胞(Caco-2)的TEER值以及緊密連接相關基因的轉錄水平。

研究表明，大部分霉菌毒素的毒性由氧化應激介導[23- 24]，氧化應激會引起腸上皮細胞凋亡，誘導腸道發(fā)生炎性反應[25]。N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)是一種含硫醇的抗氧化劑，能夠有效清除活性氧(ROS)，有助于維持細胞內(nèi)的氧化和抗氧化平衡[26]。據(jù)報道，NAC可以保護細胞免受氧化應激，抑制腸道損傷，降低腸道脂質(zhì)過氧化和自由基水平，促進抗氧化酶活性的恢復[27]。目前，關于T-2毒素誘導的腸屏障功能異常的確切機制尚不清楚，其毒性作用是否和氧化應激有關有待驗證。因此，本試驗以IPEC-J2為試驗對象，旨在揭示T-2毒素對腸道的損傷機理，為防御T-2毒素對人和動物腸道損傷提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞的來源與培養(yǎng)

IPEC-J2購買自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物有限公司。細胞完全培養(yǎng)基由DMEM高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS)和1%抗生素(10 kU/mL青霉素、10 mg/mL鏈霉素和25 μg/mL兩性霉素B)組成。將細胞在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)供應5%的CO2。

1.2 試驗試劑及儀器

T-2毒素購自北京百靈威科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素購自美國GIBCO公司；NAC、四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒、ROS試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒和總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒均購自南京建成生物研究所；抗體核轉錄因子-κB(NF-κB)購自美國Abcam公司；反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自南京擎科生物科技有限公司。

CO2細胞培養(yǎng)箱、全波長酶標儀購自美國Thermo公司；LSM700激光共聚焦顯微鏡購自德國Zeiss公司；梯度PCR熱循環(huán)儀購自日本TaKaRa公司；熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 細胞活力測定

細胞傳代后，待細胞融合度達到80%，將細胞消化下來，進行細胞計數(shù)并將細胞懸液進行稀釋。細胞以1×105個/mL濃度接入96孔板，待細胞融合度達到80%，用不同濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 ng/mL)的T-2毒素處理處理細胞12、24、48 h，參照MTT試劑盒說明書進行細胞活力測定，以確定適宜的T-2毒素濃度和處理時間。

1.4 試驗設計與處理

以IPEC-J2為模型細胞，試驗分為4個組，分別為對照組(Con組)、NAC組(4.0 mmol/L NAC)、T-2組(4.0 ng/mL T-2毒素)和T-2+NAC組(4.0 ng/mL T-2毒素+4.0 mmol/L NAC)。T-2毒素溶于二甲基亞砜(DMSO)并配制成1 mg/mL的貯存液于-20 ℃保存，用基礎培養(yǎng)基稀釋到4.0 ng/mL并于4 ℃保存。NAC用滅菌雙蒸水配制成0.5 mmol/L的貯存液，置于4 ℃保存。將消化后的細胞以均等濃度接種到96孔板或6孔板(不同試驗，接種板不同)，當細胞融合度達到80%時，用含有相應試劑的培養(yǎng)基替代基礎培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，進行后續(xù)試驗操作。

1.5 實時熒光定量PCR檢測炎癥相關基因的相對表達量

細胞以2×105個/mL濃度接入6孔板，待細胞融合度達到80%，用T-2毒素和NAC溶液處理細胞12 h后，吸掉培養(yǎng)基，PBS清洗3次，每孔加1 mL Trizol，將細胞裂解下來，裂解液和細胞一起裝入2 mL離心管，離心機離心(4 ℃，3 500 r/min，15 min)。取上清液放入新的2 mL離心管，加0.2 mL氯仿混勻靜置5 min，放入離心機離心(4 ℃，12 000 r/min，15 min)，取上清液放入新的2 mL離心管，與上清液等體積加入異丙醇，混勻靜置10 min，離心機離心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)。棄去上清，加入1 mL 75%乙醇輕輕震蕩洗滌沉淀，離心機離心(4 ℃，7 500 r/min，5 min)。棄去上清，將裝有沉淀的離心管放入超凈臺，打開分機吹干沉淀，加入50 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解沉淀并用槍輕輕吹打均勻。測定細胞RNA濃度后，按照2×TSINGKE Master Mix反轉錄試劑盒說明書對RNA進行反轉錄，獲得cDNA；測得cDNA濃度后，將各樣品cDNA濃度稀釋到100 ng/μL，cDNA放于-20 ℃保存用于后續(xù)試驗。按照2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)試劑盒說明書加入各反應試劑，在實時熒光定量PCR儀上進行檢測。試驗數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進行相對定量計算，各個基因引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 細胞ROS水平測定

首先將細胞爬片放入12孔板，打入100 μL濃度為2×105個/mL的細胞懸液，待細胞貼壁后，再打入1 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細胞融合度達到80%，用T-2毒素和NAC溶液處理細胞12 h，測定細胞ROS水平，測定方法參照ROS檢測試劑盒說明書。

