孫志鵬 ，呂偉華，黨紅陽,2，曹頂臣，匡友誼，魯翠云，鄭先虎

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，淡水魚類育種國家地方聯合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學,農業(yè)農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306）

CCAAT 增強子結合蛋白 (CCAAT enhancer binding protein,C/EBP) 是堿性區(qū)亮氨酸拉鏈(basic region／leucine zipper，Bzip)蛋白家族的一個轉錄因子[1]。C/EBP 轉錄因子包含一個高度保守的DNA 結構域和一個亮氨酸拉鏈二聚體結構域，形成同源或異源二聚體結合到相似的序列上[2]。其中，C/EBPα 在脂肪細胞、骨髓細胞、肝臟、肺及胎盤等多種細胞或組織中均有表達[3-5]，具有調控細胞分化、參與能量代謝、抑制細胞增殖等多種生物學功能[6]，脂肪細胞分化過程中控制動物腹腔脂肪沉積的主效基因或與主效基因緊密連鎖。Lekstrom 和Xanthopoulos[7]發(fā)現：C/EBPα 基因的過表達能加速前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化，在大多數特異性脂肪細胞基因轉錄之前表達。Yeh 等[8]和Rosen 等[9]揭示，C/EBPα 在脂肪細胞分化的終末階段大量表達，與過氧化物酶體增殖劑激活受體（peroxisome proliferator activated receptor,PPARγ）共同作用，開啟一系列脂肪特異性基因的表達，合成、攝取和儲存長鏈脂肪酸，使細胞停止增殖，呈現完全分化狀態(tài)。

目前，關于C/EBPα 與脂肪沉積關系的研究主要集中在哺乳動物和畜禽方面。Wang 等[10]研究發(fā)現：小鼠C/EBPα 基因表達受到干擾后，腹部脂肪沉積明顯下降。Lee 等[11]研究顯示，敲除C/EBPα 基因后，小鼠喪失了磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因功能，影響糖代謝和脂肪生成。耿蓓等[12]研究表明，高脂飲食會抑制小鼠血液中C/EBPα 的表達。張愛朋等[13]比較了C/EBPα 突變肉雞與未突變個體發(fā)現，突變個體腹脂含量及腹脂率顯著高于未突變個體。然而，C/EBPα 基因在魚類中卻鮮有報道。本研究通過克隆鯉Cyprinus carpio C/EBPα 基因全長cDNA 序列，并將其編碼氨基酸序列與其他物種進行了同源性多重比較及系統(tǒng)進化分析，研究C/EBPα 基因在鯉不同組織中及其在不同胚胎發(fā)育時期的表達特征，以期為深入研究C/EBPα 基因在鯉脂肪細胞分化及脂肪發(fā)生過程中的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗魚5 尾為1 齡魚，體質量200～250 g，取自中國水產科學研究院黑龍江水產研究所呼蘭試驗站同一養(yǎng)殖池塘，禁食24 h 后，采集腹腔脂肪（脂肪組織）、腦組織、肝臟、心臟、脾臟、腎臟、腹部肌肉、腸組織和血液等樣本，迅速放入液氮中保存?zhèn)溆?；依次采集鯉受精卵期? 細胞期、囊胚晚期、原腸胚晚期、7 體節(jié)期、心跳期、體循環(huán)期、出膜期、開口期和出苗5 d 等10 個不同發(fā)育時期胚胎樣本，保存于液氮中備用。

1.2 基因全長cDNA 獲得

參照RNeasy Min Elute Clean up Kit（QIAGEN）試劑盒說明提取總RNA，使用Prime ScriptTMRT reagent Kit 試劑盒合成cDNA 第一鏈。從NCBI 檢索并下載斑馬魚等硬骨魚類C/EBPα 基因的cDNA 序列，選擇保守區(qū)域與鯉轉錄組文庫進行比對，獲得鯉C/EBPα 基因部分cDNA 序列，并設計同源簡并引物（表1）。以反轉錄產物cDNA 為模板，PCR 產物純化后連接到PMD18-T（TaKaRa）載體,轉入DH5α 感受態(tài)細胞，選擇陽性克隆送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序，獲得C/EBPα 基因核心片段序列。參照SeqAmpTMDNA Polymerase（Clontech）試劑盒說明進行5’/3’端RACE 擴增，以獲得非編碼區(qū)（UTR）序列。測序結果經BLAST（https://www.n cbi.nlm.nih.gov/）比對、DNAMAN 分析和Staden（1.7）拼接，最終獲得C/EBPα 基因的全長cDNA 序列[14]。

