王 霞 陳智麗 馬煥交 李討討 劉 婷 馬友記,3*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070；2.新疆哈密市伊吾縣林業(yè)和草原局，哈密839300；3.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，民勤733300)

近年來，隨著依賴中草藥為原料的大健康產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，中藥材生產(chǎn)及加工過程中產(chǎn)生了大量的非藥用部位及副產(chǎn)物，造成極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境承載壓力。研究發(fā)現(xiàn)，這些未被利用的副產(chǎn)物中多富含具有增強(qiáng)免疫力、抗菌消炎、助消化的可飼用資源性物質(zhì)，可作為畜禽用藥及飼料添加劑的原料加以利用[1]。黃芪為中醫(yī)藥常用藥材之一，其有效成分主要包括黃芪多糖、黃芪黃酮和黃芪皂苷，在提高機(jī)體免疫力、抗菌、抗病毒和抗氧化等方面發(fā)揮重要作用[2]。已有研究表明，飼糧中添加黃芪能提高動物的生產(chǎn)性能和機(jī)體的免疫力，是一種理想的綠色飼料添加劑[3-4]。

脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，在系統(tǒng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮至關(guān)重要的作用?，F(xiàn)代中醫(yī)藥研究結(jié)果表明，黃芪多糖可以激活Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)介導(dǎo)的髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴的信號通路來調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)[5]。TLR是免疫細(xì)胞中最上游的模式識別受體，可檢測病原體相關(guān)的分子模式，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK)家族可介導(dǎo)TLR和白細(xì)胞介素-1受體(interleukin-1 receptor，IL-1R)的激活信號[6-7]。TLR2和IRAK4是TLR2/MyD88/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)免疫信號通路上起著重要免疫調(diào)控作用的基因[8]。TLR家族內(nèi)含有很多成員，目前在哺乳動物中至少鑒定到13個成員，TLR2是其中之一[9]。IRAK家族由4個成員組成：IRAK1、IRAK2、IRAK-M和IRAK4，這些家族成員在先天免疫、適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用[10]。然而，目前關(guān)于黃芪副產(chǎn)物對機(jī)體免疫機(jī)能影響的報(bào)道較少，為了探究飼糧中添加不同比例黃芪副產(chǎn)物對機(jī)體免疫機(jī)能的影響，本研究測定了綿羊的免疫器官指數(shù)，采用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot技術(shù)檢測了綿羊脾臟組織中TLR2和IRAK4的mRNA和蛋白的相對表達(dá)量，并運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測了TLR2和IRAK4蛋白在綿羊脾臟中的定位，以期了解黃芪副產(chǎn)物在綿羊脾臟免疫調(diào)控中的作用，為進(jìn)一步研究黃芪副產(chǎn)物對機(jī)體免疫調(diào)控的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用黃芪副產(chǎn)物為制作黃芪飲片所產(chǎn)生的下腳料，購自某醫(yī)藥公司。黃芪副產(chǎn)物經(jīng)風(fēng)干粉碎過40目篩。以葡萄糖、蘆丁、黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用比色法測得黃芪副產(chǎn)物中黃芪總多糖、總皂苷及總黃酮含量分別為13.94、0.82和1.35 mg/g。經(jīng)測定，黃芪副產(chǎn)物營養(yǎng)水平見表1。

表1 黃芪副產(chǎn)物營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選擇體況良好、健康、體重[(27.43±3.61) kg]相近的3月齡澳洲白與湖羊雜交F1公羔68只，隨機(jī)分為4組，每組17只羊。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加2%(2%組)、4%(4%組)、6%(6%組)的黃芪副產(chǎn)物?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。飼養(yǎng)試驗(yàn)在甘肅省蘭州市眾泰養(yǎng)殖有限公司進(jìn)行，預(yù)試期10 d，正試期60 d。試驗(yàn)動物分組混合飼喂，每日喂料2次，08：00和17：00各飼喂1次，自由采食，自由飲水，定期免疫驅(qū)蟲。

1.3 指標(biāo)測定及樣品采集

黃芪副產(chǎn)物及飼糧中干物質(zhì)、粗灰分、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、鈣和磷含量分別參照GB/T 6435—2014[13]、GB/T 6438—1992[14]、GB/T 6433—2006[15]、GB/T 6432—1994[16]、GB/T 20806—2006[17]、NY/T 1459—2007[18]、GB/T 6437—2002[19]和GB/T 6436—2002[20]的方法測定。

