馬芹，翁立雪，許明清，汪建華，趙杰，石艷紅，梁之策，張秀美

鴨源魏氏梭菌病的診斷與治療

馬芹1，翁立雪2，許明清1，汪建華1，趙杰1，石艷紅1，梁之策1，張秀美3*

（1.山東和康源生物育種股份有限公司，山東 濟(jì)南 250101；2.山東省煙臺市福山區(qū)畜牧獸醫(yī)站，山東 煙臺；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟(jì)南）

為建立鴨源魏氏梭菌病的診斷與治療方法，對臨床32周齡櫻桃谷種鴨腸道臌氣病例展開研究。結(jié)果為剖檢可見腸道臌氣、腸黏膜覆有黃色纖維素性假膜，實(shí)驗(yàn)室分離到革蘭氏陽性粗短桿菌，經(jīng)PCR擴(kuò)增及測序分析，鑒定為魏氏梭菌。同時(shí)在場區(qū)飼料中也檢測到該菌，因此種鴨感染可能跟飼料污染有關(guān)。臨床通過優(yōu)化飼料配方、入場前飼料細(xì)菌檢測，并對臨床病鴨使用恩拉霉素后，死淘現(xiàn)象得以有效控制。

近兩年種鴨感染魏氏梭菌病例較為普遍，臨床上發(fā)生明顯的降蛋，同時(shí)種鴨死淘率也較高。臨床病料如鼓氣的腸道、肝臟、飼料以及場內(nèi)土壤中均能檢測到魏氏梭菌，該菌水平傳播能力較強(qiáng)。臨床種鴨多因吞食污染的飼料而感染魏氏梭菌，引起腸道擴(kuò)張、充滿大量氣體，腸黏膜的脫落及腸壁變薄，該病典型的癥狀為腸道臌氣、黃色纖維素性假膜[1-3]。國內(nèi)外關(guān)于櫻桃谷種鴨感染魏氏梭菌的報(bào)道較少。本文從臨床診斷、病理剖檢及實(shí)驗(yàn)室檢測等方面展開，建立科學(xué)有效的診斷和治療方法，對臨床防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 方法

1.1.1 病料 山東聊城某種鴨場32周齡櫻桃谷鴨。

1.1.2 主要試劑 厭氧肉肝湯培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；血瓊脂平板，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；PCR反應(yīng)試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；革蘭染色試劑盒，購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床觀察與剖檢 發(fā)病的種鴨表現(xiàn)為飲食、飲水下降，不喜走動、腹瀉，日均死亡30只左右，產(chǎn)蛋下降。將病死鴨羽毛消毒打濕后，置于解剖臺進(jìn)行剖檢，觀察腸道及其他組織臟器的病變情況。剪開小腸的中后段，觀察腸內(nèi)容物與腸壁的厚薄程度，刮除腸內(nèi)容物后制作腸抹片，進(jìn)行固定、染色、鏡檢。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 在無菌工作臺內(nèi)，取肝臟劃線接種于血瓊脂平板，37 ℃ 厭氧環(huán)境，培養(yǎng)18~24 h。同時(shí)無菌剪取適量肝臟組織，置于厭氧肉肝湯培養(yǎng)基內(nèi)，沸水煮沸10 min，然后置于37 ℃ 溫箱內(nèi)培養(yǎng)18~24 h，觀察細(xì)菌生長情況。

1.2.3 PCR分析 取適量菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物為AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，下游引物為TACGGYTACCTTGTTACGACTT，擴(kuò)增體系為Mix12.5 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，細(xì)菌培養(yǎng)液2 μl，ddH2O 8.5 μl，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，72 ℃ 8 min，擴(kuò)增結(jié)束后于凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行觀察，連接轉(zhuǎn)化并進(jìn)行測序分析。

1.2.4 飼料檢測 將適量養(yǎng)殖場區(qū)內(nèi)飼喂的飼料置于厭氧肉肝湯內(nèi)，沸水煮沸10 min，然后置于37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18~24 h，觀察有無氣體產(chǎn)生，同時(shí)將培養(yǎng)液進(jìn)行鏡檢，觀察有無細(xì)菌生長，PCR擴(kuò)增判斷有無魏氏梭菌的污染。

2 結(jié)果

2.1 剖檢結(jié)果

病死鴨腹腔剖開后，腸道表面呈污黑色，腸壁變薄擴(kuò)張充氣，腸黏膜上覆蓋一層厚厚的黃色纖維素性假膜，易于剝離，部分腸道有麩皮樣物質(zhì)。腸抹片在鏡下觀察到革蘭陽性粗、短桿菌，大小為1~1.5 μm × 3~5 μm，兩端鈍圓，散在或排狀排列，形態(tài)和大小與魏氏梭菌相似。

