都宏霞，劉宴秀,2，嚴(yán)忠杰，胡梓恒，劉高榮，吳晨雨

（1.南京科技職業(yè)學(xué)院化工與材料學(xué)院，江蘇南京 210048)（2.鹽城工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，江蘇鹽城 224051）

綠色化學(xué)一直是化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents，DESs）是繼離子液體（Ionic liquids，ILs）之后由Abbott等人2003年首次合成的一類(lèi)綠色新型溶劑[1]，一般是選取2～3種綠色無(wú)毒的原料作為氫鍵受體和氫鍵供體，通過(guò)較強(qiáng)的分子間氫鍵作用而制得的低共熔混合物。低共熔溶劑既擁有與離子液體同樣優(yōu)秀的理化性質(zhì)，又更好地克服了離子液體合成復(fù)雜、耗能高、成本高等缺點(diǎn)，且具有成本低、易制備、易存放、可回收、安全無(wú)毒、生物可降解、環(huán)境友好等其他有機(jī)溶劑無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，已逐漸受到廣泛關(guān)注[2,3]。目前DESs已經(jīng)逐步代替有機(jī)溶劑和離子液體應(yīng)用于天然植物提取和分離方面，具有巨大潛力[4-6]。

茉莉花，屬木犀科素馨屬,花瓣如雪，花香清雅，《本草綱目》中早有記載，在我國(guó)廣泛種植，是一種藥食同源的植物，具有很高的觀賞性和實(shí)用性，深受人們喜愛(ài)。研究表明,茉莉花中含有多糖、黃酮、揮發(fā)油等多種活性成分，具有清虛火、祛寒積、治療瘡毒、祛除壞疽、腫瘤等活性功效，作為主要成分的茉莉花黃酮（flavonoids of Jasmine，F(xiàn)OJ）具有良好的抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力等作用[7-11]。目前，對(duì)于黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取溶劑主要是水或甲醇、乙醇、乙酸乙酯等傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑[12-15]，為了克服有機(jī)溶劑的污染，探索一種新型綠色、高效的茉莉花黃酮提取技術(shù)非常必要。

本文設(shè)計(jì)并制備8種DESs，首次用于茉莉花黃酮的提取，系統(tǒng)比較多種提取技術(shù)，并結(jié)合響應(yīng)面法研究FOJ的最佳提取工藝，旨在提供一個(gè)更加綠色、高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的FOJ新型提取方法，更好地促進(jìn)茉莉花資源的深度開(kāi)發(fā)，為綠色化學(xué)的發(fā)展和中國(guó)天然產(chǎn)物的研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茉莉花，北京同仁堂藥店；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品，北京恒元啟天化工技術(shù)研究所；氯化膽堿，Aladdin公司；乙醇、醋酸鉀、丙二醇、1,3-丁二醇、1,2-戊二醇、蔗糖、三氯化鋁、山梨醇、甜菜堿鹽酸鹽、無(wú)水甜菜堿均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E-02型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FS-250N型超聲波提取儀，上海生析超聲儀器有限公司；7600型紫外分光光度計(jì)，上海菁華科學(xué)儀器制造有限公司；TDL-50B型低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，通過(guò)測(cè)量其在紫外分光光度計(jì)的吸光度，建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定FOJ的含量。

準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用濃度為50%的乙醇定容至25.0 mL。準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（0.2 mg/mL）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只比色管中，分別用5.0 mL的50%乙醇，3.0 mL的0.1 M AlCl3溶液和5.0 mL的1 M醋酸鉀溶液，搖勻，同法制成空白對(duì)照：靜置反應(yīng)40 min，充分接觸混合，并在波長(zhǎng)415 nm處檢測(cè)其吸光度值。

1.3.2 DESs的制備

參考Abbott的方法[16]，設(shè)計(jì)了8組DESs（見(jiàn)表1），選擇氯化膽堿、無(wú)水甜菜堿和甜菜堿鹽酸鹽作為氫鍵受體，分別與不同的氫鍵供體按摩爾比 1:1，含水量50 mol，在80 ℃水浴條件下加熱攪拌，直至溶液澄清，冷卻至室溫，分別得到DES1-8備用。