1.3 基因序列特征及系統(tǒng)進化分析

利用ExPASy（https://www.expasy.org/proteomics）等在線軟件分析信號肽、跨膜結構、蛋白二級結構、蛋白疏水性及脂肪系數等蛋白特征。使用MEGA6.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining method，NJ）構建系統(tǒng)進化樹，Bootsrap 值取1 000 次，由JTT 距離矩陣模型（JTT matrix-based method）計算進化距離[ 15 ]。

1.4 基因表達特征分析

參照測序后獲得的C/EBPα 基因全長cDNA 序列，設計熒光定量引物（表1）。以反轉錄產物cDNA為模板,以鯉18S 為內參基因，參照One Step SYBRPrime ScriptTMRT-PCR Kit II（TaKaRa）試劑盒使用方法，利用ABI 7500 Real-time PCR 定量儀，測定了鯉不同組織間和不同胚胎發(fā)育時期C/EBPα 基因的相對表達量，每個樣品設3 個重復。采用2-△△Ct方法計算基因相對表達量。利用SPSS 17.0 單因素方差分析（one-way ANOVA）分析了基因相對表達量的差異顯著性，差異顯著性水平P＜0.05，差異極顯著性水平P＜0.01[16]。

表1 引物序列Tab.1 Primers used in this study

2 結果與分析

2.1 鯉C/EBPα 全長cDNA 序列分析

采用RACE 擴增方法獲得C/EBPα 基因的cDNA 全長總長為1 463 bp 的鯉C/EBPα（GenBank 登錄號：MN073500）。其中，234 bp 的5’端非編碼區(qū)（5’-UTR），861 bp 的開放閱讀框（編碼286 個氨基酸）和368 bp 的3’端非編碼區(qū)（內含30 bp 的polyA尾巴），polyA 上游176 bp 處存在一個“ACTAAA”加尾信號。

經ExPASy 的ProtParam 工具預測蛋白分子式為C1409H2210N426O438S13，總原子數為4 496 個。蛋白質相對分子量為32.5 kD，理論PI 值7.02；不穩(wěn)定系數為52.48，蛋白穩(wěn)定性較低；脂肪系數為63.50，親水性平均系數為-0.962。氨基酸預測分析表明，脯氨酸含量最高（8.0%），不含色氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺共帶負電荷殘基總數36個，精氨酸和賴氨酸帶正電荷殘基總計35 個。

2.2 氨基酸序列多重比較與進化樹構建

圖2 基于不同物種C/EBPα 氨基酸序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on C/EBPα amino acid sequences of different species

利用CLUSTAL 2.1 在線分析軟件對鯉C/EBPα 氨基酸序列進行比對。結果顯示，其與斑馬魚Danio rerio、大西洋鮭Salmo salar、小鼠Mus musculus 氨基酸序列的相似性分別為93.36%、63.64%和52.47%。多重比較結果顯示，6 個物種間C/EBPα 氨基酸序列同源性的差異主要集中在C-端的多肽上（圖1）。

基于23 個物種C/EBPα 氨基酸序列，采用MEGA 6 軟件，用N-J 法構建系統(tǒng)進化樹。結果顯示，全部魚類聚為一大支，其中鯉、鯽、斑馬魚等鯉科魚類聚為一支；虹鱒、大西洋鮭等鮭科類魚聚為一支；牙鲆Paralichthys olivaceus、半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis 等鲆鰈類魚聚為一支，哺乳動物聚為另一大支（圖2）。

