楊晨，袁哲，閆可心，胡海玥，汪建明*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.優(yōu)滋福（天津）食品科技有限公司，天津 300457）

燕麥中除了含有大量的β-葡聚糖，還含有豐富的蛋白質(zhì)（12% ～24%）[1-2]，其中球蛋白占總蛋白質(zhì)含量的70% ～80%，主要由12S、7S和3S蛋白組成[3-4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，燕麥蛋白（oat protein isolate，OPI）具有良好的凝膠特性[5]。加熱變性后的燕麥蛋白六聚體解聚成活躍的單體，并且二級結(jié)構(gòu)打開，提供了大量的交聯(lián)點，在靜電斥力逐漸降低的情況下可促使蛋白質(zhì)單體有序排列，從而形成類似聚合物凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[5-6]。燕麥蛋白這一凝膠結(jié)構(gòu)和加熱變性后的特性使其具有較好的凝膠硬度以及包埋、保護和控釋營養(yǎng)素的能力[6-9]。但是燕麥蛋白凝膠在中性和弱酸性條件下的硬度較弱，在含有胰蛋白酶的模擬胃液中超過1 h，部分燕麥蛋白凝膠會降解，從而影響其在模擬消化液中的控釋能力[7]。在蛋白質(zhì)中添加多糖可制備不同微結(jié)構(gòu)的凝膠，可有效增強蛋白凝膠的硬度，也可增強其作為載體保護功能性物質(zhì)活性的能力。

Nieto等研究了在酸性和中性條件下菊粉、卡拉膠和糊精對熱致燕麥蛋白凝膠結(jié)構(gòu)和硬度的影響，發(fā)現(xiàn)在加熱凝膠過程中，兩種物質(zhì)產(chǎn)生了相分離從而使多糖分散在燕麥蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，同時增加了凝膠內(nèi)部蛋白質(zhì)部分的濃度，從而增強了燕麥蛋白-多糖熱致凝膠的硬度[10-11]。然而，加熱條件會破壞熱敏性生物活性物質(zhì)，熱凝膠作為營養(yǎng)物質(zhì)遞送體系有一定的局限性，冷誘導(dǎo)燕麥蛋白-多糖混合凝膠的特性還有待研究。

結(jié)冷膠（gellan gum，GG）因其凝膠性、透明性高，耐高溫，在較寬的pH值條件下穩(wěn)定性好，因此廣泛應(yīng)用于食品體系中以增強食品的質(zhì)構(gòu)和穩(wěn)定性[12-14]。結(jié)冷膠與大豆蛋白和蛋清蛋白混合可改善蛋白質(zhì)凝膠性和結(jié)構(gòu)[15-16]。本研究的預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，熱變性后的燕麥蛋白與結(jié)冷膠混合形成的凝膠具有較強的凝膠硬度和較好的性質(zhì)，有望作為營養(yǎng)物質(zhì)遞送體系。本文通過葡糖酸-δ-內(nèi)酯（glucono-delta-lactone，GDL）誘導(dǎo)凝膠（冷誘導(dǎo)）的方法，制備熱變性后的燕麥蛋白-結(jié)冷膠共混凝膠，通過質(zhì)構(gòu)分析、掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡、傅里葉紅外光譜等方法，探究不同pH值對共混凝膠的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及控釋行為的影響，為燕麥蛋白-結(jié)冷膠共混凝膠體系應(yīng)用在食品工業(yè)中提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裸燕麥：加拿大曼尼托巴??；燕麥蛋白（OPI）：加拿大阿爾伯塔大學農(nóng)業(yè)、食品、營養(yǎng)系實驗室提取[10]，蛋白質(zhì)含量為（90.4±0.6）%；結(jié)冷膠（純度為99%，分子量500 kDa）：河南華森食品添加劑有限公司；葡糖酸-δ-內(nèi)酯（GDL）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

傅里葉紅外光譜儀（NICOLET IS50）：德國Thermo Scientific公司；SU1510掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）：日本 Hitachi公司；激光掃描共焦顯微鏡（confocal）：日本尼康公司；真空冷凍干燥（FD-1-50）：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；紫外可見分光光度計（Evolution300）：Thermo Fisher Scientific公司；恒溫磁力攪拌器（H05-1）：天津東南儀誠科技有限公司；智能數(shù)顯磁力加熱控溫攪拌器（TP-350S）：杭州米歐儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 燕麥蛋白-結(jié)冷膠（OPI-GG）冷誘導(dǎo)凝膠制備