1.7 細胞抗氧化指標檢測

細胞以2×105個/mL濃度接入6孔板，待細胞融合度達到80%，用T-2毒素和NAC溶液處理細胞12 h后，用細胞刮板將細胞刮下來，和培養(yǎng)基一起放入新的2 mL離心管，離心機離心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，收集上清液，放于-20 ℃保存。測定細胞T-SOD、CAT活性和MDA含量，測定方法參照相應的試劑盒說明書。

1.8 免疫熒光檢測蛋白相對表達量

首先將細胞爬片放入12孔板，打入100 μL濃度為2×105個/mL的細胞懸液，待細胞貼壁后，再打入1 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細胞融合度達到80%，用T-2毒素和NAC溶液處理細胞12 h。吸出培養(yǎng)基，每孔加入1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，置于搖床上清洗3次，每次5 min；移除PBS，加1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定1 h，吸掉多聚甲醛，加入PBS，搖床清洗，重復3次，每次5 min；加入100 μL TritonX-100(0.5%)通透10 min，PBS清洗3次，每次5 min；加入1 mL 1%牛血清白蛋白(BSA)，室溫封閉1 h；滴加50 μL一抗到蓋玻片上，于濕盒中避光孵育(37 ℃，1 h)；PBS清洗3次，每次5 min；滴加50 μL Alexa Fluor 488標記的二抗，于濕盒中避光孵育(37 ℃，1 h)；吸掉二抗，加入PBS，搖床清洗，重復3次，每次5 min；滴加50 μL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，濕盒中避光孵育(室溫，10 min)，PBS清洗3次，每次5 min；載玻片上滴加熒光抗淬滅劑，將細胞爬片倒置在載玻片上進行封片，激光共聚焦顯微鏡檢測熒光強度并拍照記錄。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)分析用GraphPad Prism 6.01軟件完成。首先進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，然后進行Tukey多重比較檢驗，結果表示為平均值±標準誤(mean ± SE)。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 T-2毒素對IPEC-J2活力的影響

為了確定T-2毒素對IPEC-J2的毒性，用不同濃度的T-2毒素(0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 ng/mL)處理細胞12、24、48 h后檢測細胞活力。如圖1所示，隨著T-2毒素濃度增加，細胞活力降低，且處理時間越長，細胞活力越低。與0 ng/mL T-2毒素相比，1.5、2.0、3.0和4.0 ng/mL T-2毒素處理細胞12、24、48 h后，細胞活力顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。其中，4.0 ng/mL T-2毒素處理細胞12 h后，細胞活力為74.5%；處理細胞24 h后，細胞活力為49.5%；處理細胞48 h后，細胞活力低至45.5%。因此，本試驗選擇的T-2毒素濃度和處理時間分別為4.0 ng/mL和12 h。

*表示與0 ng/mL T-2毒素相比差異顯著(P<0.05)，**表示與0 ng/mL T-2毒素相比差異極顯著(P<0.01)。

2.2 抗氧化劑NAC濃度篩選

如圖2所示，與對照組相比，T-2組細胞活力極顯著降低(P<0.01)；T-2+1 mmol/L NAC、T-2+2 mmol/L NAC、T-2+4 mmol/L NAC組細胞活力均無顯著差異(P>0.05)。T-2+4 mmol/L NAC組細胞活力高于T-2+1 mmol/L NAC和T-2+2 mmol/L NAC組(P>0.05)。因此，本試驗選擇4 mmol/L NAC作為后續(xù)試驗濃度。

1、2、4 NAC分別表示1、2、4 mmol/L NAC；**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.3 T-2毒素對IPEC-J2中炎癥相關基因表達的影響

如圖3所示，與對照組相比，T-2組IPEC-J2中TNF-α mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，NAC、T-2和T-2+NAC組IPEC-J2中白細胞介素-6(IL-6)mRNA相對表達量極顯著升高(P<0.01)，T-2+NAC組IPEC-J2中白細胞介素-10(IL-10)mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。

2.4 T-2毒素對IPEC-J2中ROS水平的影響

如圖4所示，與對照組相比，T-2組IPEC-J2中ROS水平極顯著升高(P<0.01)。與T-2組相比，T-2+NAC組IPEC-J2中ROS水平顯著降低(P<0.05)。

2.5 T-2毒素對IPEC-J2中抗氧化指標的影響

如圖5所示，與對照組相比，T-2組IPEC-J2中CAT和T-SOD活性極顯著降低(P<0.01)，IPEC-J2中MDA含量極顯著升高(P<0.01)。與T-2組相比，T-2+NAC組IPEC-J2中CAT和T-SOD活性極顯著升高(P<0.01)，IPEC-J2中MDA含量極顯著降低(P<0.01)。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

#表示與T-2組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與T-2組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