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)分離培養(yǎng)后，血瓊脂平板上長出光滑、圓形、灰白色菌落，有明顯的溶血現(xiàn)象；經(jīng)厭氧肉肝湯培養(yǎng)后，試管內(nèi)培養(yǎng)液渾濁，并有較多的氣泡產(chǎn)生。取單一菌落和適量培養(yǎng)液進(jìn)行鏡檢，均觀察到革蘭陽性短粗桿菌，與腸抹片鏡檢結(jié)果一致。

2.3 PCR鑒定結(jié)果

細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)PCR擴(kuò)增后，觀察到1 500 bp左右單一片段，與預(yù)期擴(kuò)增目的條帶一致，經(jīng)測序比對分析該菌為魏氏梭菌。

2.4 飼料檢測結(jié)果

飼料在厭氧肉肝湯內(nèi)培養(yǎng)24 h后，觀察到明顯的氣泡。抽取適量培養(yǎng)液進(jìn)行革蘭染色，鏡下觀察到與肝臟分離菌形態(tài)一致，飼料中該菌含量更多，PCR擴(kuò)增及測序分析為魏氏梭菌。

3 討論

櫻桃谷種鴨感染魏氏梭菌后，剖檢癥狀與雞感染魏氏梭菌的病例相似[4-5]，出現(xiàn)了嚴(yán)重的腸道臌氣，腸黏膜壞死脫落，這解釋了臨床種鴨為何食欲下降、腹瀉，進(jìn)而導(dǎo)致較高的死淘率。魏氏梭菌屬于產(chǎn)氣厭氧型菌，經(jīng)厭氧培養(yǎng)后觀察到有“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象[6-7]，鏡檢為革蘭陽性粗短桿菌，再經(jīng)PCR和測序分析確定病原，本實(shí)驗(yàn)為臨床鴨源魏氏梭菌感染病例提供了診斷技術(shù)和方法。在臨床上不僅要檢測出病原、確定合適的治療方法，還應(yīng)分析疾病發(fā)生的原因，避免疾病的擴(kuò)散及復(fù)發(fā)，所以尋找魏氏梭菌的來源非常重要。魏氏梭菌分布范圍較為廣泛，飼料、土壤、糞便和畜禽腸道內(nèi)都適合該菌繁殖，所以飼料在入場前一定要進(jìn)行細(xì)菌檢測，避免污染的飼料進(jìn)入場區(qū)。在養(yǎng)殖過程中也應(yīng)注意飼料的合理存放，防潮防霉變；另外要注意突然更換飼料的成分、濫用抗生素、添加較多蛋白質(zhì)含量較高的物質(zhì)，易引起腸道菌群的失調(diào)，導(dǎo)致該病的發(fā)生。在養(yǎng)殖過程中，應(yīng)根據(jù)不同階段胃腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的需求進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。另一方面，球蟲感染也常繼發(fā)魏氏梭菌，因球蟲感染后產(chǎn)生的黏液和包漿蛋白質(zhì)是魏氏梭菌的最佳營養(yǎng)物質(zhì)[8-9]，在日常養(yǎng)殖過程中也應(yīng)注意球蟲的檢測與監(jiān)控。本實(shí)驗(yàn)通過臨床分析、病理剖檢、細(xì)菌分離培養(yǎng)及分子生物學(xué)診斷等方法，確定病原為魏氏梭菌后，臨床使用恩拉霉素藥物進(jìn)行治療，使得疾病得到了有效的控制。為防止該病的發(fā)生，還應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，及時(shí)清理糞便、更換墊料，做好日常消毒工作，避免應(yīng)激刺激[10]，控制好適宜的溫度與通風(fēng)。

4 結(jié)論

綜合臨床表現(xiàn)、剖檢觀察、實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)及分子生物學(xué)鑒定分析，確定該菌為魏氏梭菌。因該菌感染后引發(fā)了較高的死淘率，臨床采取緊急用藥，使用恩拉霉素7d后，死淘得到了有效控制。又因飼料中也檢測到該菌，及時(shí)優(yōu)化飼料配方，飼料入場前進(jìn)行細(xì)菌檢測，合格后用于飼喂。同時(shí)加強(qiáng)場區(qū)內(nèi)糞便的及時(shí)處理、消毒，提高飼養(yǎng)管理水平，種鴨現(xiàn)處于正常狀態(tài)。

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（2021–01–15）

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1007-1733（2021）05-0029-02