OPI溶于水中并在室溫25℃下攪拌過夜，用1 mol/L NaOH將溶液調(diào)節(jié)至pH 8。將OPI溶液密封在玻璃瓶中并在115℃（高于變性溫度）油浴中加熱15 min。隨后冷卻至室溫25℃，加入不同濃度的GG（0%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%，基于蛋白質(zhì)干重的質(zhì)量分數(shù)），使得OPI的濃度為7 g/100 mL且保持每個樣品有相同的總體積，并將不同量的GDL（20%，9%，4%，1.5%，基于蛋白質(zhì)干重的質(zhì)量分數(shù)）加入到溶液中，將溶液儲存在4℃下24 h，形成不同pH值（4、5、6、7）的OPI-GG凝膠。

1.3.2 OPI-GG凝膠質(zhì)構(gòu)分析

OPI-GG凝膠制成相同的高度（18 mm）和直徑（22 mm），確保表面和底面的平整，采用P/36R探頭分析凝膠的硬度，測定參數(shù)為：測定前速度5 mm/s，測定速度2 mm/s，測后速度5 mm/s，應(yīng)變位移60%，引發(fā)力5 g，引發(fā)類型為自動。

1.3.3 復(fù)合凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

OPI-GG凝膠經(jīng)液氮速凍后凍干，取自然凍干截面，經(jīng)表面噴灑鍍金后置于SEM下，觀察不同條件處理后的凝膠微觀形貌[7]。

用激光共聚焦觀察OPI-GG凝膠內(nèi)燕麥蛋白和結(jié)冷膠的分布。將0.54 g的GG和60 mL水混合，然后向混合物中加入10 mg異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC），避光攪拌過夜后透析 12 h，冷凍干燥。羅丹明B用于OPI的非共價標記，首先制備蛋白質(zhì)懸浮液30 mL，然后加入2 mg羅丹明B，混合物在室溫25℃下避光攪拌過夜后透析12 h，冷凍干燥。將標記過的OPI與GG混合，制備凝膠，方法同1.3.1。將制備好的凝膠樣品置于顯微鏡載玻片上，蓋上薄片，并在488 nm和543 nm波長同時獲得熒光圖像[9]。

1.3.4 OPI-GG凝膠分子結(jié)構(gòu)的測定

準確稱量1 mg OPI-GG凝膠的凍干樣品，加入150 mg充分干燥的KBr（其中溴化鉀放在烘箱中105℃烘干超過8h），用研缽將其充分研磨至細末貼壁。使用壓片機（108Pa）將混合粉末壓制1 min成透明薄片，用紅外光譜儀做全波段掃描（4 000 cm-1～400cm-1），分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16次，以空氣為采集背景，樣品紅外光譜圖經(jīng)過傅立葉變換后利用OMNIC 8.2軟件進行分析處理。

1.3.5 包埋核黃素的OPI-GG凝膠的控釋行為的測定

OPI（7 g/100 mL）在115℃油浴中加熱變性，冷卻至室溫25℃后加入核黃素（1%，基于蛋白質(zhì)干重的質(zhì)量分數(shù)）和不同濃度的GG，避光攪拌，制備凝膠（方法同1.3.1）。核黃素的包埋率通過紫外分光光度計測定，先將包埋核黃素的凝膠凍干，粉末溶于蒸餾水，攪拌過夜，6 000 g離心20 min，取上清液，稀釋后，用紫外可見分光光度計445 nm波長下測定吸光度值，根據(jù)核黃素的標準曲線計算核黃素包埋量。核黃素包埋率通過以下公式計算：