圖5 T-2毒素對IPEC-J2中抗氧化指標的影響

2.6 T-2毒素對IPEC-J2中NF-κB蛋白表達的影響

如圖6所示，與對照組相比，T-2組IPEC-J2中NF-κB蛋白相對表達量極顯著升高(P<0.01)。與T-2組相比，T-2+NAC組IPEC-J2中NF-κB蛋白相對表達量極顯著降低(P<0.01)。

3 討 論

腸道是機體的第1道物理屏障，動物攝入被霉菌毒素污染的飼料后，胃腸道可能暴露于高濃度的霉菌毒素中，引起胃腸道損傷。IPEC-J2是一種永生的腸細胞系，可在體外保持分化特征，與原代腸上皮細胞高度相似[28]。此外，IPEC-J2保留了其上皮的性質(zhì)，可模擬腸道上皮先天免疫功能，分泌黏蛋白，產(chǎn)生細胞因子和趨化因子[15]，常被用于研究腸道病原體與宿主的相互作用、豬特異性病原體的生成以及先天免疫反應[16,29]。

圖6 T-2毒素對IPEC-J2中NF-κB蛋白表達的影響

體外細胞活力測定在預測毒素毒性中起著核心作用。研究表明，不同濃度的T-2毒素處理IPEC-J2，細胞活力顯著降低，而且T-2毒素濃度越高，細胞活力越低[20]，這與本試驗的研究結果一致。細胞氧化應激主要表現(xiàn)為細胞ROS水平增加，抗氧化能力降低，如T-SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)等抗氧化酶活性降低，MDA含量增加，脂質(zhì)過氧化程度增加[30]。在本試驗中，T-2毒素極顯著降低了IPEC-J2中CAT和T-SOD活性，極顯著升高了IPEC-J2中MDA含量，極顯著增加IPEC-J2中ROS水平，從而導致氧化應激并使細胞發(fā)生炎性反應。與T-2毒素單獨處理相比，T-2+NAC處理可以極顯著降低IPEC-J2中ROS水平，極顯著升高IPEC-J2中CAT和T-SOD活性，極顯著降低IPEC-J2中MDA含量，減緩細胞的氧化應激和炎性反應。上述結果表明，T-2毒素誘導IPEC-J2發(fā)生炎性反應主要通過誘導ROS的過量產(chǎn)生，破壞氧化平衡，導致腸上皮細胞發(fā)生氧化應激。

NF-κB參與誘導多種基因的表達，在調(diào)控腸道免疫和炎性反應的多種基因的表達中起著核心作用。細胞因子和病原體刺激細胞表面受體啟動信號級聯(lián)反應，從而激活NF-κB驅動細胞增殖以及抗壞死因子分子和細胞因子釋放，以激活免疫應答[31]。同時，NF-κB調(diào)控不同類型的免疫細胞的分化，驅動單核細胞分化為巨噬細胞，M1巨噬細胞產(chǎn)生白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、TNF-α和其他促炎細胞因子，M2巨噬細胞產(chǎn)生抗炎因子IL-10[32]。IL-6是典型的多效細胞因子，由淋巴樣和非淋巴樣細胞(包括上皮細胞、成纖維細胞和肌肉細胞)產(chǎn)生，參與調(diào)控免疫應答，在許多類型的腸道炎癥和手術損傷中均觀察到IL-6的過量表達[33-34]。在本試驗中，T-2毒素處理IPEC-J2 12 h后，NF-κB蛋白相對表達量極顯著增加，細胞中促炎細胞因子IL-6和TNF-α的mRNA相對表達量顯著或極顯著升高，這與其他霉菌毒素對IPEC-J2的研究結果[25]一致。與T-2組相比，T-2+NAC組的IPEC-J2中NF-κB蛋白相對表達量極顯著降低，抗炎因子IL-10的mRNA相對表達量升高，TNF-α和IL-6的mRNA相對表達量降低。以上研究結果表明，T-2毒素誘導IPEC-J2產(chǎn)生過量ROS，從而激活NF-κB蛋白的表達，促進炎癥因子的釋放，引起炎性反應。如圖7所示，T-2毒素通過ROS/NF-κB信號通路誘導IPEC-J2發(fā)生炎性反應。

IPEC-J2：豬空腸上皮細胞 intestinal porcine epithelial cells；NAC：N-乙酰-L-半胱氨酸 N-acetyl-L-cysteine；ROS：活性氧 reactive oxygen species；NF-κB：核轉錄因子-κB nuclear factor-κB；IL-6：白細胞介素-6 interleukin-6；IL-10：白細胞介素-10 interleukin-10；TNF-α：腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α。

4 結 論

T-2毒素通過誘導IPEC-J2產(chǎn)生過量的ROS，促進炎癥相關基因和NF-κB蛋白的表達，導致IPEC-J2發(fā)生炎性反應。當利用NAC抑制細胞產(chǎn)生ROS，可明顯抑制T-2毒素誘導的細胞炎性反應。