馬廣明 劉 驥 姜 鑫 張永根

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030)

奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)是奶牛乳腺組織中唯一具有高分化能力的細(xì)胞，起著合成與分泌乳脂和乳蛋白的作用[1]，其活力是決定奶牛健康狀況和產(chǎn)奶能力的關(guān)鍵[2]。奶牛在泌乳高峰期乳腺代謝旺盛，容易產(chǎn)生過多的活性氧(ROS)，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重?fù)p害，破壞生物膜系統(tǒng)及其功能，使得BMECs大量凋亡，最終影響奶牛正常泌乳[3]。此外，乳腺細(xì)胞中氧化自由基的過量產(chǎn)生會破壞乳腺抗氧化機(jī)能的動態(tài)平衡，從而提高了奶牛乳房炎的發(fā)病率[4]。乳房炎的發(fā)生不僅會降低牛奶的營養(yǎng)成分，還會影響牛奶的質(zhì)量和風(fēng)味[5]。目前緩解和治療奶牛氧化應(yīng)激的方法普遍采用人工合成的抗生素療法[6]，然而持續(xù)大量的使用抗生素，會導(dǎo)致一些藥物殘留于奶牛乳房中，從而危害人類健康[7]。因此，尋找一種新型安全高效的抗生素替代物，以緩解奶牛氧化應(yīng)激，對于提高奶牛泌乳性能具有重要意義。

近年來，植物提取物因具有高效、安全、無藥物殘留等特點，已被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑中以減少抗生素的使用[8]。辣木是一種多年生熱帶落葉喬木，廣泛分布于我國南方，是一種新興的飼料資源[9]，辣木營養(yǎng)成分及活性物質(zhì)豐富，具有廣泛的生理活性及醫(yī)學(xué)用途[10]。已有研究指出，辣木葉乙醇提取物具有清除氧化自由基的能力，并且能夠提高小鼠肝臟谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性[11]。辣木葉水提取物具有提高小鼠機(jī)體抗氧化能力的作用[12]。此外，張幸怡等[13]研究發(fā)現(xiàn)，以辣木梗葉替代苜蓿飼喂奶牛，可以提高奶牛血漿抗氧化能力。以上研究表明，辣木提取物中含有某種抗氧化物質(zhì)。植物多糖是由相同或不同的單糖以α-或β-糖苷鍵所組成的聚合糖，又稱植物多聚糖，是植物內(nèi)重要的活性成分[10]。國內(nèi)外研究指出，各種植物多糖均具有一定的抗氧化功能[14]。楊玲等[15]研究表明，植物多糖作為飼料添加劑，具有提高機(jī)體抗氧化能力的作用；楊明峰[16]研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖具有清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和抗油脂氧化的能力。Amagase等[17]通過小鼠飼喂試驗發(fā)現(xiàn)植物多糖能夠提高小鼠肝臟細(xì)胞的GSH-Px與超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低丙二醛(MDA)含量。因此，我們推測辣木葉多糖(MLP)可能是辣木葉提取物中發(fā)揮抗氧化功能的主要活性物質(zhì)。

目前已有研究指出，MLP對自由基具有很強(qiáng)的清除能力[18]。然而，MLP是否具有緩解BMECs氧化損傷的潛力尚不清楚。因此，本試驗以過氧化氫(H2O2)為氧化劑建立BMECs氧化損傷模型，研究MLP對BMECs氧化應(yīng)激和凋亡的保護(hù)作用，為MLP作為奶牛功能性添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用BMECs由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)反芻動物實驗室提供。F12培養(yǎng)基(DMEM/F12)購買于Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購買于Wisent公司；胰酶消化液、磷酸鹽緩沖液(PBS)固體和ROS檢測試劑盒均購買于Solarbio公司；青霉素和鏈霉素與二甲基亞砜(DMSO)均購買于Sigma Aldrich公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶購買于康寧公司;Hoechst-33258試劑盒購買于Beyotime生物技術(shù)研究所;CCK-8活力檢測試劑盒購買于Dojindo分子技術(shù)公司；MDA含量及GSH-Px、SOD、過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒購買于南京建成生物工程研究所。MLP凍干粉(多糖純度為60%)由西安全澳生物科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 建立氧化損傷模型