式中：C0為包埋在凝膠中核黃素含量，mg，C1為核黃素總含量，mg。

將包埋核黃素的OPI-GG凝膠置于pH1.2磷酸緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（37℃）中 2 h后，再將凝膠轉(zhuǎn)入中性PBS（pH7.4，37℃）8 h進行釋放試驗。每隔特定的時間取樣，采樣之后，補充等體積PBS，以保持恒定的體積。取出的液體離心（6 000 g，10 min）后用紫外可見分光光度計在445 nm波長下測量核黃素吸光值，通過標準曲線，計算其釋放量（R1），在模擬腸液中釋放8 h后，將剩余凝膠破碎，使核黃素充分溶出，離心取上清液稀釋后用紫外分光光度計在445 nm處測量核黃素的吸光值，根據(jù)核黃素的標準曲線計算核黃素的量（R2），該值加上核黃素在模擬胃液2 h后釋放的量（R0），即為核黃素的總量（Rt），核黃素的釋放率/%=R1/Rt× 100。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值和GG濃度對OPI-GG凝膠硬度的影響

本研究通過質(zhì)構(gòu)分析，探究了不同GG濃度和pH值對OPI-GG凝膠硬度的影響，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH值和GG濃度對OPI-GG凝膠硬度的影響Fig.1 Effect of pH and GG concentration on OPI-GG gel hardness

試驗中發(fā)現(xiàn)，pH值為7時，OPI-GG凝膠透明且富有彈性，但由于凝膠硬度低于儀器檢測下限，無法被檢測。如圖1所示，不同的pH值對OPI-GG凝膠硬度有顯著影響（P<0.05），凝膠硬度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在pH值為6時，OPI與GG的靜電斥力降低，分子間的氫鍵和疏水基相互作用增強，凝膠硬度也隨之增加[8]。當pH值等于OPI等電點（pH值為5）時，OPI與GG因為靜電吸引力形成凝聚體，從而使OPI-GG凝膠硬度增強，此時凝膠硬度最大。當pH值為4時，凝膠硬度降低，由于pH值低于OPI等電點，OPI分子間帶正電荷而產(chǎn)生靜電斥力從而使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)溶脹。在GG濃度為0% ～0.10%時，不同的GG濃度對凝膠硬度也有顯著影響（P<0.05），凝膠硬度隨著GG濃度增加而增加，在GG濃度為0.1%時凝膠硬度達到最大值，隨著GG添加量的繼續(xù)增加，凝膠的硬度逐漸降低，其原因可能是過多的GG與OPI分子相互作用，阻礙了OPI分子間和分子內(nèi)的相互作用從而不能形成堅固的凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[8，17]，最終導(dǎo)致凝膠硬度減弱。凝膠硬度分析結(jié)果表明，GG添加量為0.1%、pH值為5時凝膠硬度最大，0.1%GG濃度被選為最優(yōu)制備OPI-GG凝膠條件。

2.2 不同pH值對OPI-GG凝膠網(wǎng)絡(luò)微結(jié)構(gòu)的影響

掃描電子顯微鏡可直觀地觀察不同pH值條件下形成的OPI-GG凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，如圖2所示。

圖2 不同pH值條件下OPI-GG凝膠掃描電子顯微鏡圖Fig.2 SEM images of OPI-GG gel formed at different pH

從圖2中可以看出，不同pH值條件下形成的OPIGG凝膠均具有類似聚合物的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。OPI-GG在pH 5時的凝膠孔徑最小，形成致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在此條件下，OPI與GG帶相反電荷，分子間具有靜電吸引力，同時OPI分子在預(yù)加熱的條件下解聚和伸展，使功能基團暴露出來，有利于蛋白質(zhì)和多糖之間的相互作用，GG與OPI通過相互作用形成均一穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-多糖體系，因此，在pH值為5時，OPIGG凝膠具有最強的硬度。在pH值為6時，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的孔徑變大，此時OPI所帶負電荷較少[8]，與GG之間雖然存在靜電斥力，但是由于OPI在預(yù)加熱變性后功能基團暴露，其與GG之間可能仍因疏水基和氫鍵作用而相互結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和較強的凝膠硬度。在pH值為4時，由于pH值遠離OPI等電點，OPI-GG形成凝膠后，其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)隨著pH值降低而吸水溶脹，內(nèi)部孔徑變大，因此凝膠硬度減弱[8]。同理，隨著pH增加至7，遠離OPI等電點，凝膠結(jié)構(gòu)的孔徑變大，凝膠孔壁變薄，OPI-GG凝膠的硬度變?nèi)?。有趣的是，在pH 6和pH 7的條件下，凝膠孔徑雖然變大，但是內(nèi)部均出現(xiàn)細絲連接的現(xiàn)象。在OPI等電點以上時，OPI-GG存在靜電斥力可能產(chǎn)生相分離，在蛋白質(zhì)分子和多糖分子凝聚的過程中，OPI和GG可能各自形成網(wǎng)絡(luò)，從而形成雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致凝膠孔內(nèi)出現(xiàn)細絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