1.3.3 FOJ提取量的測(cè)定

式中：Y為FOJ提取量，mg/g；c為試樣的測(cè)定質(zhì)量濃度，mg/mL；V為濾液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；m為原料質(zhì)量，g。

1.3.4 FOJ提取技術(shù)的比較

表2 提取技術(shù)條件表Table 2 Factors of extraction technology

精確稱(chēng)取茉莉花粉 20 g，通過(guò)水提（Water Extraction，WA）、醇提（Ethanol Extraction，ET）[17,18]、低共熔溶劑提?。―eep eutectic solvents Extraction，DESs）、微波提取[19,20]、(Microwave Extraction，MA)、超聲波提取（Ultrasonic Extraction，UA）[21,22]技術(shù)來(lái)提取 FOJ，提取條件見(jiàn)表 2，將提取液抽濾，以轉(zhuǎn)速4000 r/min的速度進(jìn)行離心10 min，將離心后溶液靜置，取上層清液，過(guò)0.45 μm濾膜，對(duì)D101大孔樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理后，上樣，待吸附平衡后，用去離子水、質(zhì)量濃度為30%、50%、70%、90%的乙醇溶液洗脫，每個(gè)濃度均洗脫3柱體積（BV），流速為1 BV/h，收集90%乙醇濃度的洗脫液，于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮后，再用50%的乙醇溶液進(jìn)行稀釋得到FOJ，根據(jù)上述方法測(cè)其吸光度，計(jì)算得出FOJ含量。

1.3.5 UA-DES-8提取FOJ的單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 摩爾比對(duì)FOJ提取量的影響

在液料比40:1，含水量50 mol，超聲時(shí)間15 min，超聲功率120 W的條件下，取甜菜堿鹽酸鹽與蔗糖的摩爾比為2:1、1:1、1:2、1:3、1:4作為變量，研究摩爾比對(duì)FOJ提取量的影響。

1.3.5.2 液料比對(duì)FOJ提取量的影響

在超聲時(shí)間15 min，超聲功率120 W，甜菜堿鹽酸鹽:蔗糖:水=1:1:50的條件下，分別取液料比40:1、60:1、80:1、100:1、120:1、140:1、160:1，研究液料比對(duì)FOJ提取量的影響。

1.3.5.3 超聲時(shí)間對(duì)FOJ提取量的影響

在超聲功率 120 W，甜菜堿鹽酸鹽:蔗糖:水=1:1:50，液料比140:1的條件下，分別取超聲時(shí)間5、10、20、30、40 min，比較超聲時(shí)間對(duì)FOJ提取量的影響。

1.3.5.4 超聲功率對(duì)FOJ提取量的影響

在超聲時(shí)間 20 min，甜菜堿鹽酸鹽:蔗糖:水=1:1:50，液料比140:1的條件下，分別取超聲功率7.5、30、60、90、120、150 W，比較超聲功率對(duì)FOJ提取量的影響。

1.3.5.5 含水量對(duì)FOJ提取量的影響

在液料比140:1，超聲時(shí)間20 min，超聲功率60 W的條件下，取甜菜堿鹽酸鹽、蔗糖與水的摩爾比為1:1:40、1:1:60、1:1:80、1:1:100、1:1:120作為變量，研究含水量對(duì)FOJ提取量的影響。

1.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化FOJ最優(yōu)提取工藝條件

使用Design-Expert.V 8.0.6軟件中Box-Behnken組合設(shè)計(jì)來(lái)確定實(shí)驗(yàn)最優(yōu)工藝[23-25]，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇液料比、超聲功率、含水量為3因素，每個(gè)因素選擇三個(gè)對(duì)FOJ影響較大的水平，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，并以提取量作為響應(yīng)值，各因素的三個(gè)水平分別采取-1、0、1作為編碼，如表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)分析因素水平表Table 3 Factors and levels of response surface methodology

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8和Design-Expert.V 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、圖表制作及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果分析