在試驗(yàn)初始和結(jié)束當(dāng)天早晨對各組試驗(yàn)羊空腹稱重，計(jì)算試驗(yàn)羊的平均日增重。試驗(yàn)期間，每天分組記錄試驗(yàn)羊的日飼喂量和剩料量，計(jì)算平均干物質(zhì)采食量[21]。試驗(yàn)期結(jié)束后每組選取3只羊，頸靜脈放血處死，收集脾臟組織稱其重量，計(jì)算脾臟指數(shù)。稱重后迅速采集脾臟組織，將一部分脾臟組織樣品放入高壓處理過的1.5 mL EP管后迅速投于液氮中，之后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存用于提取組織總RNA和總蛋白；另一部分脾臟組織樣品放入4%的多聚甲醛溶液中固定后用于制備石蠟組織切片。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表2項(xiàng)目 Items含量 Content營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)12.25代謝能 ME/(MJ/kg)9.81干物質(zhì) Dry matter90.17粗脂肪 Ether extract2.65粗蛋白質(zhì) Crude protein14.39中性洗滌纖維 Neutral detergent fiber26.35酸性洗滌纖維 Acid detergent fiber14.66鈣 Calcium1.59磷 Phosphorus1.34

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 總RNA提取與cDNA合成

使用Trizol試劑提取脾臟組織總RNA，用超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific，德國)檢測總RNA濃度和純度，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京迪寧生物有限公司)的說明合成第1鏈cDNA。

1.4.2 qRT-PCR

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載綿羊TLR2、IRAK4和β-肌動蛋白(β-actin)的mRNA序列，使用軟件Oligo 6.0設(shè)計(jì)引物，然后用Blast軟件對引物的特異性進(jìn)行檢測。引物由西安擎科生物公司合成，引物序列信息見表3。qRT-PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包括：上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，2×Fast qPCR Master Mixture (Green) 10 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL；擴(kuò)增條件為：95 ℃ 120 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。

1.4.3 Western Blot

用RIPA高效組織裂解液提取總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。用12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離變性的蛋白，然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，封閉2 h后分別加入兔源一抗TLR2(1∶1 000，北京博奧森生物公司)、IRAK4(1∶1 000，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)和β-actin(1∶1 500，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，4 ℃孵育過夜。PBST洗膜后加入二抗(1∶5 000，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)37 ℃孵育2 h。PBST洗膜后，在X光室中使用底物化學(xué)發(fā)光試劑(electrochemi-luminescence，ECL)對蛋白的陽性信號進(jìn)行可視化。

表3 引物序列信息

1.4.4 免疫組織化學(xué)染色

將石蠟切片65 ℃烤片3～5 h后，進(jìn)行脫蠟、脫水、抗原修復(fù)處理。按照免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)的操作說明滴加3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性；用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加試劑A(封閉液)室溫封閉30 min，甩掉試劑A，滴加一抗TLR2(1∶500)和IRAK4(1∶250)4 ℃過夜，用PBS代替一抗作陰性對照。PBS洗滌后滴加二抗37 ℃孵育30 min，PBS洗滌后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，自來水終止后脫水、透明、封片、鏡檢照相。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用2-ΔΔCt方法[22]計(jì)算TLR2和IRAK4的mRNA的相對表達(dá)量。用AlphaEaseFC圖像分析軟件掃描TLR2和IRAK4蛋白的灰度。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧中添加不同比例黃芪副產(chǎn)物對綿羊生長性能的影響

由表4可知，在綿羊飼糧中添加不同比例的黃芪副產(chǎn)物后，各組綿羊的終末體重、平均日增重和平均干物質(zhì)采食量差異不顯著(P>0.05)。

表4 飼糧中添加不同比例黃芪副產(chǎn)物對綿羊生長性能的影響

2.2 飼糧中添加不同比例黃芪副產(chǎn)物對綿羊脾臟指數(shù)的影響

由表5可知，在綿羊飼糧中添加不同比例的黃芪副產(chǎn)物后，2%組綿羊的脾臟指數(shù)顯著高于對照組、4%組和6%組(P<0.05)，而4%組和6%組與對照組之間差異不顯著(P>0.05)。