在96孔板內(nèi)培養(yǎng)BMECs，將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期(約為105個/mL)，待細(xì)胞貼壁后，在培養(yǎng)基中分別加入100 μL濃度為20、60、100、200、500 μmol/L的H2O2,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2 h，每種濃度4個重復(fù)。使用CCK-8活力檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞存活率，以確定H2O2適宜濃度。

1.2.2 MLP適宜濃度篩選

按照不同濃度(1、2、3、4、5、6 mg/mL)將MLP溶于蒸餾水中，隨后用0.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾。在96孔板內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期(約為105個/mL),待細(xì)胞貼壁后加入100 μL濃度為1、2、3、4、5、6 mg/mL的MLP溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，每種濃度4個重復(fù)。使用CCK-8活力檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞存活率，以確定MLP適宜濃度。

1.2.3 試驗設(shè)計

將培養(yǎng)好的細(xì)胞隨機(jī)分為4組，分別為對照組1(未經(jīng)處理、正常培養(yǎng)的細(xì)胞)、對照組2(用200 μL濃度為1 mg/mL的MLP溶液處理BMECs 2 h)、損傷組(用200 μL濃度為500 μmol/L的H2O2處理BMECs 2 h)、保護(hù)組(用200 μL濃度為1 mg/mL的MLP溶液處理BMECs 2 h后，再使用500 μmol/L H2O2處理BMECs 2 h)，每組3個重復(fù)。

1.2.4 Hochest33258法檢測細(xì)胞凋亡數(shù)

將BMECs接種于6孔板中，在37 ℃，含有5%二氧化碳(CO2)和95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后用PBS溶液進(jìn)行清洗并添加1.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液(目的是洗掉接種過程中凋亡的細(xì)胞，避免對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響)。在6孔板內(nèi)將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期(約為105個/mL)后，根據(jù)1.2.3的分組進(jìn)行下一步試驗處理。按照試劑盒說明書，于6孔板內(nèi)加入200 μL Hoechst33258，室溫和黑暗的條件下靜置20 min，用PBS清洗3遍，使用熒光顯微鏡檢測熒光強(qiáng)度，并對細(xì)胞核形態(tài)進(jìn)行評價。

1.2.5 細(xì)胞中ROS數(shù)量的檢測

按照1.2.4的步驟將BMECs進(jìn)行培養(yǎng)和處理。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，將二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)探針加入4組，在37 ℃黑暗中孵育20 min。用熒光顯微鏡觀察二氯二氫熒光素(DCF)熒光。

1.2.6 細(xì)胞氧化應(yīng)激的透射電鏡觀察

按照1.2.4的步驟將BMECs進(jìn)行培養(yǎng)和處理。用1.5 mL胰酶消化液消化BMECs，2.5%戊二醛固定2 h。用0.1 mol/L PBS(pH 7.2)沖洗混合物2次，每次15 min。然后將混合物在1%檸檬酸中固定10 min，用0.1 mol/L PBS沖洗，用50%～100%乙醇溶液將樣品脫水后，再用丙酮和包埋液浸泡樣品1 h。包埋、聚合、修復(fù)后，用透射電鏡觀察。

1.2.7 BMECs氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

按照1.2.4的步驟對BMECs進(jìn)行培養(yǎng)和處理。使用細(xì)胞刮刀將處理后的細(xì)胞從6孔板壁上刮下，并使用2.5 mL EP管收集孔內(nèi)溶液，最后按照試劑盒的指示操作，測定BMECs中CAT、GSH-Px、SOD的活性和MDA含量。用酶標(biāo)儀(spectraMax M5)測定各組的吸附率。

1.3 統(tǒng)計分析

首先通過Excel 2018軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，隨后采用SAS 9.4軟件包中的單因素方差分析對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用Turkey作顯著性檢驗，其中P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2對BMECs存活率的影響

H2O2誘導(dǎo)BMECs的存活率檢測結(jié)果見圖1。H2O2降低了BMECs的存活率，當(dāng)H2O2濃度超過20 μmol/L后，隨著H2O2濃度的增加，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。其中，用500 μmol/L H2O2培養(yǎng)時細(xì)胞存活率為59.13%，因此，選擇H2O2的適宜濃度為500 μmol/L。

2.2 MLP對BMECs存活率的影響

如圖2所示，在前4種濃度下，細(xì)胞存活率無明顯下降趨勢，當(dāng)MLP濃度達(dá)到5 mg/mL時，細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.05)，此時MLP濃度為細(xì)胞致死濃度，因此，選擇MLP的適宜濃度為4 mg/mL。