經(jīng)測(cè)定分析，得回歸方程為Y=32.87X+0.14，其系數(shù)R2=0.9998，在0～0.08 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖3中，樣品1～4、7～8與空白組中氨基酸態(tài)氮含量相近，表明在同等發(fā)酵方式發(fā)酵條件下，添加增香酵母不會(huì)對(duì)薏仁碎米醬油中氨基酸態(tài)氮的含量造成很大影響，而同時(shí)添加兩種增香酵母的樣品5、6中氨基酸態(tài)氮含量則明顯低于空白組，分析可能是總酸含量降低所致；由圖3所示，樣品7、8與樣品1～4相比，其氨基酸態(tài)氮含量相對(duì)較高，表明分別在不同發(fā)酵時(shí)期添加兩種增香酵母時(shí)氨基酸態(tài)氮含量較高，樣品7中氨基酸態(tài)氮含量高達(dá)0.872 g/100 mL，略高于樣品8，其含量與未添加增香酵母的樣品9相比增長(zhǎng)了2.41%，因此，為提高醬油風(fēng)味，樣品7是較好的添加方式。

2.2 FOJ提取技術(shù)比較分析

圖1 FOJ提取技術(shù)的比較Fig.1 Comparison of different technology for extraction of FOJ

通過(guò)WA、ET、UA、MA技術(shù)和8種DESs提取FOJ，數(shù)據(jù)表明：超聲波輔助提取效果優(yōu)于微波提?。籇ESs溶劑提取效果遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的水提和醇提，F(xiàn)OJ提取量比水提和醇提分別提高了 3.67～4.13 mg/g和3.26～3.72 mg/g。這是因?yàn)镈ESs中含有大量容易與黃酮形成氫鍵的羥基和氨基，可以增加黃酮在DESs中的溶解度，同時(shí)在超聲波輔助的作用下，可以更快速的溢出，促進(jìn)FOJ提取量增加。其中DES-8，即以甜菜堿鹽酸鹽和蔗糖所合成的DES效果最好，茉莉花黃酮提取量為6.38 mg/g，結(jié)果見(jiàn)圖1。因此，本研究以UA-DES-8為提取技術(shù)，進(jìn)一步研究FOJ提取的最佳工藝條件。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 DES-8摩爾比對(duì)FOJ提取量的影響

結(jié)果如圖2所示：甜菜堿鹽酸鹽和蔗糖的摩爾比從2:1到1:4，F(xiàn)OJ提取量呈先升后降的趨勢(shì)，主要原因是DES-8體系中甜菜堿鹽酸鹽的極性相對(duì)較低，而糖基的極性相對(duì)較高，當(dāng)摩爾比為1:1時(shí)，DES-8溶液的極性剛好達(dá)到最佳的效果。之后隨著蔗糖比例的增加，體系極性增加的同時(shí)粘度也隨之增加，F(xiàn)OJ在體系中，擴(kuò)散速度減小，導(dǎo)致提取量逐漸下降。所以當(dāng)甜菜堿鹽酸鹽和蔗糖的摩爾比為1:1時(shí)，F(xiàn)OJ提取量最高，為6.38 mg/g。

圖2 摩爾比對(duì)FOJ提取量的影響Fig.2 Effect of molar ration on extraction yield of FOJ

2.3.2 液料比對(duì)FOJ提取量的影響

圖3 液料比對(duì)FOJ提取量的影響Fig.3 Effect of liquid-material ratio on extraction yield of FOJ

結(jié)果如圖3所示：當(dāng)液料比低于140:1時(shí)，液料比和 FOJ提取量呈正相關(guān)，提取量最高達(dá)到 13.71 mg/g；當(dāng)液料比繼續(xù)增大時(shí)提取量下降，因?yàn)橐毫媳鹊脑黾涌梢允贵w系的溶解度升高，促進(jìn)茉莉花細(xì)胞破壁，使內(nèi)容物溢出率增加，但當(dāng)溶解度大到一定程度時(shí)，可能會(huì)發(fā)生飽和的現(xiàn)象，導(dǎo)致部分黃酮無(wú)法溶解，進(jìn)而影響提取效果。因此，最佳液料比為140:1。