OPI-GG凝膠中蛋白質(zhì)的多糖在不同pH值條件下的分布情況可通過激光共聚焦顯微鏡進行觀察，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同pH值條件下OPI-GG凝膠中的激光共聚焦顯微鏡圖Fig.3 Effect of different pH on laser confocal microscopy of OPI-GG gel

由圖3可知，在pH4條件下，加入GDL后，OPI-GG共混物在pH值快速降低的情況下迅速形成凝膠，OPI和GG在凝膠中的分布較均勻。pH 5接近OPI的等電點，OPI帶有少量的正電荷，與GG相互作用力較弱，在pH值快速降低的情況下，OPI-GG形成蛋白質(zhì)和多糖均勻分布的凝膠，其驗證了SEM的觀察結(jié)果，即在pH 4和5條件下，OPI-GG形成了致密的均勻的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在pH值為6或7時，隨著凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，交聯(lián)的GG（白色虛線圈內(nèi)）與OPI分開，嵌入在OPI連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)中，這是由于這個OPI與GG均帶有負電荷，在緩慢凝膠過程中由于靜電斥力而各自形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而形成相分離狀態(tài)的凝膠雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。從圖3（pH 7，24 h）中可以看出，GG分布在OPI凝膠的連續(xù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)，證實了圖2（pH 7）凝膠孔內(nèi)的細絲是結(jié)冷膠在OPI連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中形成的雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2.3 OPI-GG凝膠分子構(gòu)象變化

傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）是常用的表征分子中化學鍵或官能團的信息的方法之一[18]。圖4是OPI-GG凝膠在不同pH值下FTIR的吸收光譜圖。

圖4 不同pH值條件下OPI-GG凝膠FTIR圖譜的變化Fig.4 FTIR image of OPI-GG gel formed at different pH value

如圖4所示，隨著pH值降低，在1 640 cm-1處的特征峰吸收硬度增強，OPI與GG之間的作用力逐漸增強。pH 4時，在1 777 cm-1處出現(xiàn)新的峰，代表羧基中C=O伸縮振動，另外，與pH 7條件下形成的凝膠相比，pH 4時形成的凝膠在3 298 cm-1處的特征峰比較尖銳，發(fā)生藍移，-OH強吸收[19]，證明分子間氫鍵作用增強，GG上乙酰基與OPI發(fā)生乙?；磻?yīng)，從而使微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。pH 5時，-OH拉伸振動峰在3 303 cm-1變化明顯，這是由于OPI與GG因靜電吸引力而相互作用，OPI中的羥基/氨基與GG的羥基之間形成了較強的氫鍵[20]，證實了在pH 5條件下形成的凝膠因較強的蛋白質(zhì)與多糖相互作用力而具有較強的凝膠硬度。在pH7時，1411cm-1處-OH的特征峰紅移到1401cm-1，吸收峰也增強，說明OPI-GG凝膠在pH 7時有氫鍵生成。然而，預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，在pH 7時，由于OPI和GG均帶有負電荷，它們之間的相互作用力以疏水作用力為主（數(shù)據(jù)沒有體現(xiàn)）。結(jié)合激光共聚焦和掃描電鏡得到的pH 7下OPI-GG形成的雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其氫鍵的形成可能是由于GG自身交聯(lián)而成。

2.4 pH值對負載核黃素的OPI-GG凝膠的包埋率和控釋性能的影響

不同pH值的OPI-GG凝膠包埋核黃素的包埋率測試結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同pH值對OPI-GG凝膠包埋率的影響Fig.5 Effect of different pH on the encapsulation efficiency of OPI-GG gel

