郭 冶，盧鳳美，黃 蓉，位小杰，張曉波，劉東璞(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

肝臟疾病(肝炎、肝硬化、肝癌等)是導(dǎo)致人們健康負(fù)擔(dān)的重要原因，據(jù)報道：全球肝硬化患者死亡人數(shù)1980年約67.6萬[1]，2013年約122.1萬[2]，而肝纖維化(hepatic fibrosis)是其發(fā)生、發(fā)展的中間環(huán)節(jié)。肝纖維化是指各種病因，如感染、病毒、寄生蟲、藥物、酒精、遺傳、化學(xué)毒物等，引起肝細(xì)胞發(fā)生炎癥及壞死等變化，刺激并激活靜止的肝星狀細(xì)胞(quiescent HSCs, qHSCs)，活化的肝星狀細(xì)胞(activated HSCs, aHSCs)轉(zhuǎn)化成可以釋放大量α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)的肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast, MFB)，進(jìn)而肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的合成與降解平衡失調(diào)，導(dǎo)致肝內(nèi)纖維膠原組織異常沉積的病理過程。隨著“補(bǔ)充和替代醫(yī)療(Complementary and Alternative Medicine，CAM)”的發(fā)展，新型生物活性物質(zhì)，如特性中藥成份及早干預(yù)肝纖維化是有效的[3]。通過本實驗研究大黃酸有抑制肝纖維化發(fā)展的作用[4，5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康成年SPF級SD雄性大鼠(180～220g)60只。由佳木斯大學(xué)實驗動物中心提供，使用許可證號：[SYXK(黑)2016-014)。本研究根據(jù)美國第8版《實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南》中國際公認(rèn)的實驗室動物使用和護(hù)理原則，健康和營養(yǎng)狀況在同一水平的大鼠進(jìn)行觀察喂養(yǎng)，進(jìn)行實驗。

1.1.2 實驗試劑

大黃酸購于淮安市巍偉植化研究所，秋水仙堿(國藥準(zhǔn)字H20113208)廣東彼迪藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，α-SMA多克隆抗體購于Boster公司，MMP-13及TIMP-1單克隆抗體購于Abcam公司，RT-PCR試劑盒均購于Foregene公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

將60只大鼠飼養(yǎng)于恒溫(22±2)℃條件下，標(biāo)準(zhǔn)柱粒狀飼料飼養(yǎng)，自由飲水，觀察3d后隨機(jī)分為5組，分別為：空白對照組(N組)，CCl4模型對照組(M組)、秋水仙堿干預(yù)組(C組)、大黃酸低劑量干預(yù)組(RL組)、大黃酸高劑量干預(yù)組(RH組)。每組各12只。

1.2.2 動物模型建立

肝纖維化模型制備：M、C、RL、RH組大鼠腹腔注射40%CCl4與花生油混合物，3mL/kg，2次/周。N組腹腔注射等體積的花生油，共7周。

1.2.3 動物給藥方法

造模后3周，C、RL、RH組大鼠分別給予秋水仙堿0.2mg/kg、大黃酸50mg/kg、大黃酸100mg/kg溶于生理鹽水的混懸液灌胃治療，3次/周，共4周。N組、M組給予等體積的生理鹽水灌胃。

1.2.4 肝組織病理學(xué)、IHC及RT-PCR觀察

各組大鼠肝臟組織取制作好的石蠟切片，進(jìn)行蘇木素&伊紅(H&E)染色，采用SABC法進(jìn)行IHC實驗，光學(xué)顯微鏡下觀察α- SMA、MMP-13及TIMP-1蛋白陽性結(jié)果表達(dá)情況。按照RT-PCR試劑盒從肝臟組織中提取總RNA，再以1.0ug總RNA作為模板， 去gDNA 42℃ 2min， 失活 gDNase42℃ 15min，失活逆轉(zhuǎn)錄酶85℃ 5sec，合成cDNA。進(jìn)行熒光定量實時PCR擴(kuò)增反應(yīng)，95℃ 10min，95℃ 15sec，60℃ 1min進(jìn)行40個循環(huán)，從而得出同時測出的需檢測基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物Ct值，進(jìn)而檢測2-ΔΔCt值進(jìn)行靶基因細(xì)胞因子的定量分析。以上述觀察肝纖維化活躍程度。引物由通用生物合成，見表1。

表1 實時PCR反應(yīng)的引物設(shè)計

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察

大鼠肝臟組織切片進(jìn)行H&E染色后，經(jīng)病理科醫(yī)師判定診斷：N組肝小葉結(jié)構(gòu)排列整齊，肝細(xì)胞形態(tài)正常；與N組比較，M組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉間大量纖維膠原組織增生，較寬，延伸入小葉間，有少量形成完整假小葉間隔，肝條索間隙增寬，伴肝細(xì)胞脂肪變及氣球樣變；與M組比較，C、RL、RH組纖維膠原組織明顯減少，其中RH組纖維化程度最輕。見圖1。