2.3.3 超聲時(shí)間對(duì)FOJ提取量的影響

結(jié)果如圖4所示：在5～20 min時(shí)FOJ提取量呈上升趨勢(shì)，但在20～40 min時(shí)反而呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)闀r(shí)間越長(zhǎng)，超聲波產(chǎn)生的能量就越大，在溶液中所形成的空化效應(yīng)就越強(qiáng)，對(duì)茉莉花細(xì)胞壁的破壞程度就越強(qiáng)，提取量就越高。但是，隨著超聲波作用時(shí)間的延長(zhǎng)，提取量反而降低，主要是由于隨著提取時(shí)間的增加，溫度也逐漸增加，體系同時(shí)處于超聲輻射和熱效應(yīng)的作用之下，可能會(huì)產(chǎn)生雙重降解[26,27]，因此20 min之后提取量降低。結(jié)果表明最佳超聲時(shí)間是20 min，比文獻(xiàn)報(bào)道[8]的最優(yōu)工藝的超聲時(shí)間少 25 min，此時(shí)提取量為14.23 mg/g。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)FOJ提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of FOJ

2.3.4 超聲功率對(duì)FOJ提取量的影響

圖5 超聲功率對(duì)FOJ提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction yield of FOJ

結(jié)果如圖5所示：FOJ的提取量先升后降，影響趨勢(shì)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[28]，在超聲功率為7.5～60 W之間一直增加，從60 W之后趨于平穩(wěn)后略有降低。因?yàn)殡S著超聲波功率的增加，空化效應(yīng)也更加劇烈，分子的運(yùn)動(dòng)速度和加速度都會(huì)增加，分子擴(kuò)散就越快，超聲波對(duì)細(xì)胞壁的破碎作用越強(qiáng)，黃酮物質(zhì)溢出率越多。但當(dāng)超聲功率大到一定程度時(shí)，會(huì)發(fā)生“飽和效應(yīng)”[26]，導(dǎo)致提取量降低。因此最佳超聲功率為60 W，此時(shí)FOJ提取量為14.34 mg/g。

結(jié)果如圖6所示，F(xiàn)OJ的提取量隨著含水量的增加先增后降，在含水量為80 mol時(shí)達(dá)到最大，為15.13 mg/g。主要原因是水可以降低提取溶劑的粘度，并且調(diào)節(jié)極性，從而在超聲波的輔助作用下，促進(jìn)溶劑的擴(kuò)散，有效的提升茉莉花細(xì)胞破壁的能力，增加FOJ的提取量。而含水量增加到80 mol之后，體系的粘度開(kāi)始降低，極性開(kāi)始增加，會(huì)導(dǎo)致分子間氫鍵的斷裂、超分子結(jié)構(gòu)的丟失，最終導(dǎo)致提取量的下降[29,30]。

圖6 含水量對(duì)FOJ提取量的影響Fig.6 Effect of water content on extraction yield of FOJ

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與優(yōu)化分析

2.4.1 響應(yīng)模型的建立與分析

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取液料比(A)、超聲功率(B)和含水量(C)三個(gè)主要因素為自變量，以FOJ提取量為響應(yīng)值(Y)，采用 Design-expert軟件按照Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了15組實(shí)驗(yàn)，12組為析因點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，3組為重復(fù)零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行交叉設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4，方差與誤差統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表5。

利用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=15.17+0.19A+0.85B+0.30C-0.15AB+1.06AC+0.44BC-0.91A2-0.40B2-0.83C2

其中Y為提取量，A、B和C分別為對(duì)應(yīng)液料比、超聲功率和含水量的編碼。由表 5的數(shù)據(jù)可知：模型的p值為0.0002，模型極顯著（p＜0.01）；失擬項(xiàng)p值為0.2859，結(jié)果不顯著（p＞0.05），表明擬合狀況良好。方程決定系數(shù)R2=0.9890，CV為1.41%＜10%，能真實(shí)的反映本模型，可用此模型分析響應(yīng)面的變化。信噪比（Adeq Precision）為20.22大于4，表示模型合理[31]。由方差F值可知，各因素對(duì)提取量影響為：B（超聲功率）＞C（含水量）＞A（液料比）。由表5還可知，因素中B、C、AC、BC、A2、C2的影響極顯著（p＜0.01），因素A、B2的影響顯著（p＜0.05），而AB的影響不顯著，該方程可適用。

表4 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of the response surface methodology(RSM) and box-behnken

表5 提取率響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果Table 5 ANOVA results of extraction rate response surface fitting regression equation