2.3 BMECs內(nèi)ROS數(shù)量的檢測

BMECs內(nèi)ROS的檢測結(jié)果見圖3。根據(jù)ImageJ軟件計算結(jié)果顯示，對照組1和對照組2測到的熒光亮點分別為5和3個，損傷組為47個，保護(hù)組熒光亮點多于對照組而低于損傷組。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2、圖6同。

圖2 MLP對BMECs存活率的影響

2.4 BMECs凋亡檢測

由圖4可知，對照組1和對照組2的藍(lán)色熒光點呈現(xiàn)規(guī)則的圓形或橢圓形，表現(xiàn)為低強(qiáng)度熒光，為輕度凋亡現(xiàn)象(圖4-a、圖4-b中出現(xiàn)極少數(shù)破碎細(xì)胞可能是因為接種或染色過程中細(xì)胞出現(xiàn)死亡);而損傷組呈現(xiàn)較亮的熒光，并且由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致光點形狀發(fā)散且不規(guī)則；保護(hù)組圓形熒光亮點的數(shù)量與熒光強(qiáng)度弱于損傷組，但強(qiáng)于對照組1和對照組2，且圖片中存在規(guī)則的圓形或橢圓形亮點和不規(guī)則形態(tài)的亮點。

2.5 不同處理下BMECs形態(tài)觀察

如圖5所示，對照組1和對照組2的細(xì)胞膜完整，核仁形態(tài)正常；而損傷組中細(xì)胞膜破裂、凋亡小體釋放(箭頭標(biāo)注處為凋亡小體)、染色質(zhì)濃縮并且核仁形態(tài)發(fā)生變化，標(biāo)志著細(xì)胞發(fā)生凋亡；保護(hù)組中細(xì)胞核皺縮但未破裂，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為中度凋亡的跡象。

a:對照組1；b:對照組2；c:損傷組；d:保護(hù)組。圖4、圖5同。

圖4 BMECs Hoechst33258觀察

2.6 BMECs中CAT、GSH-Px和SOD活性及MDA含量測定

如圖6所示，對照組1和對照組2細(xì)胞中CAT、GSH-Px和SOD活性均較損傷組顯著升高(P<0.05)，而MDA含量顯著降低(P<0.05)。保護(hù)組細(xì)胞中CAT、GSH-Px和SOD活性均顯著低于對照組1和對照組2(P<0.05)，但顯著高于損傷組(P<0.05)。相反，保護(hù)組細(xì)胞中MDA含量顯著高于對照組1和對照組2(P<0.05)，但顯著低于損傷組(P<0.05)。

圖5 投射電鏡下BMECs的觀察

3 討 論

3.1 H2O2和MLP適宜濃度的篩選

為進(jìn)一步揭示MLP對BMECs的保護(hù)作用，本試驗建立了氧化應(yīng)激模型。細(xì)胞內(nèi)ROS的過量產(chǎn)生是發(fā)生氧化應(yīng)激的重要因素，其主要物質(zhì)為一氧化氮(NO)、H2O2和羥基自由基等[19]，由于H2O2性質(zhì)相對穩(wěn)定、操作簡便且容易獲得，因此選用H2O2作為氧化劑建立氧化應(yīng)激模型[20]。氧化應(yīng)激模型普遍選用的細(xì)胞存活率在50%～70%，一方面可以避免細(xì)胞氧化應(yīng)激不明顯，而影響試驗的準(zhǔn)確性，另一方面可防止由于細(xì)胞存活率過低而發(fā)生不可逆損傷[21]，使細(xì)胞大量死亡，這可能會導(dǎo)致MLP的保護(hù)作用失效。本試驗中，當(dāng)H2O2濃度為500 μmol/L、誘導(dǎo)時間為2 h時，細(xì)胞存活率為59.13%，滿足氧化應(yīng)激模型的建立條件。MLP雖然營養(yǎng)價值和藥用價值極高，但其使用濃度尚未完全了解。有研究指出，當(dāng)植物多糖超過一定濃度后，會對細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制作用[22],例如，當(dāng)黃芪多糖濃度為2.5 mg/mL時，對人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡無明顯影響，但當(dāng)濃度達(dá)到5 mg/mL時，會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[23]。因此我們需要對MLP的作用濃度進(jìn)行篩選，確定MLP的適宜濃度，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 mg/mL的MLP溶液為適宜濃度，對BMECs無不良影響。