圖1 實驗第7周末各組大鼠肝臟組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)(H&E，×200)

2.2 大鼠肝臟組織IHC中a-SMA和MMP-13蛋白的表達(dá)

大鼠肝臟組織IHC切片觀察，纖維膠原組織呈棕黃色為陽性表達(dá)。見圖2、3。在α-SMA蛋白表達(dá)中，N組陰性表達(dá)，中央靜脈邊緣少量棕黃色著色；與N組比較，M組肝纖維膠原組織及中央靜脈區(qū)全部表達(dá)陽性；與M組比較，C、RL、RH組陽性表達(dá)明顯減少，其中RH組陽性表達(dá)程度最輕，說明肝纖維化程度越輕。在MMP-13蛋白表達(dá)中，N組陰性表達(dá)；與N組比較，M、C、RL、RH組陽性表達(dá)相對增加，其中RH組陽性表達(dá)程度最高，說明肝纖維化程度最輕。見表2。

表2 5組大鼠肝臟組織IHC中α-SMA、MMP-13因子AOD值的表達(dá)

圖2 實驗第7周末各組大鼠肝臟組織a-SMA蛋白的表達(dá)(IHC，×400)

圖3 實驗第7周末各組大鼠肝臟組織MMP-13蛋白的表達(dá)(IHC，×400)

2.3 大鼠肝臟組織RT-PCR中a-SMA、MMP-13及TIMP-1 mRNA的表達(dá)

大鼠肝臟組織RT-PCR中a-SMA及TIMP-1 mRNA的表達(dá)，N組含量少，條帶亮度輕；與N組比較，RH、C、RL、M組表達(dá)量逐漸升高，M組含量最高，條帶亮度最重；MMP-13 mRNA的表達(dá)，M組表達(dá)最少，與M組比較，N、C、RL、RH組表達(dá)量及亮度逐漸升高，其中RH含量最高。見圖4。

圖4 實驗第7周末各組肝臟組織瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

肝纖維化早期階段，膠原沉積在Disse間隙內(nèi)皮下，使間隙變小甚至完全消失，進(jìn)而肝竇毛細(xì)血管化，肝細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸受阻，終因缺血缺氧、變性壞死，導(dǎo)致功能障礙；晚期階段(即肝硬化)，形成假小葉及結(jié)節(jié)，甚至發(fā)展到肝癌等嚴(yán)重肝病時，肝移植仍是唯一的根治途徑[6]。截止到目前，即使臨床上廣泛應(yīng)用非侵入性檢測方法，但活檢仍然是診斷肝纖維化分期的金標(biāo)準(zhǔn)[7]。α-SMA是HSC活化的標(biāo)志物，血小板衍生生長因子-D(PDGF-D)未能增強(qiáng)α-SMA的產(chǎn)生，能上調(diào)TIMP-1表達(dá)的能力[8]。干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和表皮生長因子(EGF)能通過刺激Smad7蛋白表達(dá)來抑制TGF-β/Smad誘導(dǎo)的包括肝纖維化的反應(yīng)[9]。活化的肝星狀細(xì)胞分泌金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性，并抑制它們降解ECM中的纖維化物質(zhì)[10]。

大黃酸作為一種天然自噬調(diào)節(jié)因子，可通過調(diào)節(jié)AMPK / mTOR信號途徑有效抑制腎小管細(xì)胞的自噬活性[11]，通過TGF-β/ Smad和Wnt /β-catenin信號通路，顯著降低了腎細(xì)胞中TGF-β引起的Klotho啟動子轉(zhuǎn)錄，從而起到抗腎纖維化作用[12]。屈艷等人通過大黃酸抑制miR-21及干預(yù)TGF-β1/ Smad7通路的研究，證實大黃酸抗肺纖維化作用[13]。郭美姿等人通過CCl4造模大鼠肝纖維化進(jìn)一步檢測TGF-β1和α-SMA的表達(dá)，給予大黃酸高低劑量，從大黃酸抗炎、抗氧化及抑制肝星狀細(xì)胞的活化，抑制TGF-β1作用等可能相關(guān)角度考慮，從而驗證大黃酸抗肝纖維化作用[14]。

本實驗通過細(xì)胞因子mRNA及蛋白的表達(dá)情況驗證了大黃酸有延緩肝纖維化進(jìn)展的作用，大黃酸低劑量組與臨床常用西藥秋水仙堿組比較差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，大黃酸高劑量組療效明顯優(yōu)于秋水仙堿組(P<0.05)差異顯著。由于本次實驗方法與條件有限，只做了IHC及RT-PCR，還不能揭示大黃酸抗肝纖維化的分子機(jī)制，將來還可以通過細(xì)胞因子作用的通路和基因敲除等進(jìn)一步探究肝纖維化的作用機(jī)制，我們渴望在未完全進(jìn)入臨床前做大量動物及細(xì)胞實驗，進(jìn)而做出正確的判定，為今后在臨床中的應(yīng)用打好提前戰(zhàn)。