注：*：差異顯著,p ＜0.05；**:差異極顯著，p ＜0.01；R2= 0.9890，Adj R2= 0.9693，Pre R2=0.8551。

2.4.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

圖7 液料比和超聲功率交互作用對(duì)提取量的影響Fig.7 Response surface of Y=f (A, B)

圖8 含水量與液料比交互作用對(duì)提取量的影響Fig.8 Response surface of Y=f (A, C)

各因素間交互作用得到響應(yīng)面曲線圖。圖7～圖9分別顯示超聲功率、料液比、含水量的交互作用對(duì)FOJ提取量的影響結(jié)果。曲線走勢(shì)越陡，表明該因素影響越顯著；曲線走勢(shì)越平滑，則表明該因素影響較小[32]。圖7中，隨著超聲功率的增加，F(xiàn)OJ提取量逐漸上升，在90 W時(shí)達(dá)到最大，之后趨于平緩；圖8中，隨著液料比的增加，影響十分顯著，F(xiàn)OJ提取量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在液料比為149:1 (mL/g)時(shí)出現(xiàn)最大值；圖9中，隨著含水量的增加，F(xiàn)OJ提取量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，影響顯著，含水量在94 mol時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。這是因?yàn)槌暪β试酱螅栈?yīng)越劇烈，分子運(yùn)動(dòng)速度越快，黃酮物質(zhì)溢出越多，但當(dāng)超聲功率大于90 W時(shí)，發(fā)生“飽和效應(yīng)”，影響黃酮溢出。而適當(dāng)?shù)乃梢栽黾芋w系的黏度、調(diào)節(jié)體系極性，利于黃酮物質(zhì)溢出，但過(guò)量的水會(huì)使體系黏度變低、極性變高，導(dǎo)致氫鍵斷裂，使提取量降低。

圖9 含水量與超聲功率交互作用對(duì)提取量的影響Fig.9 Response surface of Y=f (B, C)

根據(jù)Design-Expert軟件得出在液料比、超聲功率和含水量交互作用影響下，最優(yōu)提取工藝為：液料比為148.91:1 (mL/g)，超聲功率為90 W，含水量為94.50 mol，在此條件下模型預(yù)測(cè)的提取率為15.90 mg/g。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體情況，修正提取條件為液料比 149:1(mL/g)，超聲波功率90 W，含水量94.50 mol，摩爾比1:1，超聲時(shí)間20 min，所得FOJ提取量為15.24 mg/g，與預(yù)測(cè)值相差0.66 mg/g，說(shuō)明模型與實(shí)際數(shù)據(jù)擬合較好，證實(shí)所得模型的有效性，同時(shí)證實(shí)響應(yīng)面對(duì)UA-DES-8提取FOJ的參數(shù)優(yōu)化具有較強(qiáng)的可行性和應(yīng)用性。

3 結(jié)論

本文建立了一種綠色、高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的茉莉花黃酮新型提取方法。通過(guò)比對(duì)水、乙醇和8種DESs在內(nèi)的10種溶劑，以及超聲波和微波提取對(duì)FOJ提取量的影響，證實(shí)DESs的效果都優(yōu)于水和乙醇，超聲波提取的效果優(yōu)于微波，且發(fā)現(xiàn)甜菜堿鹽酸鹽作為氫鍵受體的提取效果要優(yōu)于目前普遍使用的氯化膽堿。因此，選用甜菜堿鹽酸鹽和蔗糖所構(gòu)成的DES體系。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室條件，證實(shí)FOJ提取最佳條件是：甜菜堿鹽酸鹽：蔗糖:水=1:1:94.50，液料比149:1 (mL/g)，超聲波功率90 W，超聲時(shí)間20 min，在此條件下，F(xiàn)OJ的提取量為15.24 mg/g,與模型預(yù)測(cè)結(jié)果相差0.66 mg/g，證實(shí)模型的有效性和可行性；FOJ提取量比傳統(tǒng)的水提提高了12.99 mg/g，相當(dāng)于水提的 677%，比文獻(xiàn)報(bào)道的通過(guò)正交優(yōu)化超聲波提取提高了7.64 mg/g，相當(dāng)于其200%[8]，充分說(shuō)明 UA-DESs技術(shù)可高效提取茉莉花黃酮。本文為天然植物活性成分綠色提取提供了一定的數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)茉莉花資源提供了一種新思路。