2.3 C/EBPα 基因在鯉不同組織表達特征

實時熒光定量PCR 結果顯示，C/EBPα 基因在實驗組織中均有表達（圖3），9 個組織中基因相對表達量由高到低依次為：脂肪、腸、腦、脾、肝、腎、心臟、血液和腹部腹肌。脂肪的相對表達量相對高于其他組織，且差異極顯著(P＜0.01)；腦、脾、肝和腎組織中的表達量相當，無顯著差異(P＞0.05)。

2.4 C/EBPα 基因鯉不同發(fā)育時期表達特征

圖3 C/EBPα 基因在鯉不同組織中的相對表達量Fig.3 Relative expression levels of C/EBPα gene in different tissues of common carp C.carpio

圖4 鯉不同胚胎發(fā)育時期C/EBPα 基因的相對表達Fig.4 Relative expression levels of C/EBPα gene in different embryonic stage of common carp C.carpio

C/EBPα 基因在鯉胚胎不同發(fā)育時期表達量變化情況見圖4。由圖4 可知，受精后至心跳期，隨著胚胎的發(fā)育，C/EBPα 基因的表達量逐漸上升，心跳期表達量最高，相對其他時期差異極顯著（P＜0.01）。心跳期后基因表達量顯著下降，出膜期后C/EBPα基因表達量有所升高。

3 討論

自1989 年被發(fā)現至今，大量預測研究表明，C/EBPα 蛋白也位于細胞核內，屬于b-Zip 家族，具有典型亮氨酸拉鏈結構[17,18]。不同物種間C/EBPs 轉錄因子的DNA 結合域和激活域高度同源，尤其是DNA 結構域在進化過程中變異率極低。小鼠C/EBPα 基因編碼區(qū)長度約1 188 bp，編碼395 個氨基酸[11]，秦川?；蚓幋a區(qū)長度1 062 bp，編碼353 個氨基酸[19]，雞C/EBPα 基因編碼區(qū)長度約1 300 bp[20]，朗德鵝基因編碼區(qū)長度約975 bp，編碼324 個氨基酸[21]。本研究克隆了鯉C/EBPα 基因全長，開放閱讀框861 bp，共編碼286 個氨基酸，編碼氨基酸數較哺乳動物和畜禽類少。鯉C/EBPα 基因編碼氨基酸序列與斑馬魚相似度為93.36%，而與人相似度僅為52.47%，可見物種間差異較大。系統(tǒng)進化分析結果顯示，哺乳動物聚為一大支，魚類聚為一大支，鯉科魚類聚為一小支，說明C/EBPα 基因在進化過程中具有較高的保守性。盤道興等[22]研究表明，C/EBPα基因在豬皮下脂肪中表達量最高，肝和小腸中表達較高，心和腎中表達量最低，與本研究結果相近，說明在豬和鯉組織中C/EBPα 基因表達量與脂肪細胞的實際分布成正比。

大多數魚類在饑餓狀態(tài)下優(yōu)先動用脂肪作為能量來源[23,24]，而且對脂肪的利用能力很高，其用于機體增重和分解供能的總利用率達90%以上[25]。C/EBPα 在脂肪細胞分化、發(fā)育過程中起決定作用，眾多脂肪細胞特異性表達的基因都含有C/EBPα 的結合位點，可激活大部分脂肪細胞特異性表達基因，如磷酸烯醇丙酮酸羧基酶（PEPCK）基因、葡萄糖轉運體（GLUT）-4 基因及瘦素（leptin）等的調控區(qū)域，從而啟動相關基因的轉錄表達，同時促進細胞中脂肪的積累[26,27]。脂肪沉積主要通過脂肪細胞數量增多和體積增大來實現。韋璇等[28]發(fā)現，C/EBPα 基因表達上調會促進脂肪細胞體積增大，導致阿勒泰羊尾部脂肪沉積。然而對魚類脂肪性狀的研究，應系統(tǒng)探究脂肪沉積、脂肪分解、脂肪酸的形成等，單純孤立研究某一個或兩個基因遠遠不夠，需要更多地發(fā)掘魚類的脂質產生與代謝相關基因表達的差異，從整體上把握這些基因控制魚類脂肪性狀的相關性，清楚地了解魚類脂肪性狀的控制機制。