王洪萍，劉嬌，尚憲平，劉文鳳

宮頸癌是僅次于乳腺癌和直腸癌的全球第三大惡性腫瘤，每年有569 000例新發(fā)病例[1-2]。2018年發(fā)生13 000例新發(fā)病例和4 100例宮頸癌死亡[3]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染與大多數(shù)宮頸癌病例相關(guān)，其中HPV 16和18被確定為最致癌的亞型，分別占病例的50%和10%以上[4]。單磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)最初被鑒定為一種負(fù)性調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成代謝的幾種關(guān)鍵酶的絲氨酸/蘇氨酸激酶。 同時，AMPK被認(rèn)為是主要的能量感應(yīng)激酶，可以激活多種細(xì)胞生物中的各種分解代謝過程，例如葡萄糖攝取和代謝，同時抑制多種合成代謝途徑，例如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物的生物合成[5]。AMPK通過調(diào)節(jié)雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)活性在控制細(xì)胞生長、增殖和自噬中起著核心作用，而mTOR活性在癌細(xì)胞中一直處于失調(diào)狀態(tài)[6]。 mTOR是營養(yǎng)和生長因子輸入的中心調(diào)控者，可控制所有真核生物的細(xì)胞生長，其活性在大多數(shù)人類癌癥中受到異常調(diào)控[7]。目前鮮有關(guān)于AMPK/mTOR信號通路與GJB2的關(guān)聯(lián)研究，由研究提出AMPK是縫隙連接蛋白2(Gap Junction Protein Beta 2， GJB2)的有效調(diào)節(jié)劑[8]。GJB2是編碼間隙連接蛋白家族的成員，目前報道GJB2的突變主要與耳部疾病相關(guān)，GJB2突變是兒童遺傳性耳聾的最常見原因[9]。突變可以阻止有機(jī)溶質(zhì)的交換，但允許離子的自由交換[10]。皮質(zhì)醇支持細(xì)胞中的GJB2顯然對于谷氨酸的跨細(xì)胞運(yùn)動特別重要。在缺乏GJB2的小鼠中，內(nèi)毛細(xì)胞附近的谷氨酸緩沖支持細(xì)胞發(fā)生凋亡，這很可能是由于它們無法通過間隙連接將谷氨酸分布到表達(dá)谷氨酰胺合酶的相鄰支持細(xì)胞而引起的[11]。目前關(guān)于GJB2在宮頸癌的研究未有報道，且發(fā)現(xiàn)GJB2在宮頸癌中的表達(dá)相比正常組織顯著高表達(dá)，并具有高表達(dá)預(yù)后差特征，暗示GJB2可能在宮頸癌中的致癌因子特性，因此本篇文章主要研究了GJB2在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的功能與分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌細(xì)胞siHa和Hela細(xì)胞購于美國ATCC細(xì)胞庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并加入100 μg/mL鏈霉素和100 IU/mL 青霉素。細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于含 5%的 CO2和 95%濕度的 37°C 培養(yǎng)箱中。