圖6 BMECs中CAT、GSH-Px、SOD活性和MDA含量的測定

3.2 MLP對BMECs凋亡的影響

BMECs發(fā)生氧化損傷后，其生物膜系統(tǒng)遭到破壞，細(xì)胞中的核酸、DNA等生物大分子受到攻擊，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[24]，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中線粒體模糊、細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)明顯濃縮[25]、細(xì)胞破裂并出現(xiàn)凋亡小體[26]。Hochest33258是一種藍(lán)色熒光染料，能穿透細(xì)胞膜，在熒光顯微鏡下使活細(xì)胞呈現(xiàn)出深藍(lán)色、規(guī)則的圓形或橢圓形[27]，而在凋亡過程中，細(xì)胞核變得凝集并呈現(xiàn)出明亮且不規(guī)則的藍(lán)色形狀[28]。在透射電鏡下，發(fā)生凋亡的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變甚至破裂，并且出現(xiàn)凋亡小體[26]。本試驗Hochest33258細(xì)胞凋亡檢測和透射電鏡結(jié)果顯示，保護(hù)組的熒光亮點明顯多于損傷組并少于對照組1和對照組2，在透射電鏡下?lián)p傷組細(xì)胞破裂，形成大小不等的凋亡小體，而保護(hù)組細(xì)胞形態(tài)雖然發(fā)生改變，細(xì)胞體積縮小、核膜不清、核染色質(zhì)分布密集，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡狀物質(zhì)，但并未出現(xiàn)破裂的現(xiàn)象，其原因可能是MLP通過減少ROS的生成減緩細(xì)胞凋亡[29]。本研究結(jié)果說明MLP具有減緩細(xì)胞凋亡的作用。

3.3 MLP對BMECs抗氧化能力的影響

在奶牛泌乳期，由于泌乳的需要，奶牛乳腺組織需要大量的能量維持其生理活動，導(dǎo)致其細(xì)胞代謝迅速，進(jìn)而加大ROS的產(chǎn)生。ROS是評價機(jī)體氧化損傷程度和自由基攻擊程度的重要指標(biāo)[30]，當(dāng)其產(chǎn)生速度大于抗氧化劑的清除速度時，過量的ROS會攻擊核酸主鏈、破壞氫鍵并阻止生物蛋白質(zhì)聚合，引發(fā)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致其代謝功能紊亂、衰老甚至凋亡[31]，最終危害奶牛健康和泌乳能力[32]，同時，過量的ROS產(chǎn)生會導(dǎo)致不飽和脂肪酸積累，最終生成MDA[33]，MDA的含量間接體現(xiàn)了機(jī)體的氧化損傷程度[22]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)ROS大量產(chǎn)生時，抗氧化酶便會起到防御作用，消除過多的ROS，以維持機(jī)體正常生理功能[34]。因此，CAT、GSH-Px和SOD的活性反映了機(jī)體清除ROS能力[34]。

植物多糖是植物中重要的活性成分，可有效清除羥基自由基[35]，并減緩或抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的ROS有很強(qiáng)的清除能力，能夠增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[33]。此外，有研究表明，許多植物多糖具有提高機(jī)體CAT、GSH-Px和SOD活性的能力，同時能夠減少MDA的生成[36]。例如，黃芪多糖可有效提高羅曼雛雞血清中CAT、GSH-Px和SOD活性，并且降低了MDA含量[37]。在BMECs內(nèi)ROS的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加MLP可降低H2O2處理的BMECs中ROS的數(shù)量；在試劑盒檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，損傷組細(xì)胞CAT、GSH-Px和SOD活性顯著低于保護(hù)組，而MDA含量顯著高于保護(hù)組。其原因可能是MLP通過羥基與二價鐵離子(Fe2+)等金屬離子發(fā)生絡(luò)合并清除脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈中產(chǎn)生的ROS，從而中斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的進(jìn)行，提高抗氧化酶活性且減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生[38]。

以上研究結(jié)果表明MLP具有減緩或抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的功能，并對細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

MLP緩解了氧化應(yīng)激對BMECs造成的損傷，增強(qiáng)了細(xì)胞的抗氧化能力，因此，MLP具有作為飼料添加劑應(yīng)用于奶牛生產(chǎn)的潛力。