表5 飼糧中添加不同比例黃芪副產(chǎn)物對綿羊脾臟指數(shù)的影響

2.3 飼糧中添加不同比例黃芪副產(chǎn)物對綿羊脾臟中TLR2和IRAK4的mRNA相對表達(dá)量的影響

由圖1可知，TLR2和IRAK4的mRNA在飼喂不同比例黃芪副產(chǎn)物綿羊脾臟中均有表達(dá)，且表達(dá)趨勢相似，其mRNA相對表達(dá)量隨著黃芪副產(chǎn)物添加比例的增加而降低。2%組TLR2的mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組、4%組和6%組(P<0.05)，對照組、4%組和6%組之間差異不顯著(P>0.05)。2%組IRAK4的mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組、4%組和6%組(P<0.05)；4%組IRAK4的mRNA相對表達(dá)量顯著高于6%組(P<0.05)，但與對照組差異不顯著(P>0.05)；6%組IRAK4的mRNA相對表達(dá)量與對照組差異不顯著(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。

2.4 飼糧中添加不同比例黃芪副產(chǎn)物對綿羊脾臟中TLR2和TLR4蛋白相對表達(dá)量的影響

由圖2可知，TLR2和IRAK4蛋白在飼喂不同比例黃芪副產(chǎn)物綿羊脾臟中均有表達(dá)，且呈現(xiàn)出與mRNA相似的表達(dá)趨勢。2%組TLR2蛋白相對表達(dá)量最高，且顯著高于對照組、4%組和6%

組(P<0.05)，4%組和6%組顯著高于對照組(P<0.05)。2%組IRAK4蛋白相對表達(dá)量最高，且顯著高于對照組、4%組和6%組(P<0.05)；4%組IRAK4蛋白相對表達(dá)量顯著高于對照組和6%組(P<0.05)，6%組與對照組差異不顯著(P>0.05)。

圖2 飼糧中添加不同比例黃芪副產(chǎn)物對綿羊脾臟中TLR2和IRAK4蛋白相對表達(dá)量的影響

2.5 TLR2和IRAK4蛋白在飼喂不同比例黃芪副產(chǎn)物綿羊脾臟中的定位

由圖3可知，運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測TLR2和IRAK4蛋白在飼喂不同比例黃芪副產(chǎn)物綿羊脾臟中的定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR2蛋白的免疫陽性信號主要定位在飼喂不同比例黃芪副產(chǎn)物綿羊脾臟紅髓的脾竇中，IRAK4蛋白的免疫陽性信號主要定位在飼喂不同比例黃芪副產(chǎn)物綿羊脾臟紅髓的脾索中，且2%組的免疫陽性信號較高。

A1～A4：對照組、2%組、4%組和6%組脾臟中TLR2蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(400×)；B1～B4：對照組、2%組、4%組和6%組脾臟中IRAK4蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(400×)；C1～C4：對照組、2%組、4%組和6%組陰性對照(400×)；C：脾索，S：脾竇。

3 討 論

黃芪藥材生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物具有較高的營養(yǎng)物質(zhì)，其含有與其藥用部位相似的化學(xué)組分[23]。黃芪的有效成分主要是黃芪多糖，黃芪多糖可以通過調(diào)節(jié)宿主免疫器官、免疫細(xì)胞及免疫分子，促進(jìn)特異性與非特異性免疫以及多種信號通路作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[24]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加一定比例的黃芪可以促進(jìn)動物生長發(fā)育、增加免疫器官質(zhì)量、提高免疫器官指數(shù)、改善抗氧化能力和增強(qiáng)機(jī)體免疫力[25]。體增重是衡量綿羊生長性能的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綿羊飼糧中添加不同比例的黃芪副產(chǎn)物后各組羔羊的平均日增重和平均干物質(zhì)采食量差異不顯著，這表明飼糧中添加不同比例的黃芪副產(chǎn)物對綿羊生長發(fā)育無顯著影響。免疫器官的重量是反映機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)，脾臟指數(shù)能反映免疫器官的發(fā)育和免疫細(xì)胞的功能狀況[26]。馬發(fā)順等[27]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加黃芪多糖可以顯著提高免疫器官指數(shù)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加2%黃芪副產(chǎn)物可顯著提高綿羊的脾臟指數(shù)，飼糧中添加4%和6%黃芪副產(chǎn)物對綿羊的脾臟指數(shù)無顯著影響，這表明基礎(chǔ)飼糧中添加2%的黃芪副產(chǎn)物可以促進(jìn)機(jī)體免疫器官發(fā)育。