1.2 臨床數(shù)據(jù)篩選

在臨床數(shù)據(jù)庫 (Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA)中[12]，通過tumor/normal>2找到在宮頸癌中高表達(dá)的蛋白，并通過GEPIA找到與宮頸癌臨床預(yù)后密切相關(guān)的蛋白，將兩部分蛋白進(jìn)行重合性分析，從而篩選到目的蛋白。收集2018年7月至2019年7月濟(jì)南市人民醫(yī)院婦科行宮頸癌手術(shù)的30例宮頸癌患者腫瘤組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本，患者年齡40～62歲，平均年齡(55.2±5.6)歲，病理類型：鱗癌24例、腺癌6例；FIGO分期：Ⅰ～Ⅱ期17例，Ⅲ期13例；采用RT-qPCR法檢測組織中GJB2 mRNA表達(dá)情況。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)(qPCR) 使用primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)設(shè)計特異性GJB2 qPCR引物，序列：GJB2-F/CTGCAGCTGATCTTCGTGTC，GJB2-R/ATGACCCGGAAGAAGATGCT，并在生工生物工程(上海)股份有限公司合成；cDNA用滅菌純水稀釋適當(dāng)?shù)臐舛?，一般稀?0倍，按照qPCR mix 5μL、primer 1μL 、cDNA 4μL的配方加入到96孔PCR板中；貼膜，以2 500 rpm離心1 min，將樣品放入qPCR儀器中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 qPCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)程序：熱啟動：95℃，10 mim；擴(kuò)增(兩步法)：95℃, 10 s (解鏈); 60℃, 20 s (退火)；溶解曲線溫度：95℃, 30 s；65℃, 30 s；95℃,30 s；反應(yīng)完成后，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.2 siRNA轉(zhuǎn)染總RNA提取及RT-qPCR 以6孔板轉(zhuǎn)染siRNA為例：第1天鋪6孔板1/4的細(xì)胞于孔中，待第2天長到50%即可轉(zhuǎn)染第1輪，將1 μL siRNA與250 μL Opti-MEM混勻，1 μL lipo 2000與250 μL Opti-MEM混勻，室溫放置5 min，然后將兩部分合并，混勻，靜置15 min，之后逐滴、均勻加入6孔板中的1個孔中，轉(zhuǎn)染第1輪24 h之后按照上述操作轉(zhuǎn)染第2輪，轉(zhuǎn)染第2輪24 h之后收細(xì)胞提RNA。對于總RNA的提取，我們采用RNAiso Plus(TaKaRa，Cat.#9108)試劑，提取的流程如下：以6孔板為例，細(xì)胞用PBS洗滌1次，加入350 uL的RNAiso Plus，室溫裂解5 min后，添加RNAiso Plus量 0.2倍體積的氯仿，劇烈渦旋15 s，繼續(xù)在室溫保持5 min，離心(12 000 g，4℃，15 min)，轉(zhuǎn)移上清(水相層的70%～80%)至新的EP管中，然后向上清中添加RNAiso Plus量 1倍體積的異丙醇，顛倒混勻8～10次，室溫保持10 min，離心(12 000 g，4℃，10 min)，去除上清，白色沉淀即為粗RNA沉淀物，然后向沉淀物中加75%乙醇洗滌RNA沉淀物，并離心(7 500g，4℃，5 min)，去除上清(盡可能去除干凈)，室溫干燥5～15 min，最后加50 uL無核酸酶水溶解，即可獲得總RNA。隨后使用GoScript 反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，按照廠商的使用說明，將總RNA中反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并通過AriaMx實(shí)時定量PCR儀(Agilent Technologies)進(jìn)行定量PCR(qPCR)，每個樣本進(jìn)行3個生物學(xué)重復(fù)，最后分析數(shù)據(jù)。

1.3.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 消化長滿的10 cm盤細(xì)胞，重懸于1 mL新鮮培養(yǎng)基中，用20 μL可鋪1個96孔板的密度鋪細(xì)胞，每個實(shí)驗(yàn)組需3個生物重復(fù)，鋪好所需的實(shí)驗(yàn)孔數(shù)。在5% CO2、37℃條件下孵育。細(xì)胞貼壁后即可轉(zhuǎn)染siRNA，48 h后開始測量吸光度。配制MTS反應(yīng)液，按照MTS：培養(yǎng)液=1∶20的比例配制反應(yīng)液。每孔加入100 μL MTS反應(yīng)溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。每隔半小時檢測1次吸光度。將培養(yǎng)皿置搖床上低速振蕩10 s以充分溶解結(jié)晶物。在490 nm處測量各孔的吸光值。將每天的吸光值轉(zhuǎn)換成代表每日細(xì)胞生長的參數(shù)，并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.3.4 劃痕遷移實(shí)驗(yàn) 10 cm盤的1/4鋪整個6孔板，待細(xì)胞貼壁后分別轉(zhuǎn)染siRNA，36 h后待細(xì)胞長到90%用槍頭在盤中央劃痕，并用PBS洗1遍，拍攝0 h圖片作為對照，之后24 h進(jìn)行拍攝觀察。

1.3.5 基因功能分析 在臨床數(shù)據(jù)庫cBioPortal[13-14]中找到與GJB2共表達(dá)的基因，將這些基因在metascape中進(jìn)行信號通路分析，從而為解析目的蛋白在癌癥進(jìn)程中發(fā)揮的功能提供參考。

1.3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn) 收細(xì)胞進(jìn)行蛋白定量并制樣，每組蛋白總樣品加20 ug，準(zhǔn)備電泳、電轉(zhuǎn)裝置，電泳液及電轉(zhuǎn)液，裝樣品加入在凝膠中，100 V進(jìn)行電泳，待藍(lán)色條帶跑出即進(jìn)行電轉(zhuǎn)，100 V冰浴電轉(zhuǎn)2 h，將蛋白膜放在用TBST配置的5%牛奶中室溫封閉1 h，4℃孵育一抗過夜，洗膜4次，每次5 min，室溫孵育二抗1 h，洗膜4次，每次5 min，暗房顯影。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 篩選宮頸癌中高表達(dá)且具有顯著臨床預(yù)后相關(guān)性的基因