由圖5可知，在pH 4和pH 5時，OPI-GG凝膠的包埋率略低，約61%，隨著pH值升高至6和7，包埋率分別增加至67%和75%。在pH 6和pH 7條件下，OPI-GG凝膠由于靜電斥力產(chǎn)生相分離，形成雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此可有效阻止核黃素的溶出，提高凝膠的包埋率。

包埋核黃素的OPI-GG凝膠在PBS中的釋放試驗如圖6所示。

圖6 包埋核黃素的OPI-GG凝膠在PBS（pH 1.2，pH 7.4）中的釋放曲線圖Fig.6 Release rate of riboflavin encapsulated in OPI-GG gels in PBS（pH 1.2，pH 7.4）

由圖6可知，pH 7條件下不添加GG制備的OPI凝膠，在pH 1.2的酸性PBS中2 h時，核黃素的釋放率為42%，加入0.1%的GG以后，在pH 1.2的PBS環(huán)境下2 h時釋放率為33%，隨著凝膠制備的pH值降低至5和4時，2 h的核黃素釋放率降低至18%和16%。在pH 7.4的PBS中，不加GG的OPI凝膠3 h以后幾乎釋放全部核黃素。加入0.1%的GG后，在pH 7和pH 6條件下制備的凝膠核黃素的釋放率明顯，低于不加GG的凝膠。當凝膠pH值為4和5時，在pH7.4 PBS中浸泡8 h后，核黃素的釋放率降低至49%和53%。

OPI-GG凝膠釋放核黃素的機制與其結(jié)構(gòu)和相互作用力有很大關(guān)系。在pH 4和pH 5時，SEM和FTIR的結(jié)果顯示，相對于pH 6和pH 7形成的雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)凝膠，其凝膠壁的孔徑較小，網(wǎng)絡(luò)比較致密，而且凝膠的形成速度較快，OPI和GG形成更強的相互作用力，所以在pH 4和pH 5條件下形成的OPI-GG凝膠在pH 1.2的條件下受酸性環(huán)境的影響較小，可以控制核黃素的釋放率在17%左右，在pH 7.4的條件下通過擴散緩慢釋放核黃素。試驗結(jié)果證明，具有雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的OPI-GG凝膠具有較好的包埋能力，具有均勻致密的單網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的OPI-GG凝膠具有較好的控釋能力，因此，OPI-GG凝膠具有作為營養(yǎng)素包埋和遞送體系應(yīng)用在食品工業(yè)中的潛力。

3 結(jié)論

本文通過GDL冷誘導(dǎo)制備OPI-GG凝膠，利用質(zhì)構(gòu)分析、掃描電鏡、激光共聚焦、FTIR等方法研究不同制備條件下混合凝膠的硬度，以及不同pH值條件下凝膠微結(jié)構(gòu)與控釋特性之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明在GG添加量為0.1%pH 5條件下制備的凝膠硬度最大。凝膠硬度與凝膠結(jié)構(gòu)和分子構(gòu)象的變化有關(guān)，pH 4和pH 5時，由于靜電引力的相互作用，OPI與GG之間相互作用力增強，OPI-GG凝膠形成致密的均勻的單網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在pH 6和pH 7時，OPI與GG由于靜電斥力的作用產(chǎn)生相分離，從而形成雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。具有不同微結(jié)構(gòu)的OPI-GG凝膠可作為基質(zhì)包埋核黃素，研究結(jié)果表明，OPI-GG雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)凝膠的包埋率為75%，其在pH 1.2 PBS中2 h時釋放核黃素33%；OPI-GG致密單網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)凝膠的包埋率為61%，在pH 1.2 PBS中2 h時釋放核黃素18%。本研究結(jié)果證明，在pH 6和pH 7條件下制備的OPI-GG雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)冷凝膠具有較好的核黃素包埋能力，在pH 4和pH 5條件下制備的具有均一致密結(jié)構(gòu)的OPI-GG單網(wǎng)絡(luò)冷凝膠具有較好的控釋能力，具有不同微結(jié)構(gòu)的OPI-GG冷凝膠可作為營養(yǎng)素包埋和遞送體系，為其應(yīng)用在食品中作為營養(yǎng)素載體提供理論基礎(chǔ)。