TLR信號通路在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，IRAK4是調(diào)控IRAK1生物活性以及其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，在TLR介導(dǎo)的信號通路中起重要的免疫調(diào)控作用[28]。研究表明，營養(yǎng)物質(zhì)可以調(diào)控TLR信號通路相關(guān)基因的表達(dá)水平[29-30]。王海鷹[31]研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖可以通過TLR2通路來激活NF-κB信號。韓乾杰[32]研究表明，黃芪多糖可以提高斷奶仔豬生長性能，增強(qiáng)仔豬免疫功能，并通過調(diào)節(jié)腸道TLR4/NF-κB信號通路緩解機(jī)體過度免疫應(yīng)激。為了探究飼糧中添加不同比例黃芪副產(chǎn)物是否調(diào)控TLR2信號通路相關(guān)基因的表達(dá)水平，本研究檢測了TLR2和IRAK4 mRNA在飼喂不同比例黃芪副產(chǎn)物綿羊脾臟中的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，TLR2和IRAK4 mRNA在所有檢測的綿羊脾臟組織中均有表達(dá)，飼喂黃芪副產(chǎn)物的綿羊脾臟中TLR2和IRAK4的mRNA相對表達(dá)量均高于對照組，且以2%組最高，其表達(dá)量隨著黃芪副產(chǎn)物添加比例的增加而降低。對飼喂不同比例黃芪副產(chǎn)物綿羊脾臟中TLR2和IRAK4蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR2和IRAK4蛋白的表達(dá)趨勢與mRNA的表達(dá)趨勢一致，2%組TLR2和IRAK4蛋白的相對表達(dá)顯著高于對照組，隨著黃芪副產(chǎn)物添加比例的升高，其表達(dá)量呈降低趨勢，與楊茹茜[33]的研究結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加一定比例的黃芪副產(chǎn)物可以增加機(jī)體TLR2和IRAK4的mRNA相對表達(dá)量，且添加比例為2%時的效果最好。王憲舉等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪添加量過高時會導(dǎo)致動物采食過多次生功能性物質(zhì)，從而抑制家畜營養(yǎng)利用。Guo等[35]在鵪鶉飼糧中添加1%、3%和5%的黃芪莖葉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼糧中添加3%的黃芪莖葉在整個試驗(yàn)期間能顯著提高平均日增重和平均日采食量，并促進(jìn)免疫器官發(fā)育。這些研究結(jié)果表明飼糧中添加適宜比例的黃芪可以促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育和提高免疫力，而添加過量的黃芪會對機(jī)體造成負(fù)影響[36]。本試驗(yàn)隨著黃芪副產(chǎn)物添加比例的增加綿羊脾臟指數(shù)以及TLR2和IRAK4的mRNA相對表達(dá)量呈降低趨勢，這可能是隨著黃芪副產(chǎn)物添加比例的增加，綿羊采食過多次生功能性物質(zhì)，抑制了營養(yǎng)利用，對機(jī)體造成了負(fù)影響。

TLR是一類普遍存在于天然免疫系統(tǒng)中的模式識別受體，通常表達(dá)于巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的表面[37]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能增加巨噬細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，提高自然殺傷細(xì)胞的活性[38-39]。通過細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，TLR2蛋白的免疫陽性信號主要分布在飼喂不同比例黃芪副產(chǎn)物綿羊脾臟紅髓脾竇中，IRAK4蛋白的免疫陽性信號主要分布在飼喂不同比例黃芪副產(chǎn)物綿羊脾臟紅髓脾索中，其中2%組的免疫陽性信號較高。脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，主要由3部分組成：白髓、紅髓和邊緣區(qū)，每一部分都含有大量的免疫細(xì)胞[40]。研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖可通過與免疫細(xì)胞表面的多種受體結(jié)合，激活不同的信號通路來調(diào)控動物機(jī)體的免疫系統(tǒng)，其中TLR2可以結(jié)合糖基配體，介導(dǎo)免疫細(xì)胞激活細(xì)胞內(nèi)信號通路，參與免疫調(diào)節(jié)[41]。據(jù)此推測，黃芪副產(chǎn)物對機(jī)體免疫機(jī)能的調(diào)控可能是通過與紅髓內(nèi)免疫細(xì)胞的受體TLR2結(jié)合激活信號通路，刺激下游IRAK4基因的表達(dá)，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。但是，黃芪副產(chǎn)物對機(jī)體具體免疫機(jī)制尚需進(jìn)行更深入的探究。

4 結(jié) 論

基礎(chǔ)飼糧中添加2%的黃芪副產(chǎn)物不僅可以增加綿羊的脾臟指數(shù)，還可以上調(diào)脾臟中TLR2和IRAK4基因的表達(dá)，從而在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。