為了找到對宮頸癌發(fā)生發(fā)展中具有顯著作用的基因，通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分別找到在宮頸癌中高表達(dá)(tumor/normal>2)的基因1 851個和在宮頸癌中具有顯著臨床預(yù)后的基因500個(pValue<0.05)，進(jìn)行基因重合性分析，發(fā)現(xiàn)78個在宮頸癌中高表達(dá)且具有顯著臨床預(yù)后相關(guān)性的基因(如下頁圖1a)，再將重合基因進(jìn)行熱圖分析，找到表達(dá)差異排名前4的基因(如下頁圖1b),分別是序列相似性家族83名成員H(Family with Sequence Similarity 83 Member H,FAM83H)、GJB2、載脂蛋白B mRNA編輯酶催化亞基3 B(Apolipoprotein B MRNA Editing Enzyme Catalytic Subunit3B ,APOBEC3B)和著絲粒蛋白M(Centromere Protein M, CENPM)(如下頁圖1c)。

2.2 GJB2在宮頸癌中高表達(dá)且具有顯著臨床預(yù)后相關(guān)性

在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，分析FAM83H，GJB2，APOBEC3B和CENPM與宮頸癌的臨床預(yù)后相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)FAM83H和GJB2在宮頸癌中均呈現(xiàn)顯著高表達(dá)而預(yù)后差的特征(P=0.0047、0.0056)；而APOBEC3B和CENPM則是低表達(dá)預(yù)后差(P=0.0005、0.0011，如圖2a，見彩插2)。通過RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測30組宮頸癌及鄰近正常組織中GJB2的表達(dá)水平情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GJB2的確在宮頸癌組織中較鄰近正常組織顯著性高表達(dá)(P<0.001，如下頁圖2b)。一般將在癌癥中高表達(dá)且預(yù)后差的基因認(rèn)為是致癌基因，因此主要關(guān)注FAM83H和GJB2；而FAM83H在宮頸癌中的重要作用已被證實(shí)，本文主要研究GJB2在宮頸癌中的重要作用。

2.3 GJB2促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞生長增殖和遷移

RT-qPCR結(jié)果顯示，在敲低GJB2表達(dá)的兩種宮頸癌細(xì)胞中(Hela和siHa)(如83頁圖3a)，相比對照細(xì)胞，敲低GJB2表達(dá)的細(xì)胞增殖速率顯著減慢，自第3天后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，如83頁圖3b)，同時相比對照細(xì)胞，細(xì)胞遷移速率也顯著減慢(P<0.01，如83頁圖3c)。

2.4 GJB2主要參與AMPK/mTOR信號通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞生長增殖和遷移

為探究GJB2促進(jìn)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，將與GJB2共表達(dá)的基因(pValue>0.4)進(jìn)行了metascape分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GJB2主要參與AMPK信號通路(如84頁圖4a)；隨后在敲低GJB2的細(xì)胞中對此信號通路中的重要基因進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)敲低GJB2的表達(dá)，AMPK本底不變的情況下，AMPK的磷酸化顯著升高(P<0.01，如84頁圖4b～4c)，同時也發(fā)現(xiàn)在mTOR本底不變的情況下，mTOR的磷酸化顯著減弱(P<0.05，如84頁圖4b～4c)；而在宮頸癌中GJB2的高表達(dá)則會減弱AMPK磷酸化的抑癌表達(dá)，同時升高mTOR的磷酸化促癌表達(dá)。說明GJB2參與AMPK/mTOR信號通路，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞生長增殖和遷移。

3 討論

GJB2編碼連接蛋白26蛋白(Connexin 26，Cx 26)，它是一種間隙連接蛋白，通過鉀離子再循環(huán)參與耳蝸液、內(nèi)淋巴和周圍淋巴的內(nèi)耳穩(wěn)態(tài)[16]。該基因具有簡單的基因組結(jié)構(gòu)，由680 bp組成，測序也較簡單[16]。迄今為止，已經(jīng)鑒定出GJB2基因中的100多個致病突變，GJB2突變的發(fā)生率因人群而異[17]。在高加索人中，c.35 delG是最常見的突變，頻率高達(dá)2%～4%[18]。但是，c.235 delC和p.Trp 24*分別是日本人[19]和印度人[20]中最常見的突變。目前研究報道最多的也是GJB2的突變在疾病中的作用。

a.宮頸癌中高表達(dá)的基因與具有顯著臨床預(yù)后相關(guān)性的基因重合性分析結(jié)果；b.熱圖顯示宮頸癌中高表達(dá)基因按表達(dá)差異從大到小排序結(jié)果；c.表達(dá)差異前4基因在宮頸癌中的表達(dá)情況。

b.30組宮頸癌及鄰近正常組織中GJB2的表達(dá)情況。

在本文中，我們主要研究了GJB2在宮頸癌中的功能和分子機(jī)制。首先，通過GEPIA數(shù)據(jù)庫找到在宮頸癌中相比鄰近正常組織高表達(dá)的基因，同時找到在宮頸癌中具有顯著臨床預(yù)后相關(guān)性的基因，將這兩部分的基因進(jìn)行重合性分析，找到既在宮頸癌中高表達(dá)又具有顯著臨床預(yù)后相關(guān)性的基因，將重合基因在宮頸癌中的表達(dá)量差異再次進(jìn)行排序，找到表達(dá)量差異前4的基因，分別為FAM83H，GJB2，APOBEC3B和CENPM，因?yàn)镕AM83H和GJB2與臨床預(yù)后相關(guān)性是高表達(dá)預(yù)后差，而APOBEC3B和CENPM與臨床預(yù)后相關(guān)性是低表達(dá)預(yù)后差，因此我們主要研究FAM83H和GJB2，但FAM83H已經(jīng)研究頗多，因此最后我們篩選到GJB2進(jìn)行研究。接著我們在30組宮頸癌臨床樣品中進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)GJB2在宮頸癌中相比臨近正常組織更高表達(dá)，由此暗示了GJB2在宮頸癌中的重要性，為了進(jìn)一步探究GJB2在宮頸癌中的關(guān)鍵作用，我們在敲低GJB2的兩個宮頸癌細(xì)胞中進(jìn)行了細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲低GJB2確實(shí)顯著減慢宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移速率，由此證明了GJB2在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的重要性，為了進(jìn)一步探究GJB2在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，我們將與GJB2表達(dá)相關(guān)系數(shù)大于0.4的基因進(jìn)行了metascape分析，發(fā)現(xiàn)在京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路中GJB2主要參與AMPK信號通路，接著我們用敲低GJB2的兩個宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)敲低GJB2的表達(dá)，AMPK的磷酸化顯著升高，而mTOR的磷酸化顯著降低，這說明GJB2是AMPK/mTOR信號通路的一個激活劑。綜上所述，GJB2在宮頸癌中高表達(dá)，GJB2的高表達(dá)激活了AMPK/mTOR信號通路軸，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性增殖及遷移，引發(fā)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，因此GJB2可能是一個新的潛在的治療宮頸癌的藥物靶標(biāo)。

a.兩種宮頸癌細(xì)胞中，qPCR實(shí)驗(yàn)顯示GJB2的表達(dá)敲低情況；b.兩種宮頸癌細(xì)胞中，MTS法顯示敲低GJB2對宮頸癌細(xì)胞生長增殖影響情況；c. 兩種宮頸癌細(xì)胞中，劃痕遷移實(shí)驗(yàn)顯示敲低GJB2對宮頸癌細(xì)胞遷移速率影響情況。

a.通過metascape分析顯示GJB2共表達(dá)基因參與的信號通路；b、c在宮頸癌細(xì)胞中敲低GJB2表達(dá)對AMPK和mTOR磷酸化的影響

本文篩選宮頸癌中高表達(dá)且具有顯著臨床預(yù)后相關(guān)性的基因，從功能驗(yàn)證及分子機(jī)制等方面對促進(jìn)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程進(jìn)行了研究，但這其中的研究還不是很全面，功能驗(yàn)證除了細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)，還可利用細(xì)胞周期，克隆形成等表型實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，分子機(jī)制也只是初步的探討，需要更多的全轉(zhuǎn)錄組結(jié)合高通量測序?qū)嶒?yàn)以及后續(xù)的RT-qPCR，相互作用蛋白及質(zhì)譜的進(jìn)一步驗(yàn)證。