韋杰合，韋仁杰，周業(yè)修

骨肉瘤是一種原發(fā)性骨惡性腫瘤，主要發(fā)生于兒童和青少年，占骨腫瘤的60%。近十年來骨肉瘤的治療策略有了很大的進展，包括手術切除、化療或放療，但骨肉瘤病人由于轉移和復發(fā)程度高，療效仍不理想。

MicroRNA（miRNA）是一類非編碼RNA，具有抑制靶基因表達的潛力，并在增殖、分化、轉移等一系列細胞生物學過程中發(fā)揮關鍵作用。各種研究表明，miRNA 的失調是骨肉瘤發(fā)生的主要因素之一。Wang 等發(fā)現微小RNA-193a（miR-193a）參與了骨肉瘤細胞的耐藥性，增加miR-193a的表達可以促進化療敏感性。Liu等證明微小RNA-377（miR-377）可能在骨肉瘤中作為抑癌miRNA發(fā)揮作用，誘導骨肉瘤細胞凋亡。此外，Wang 等發(fā)現，微小RNA-628-5p（miR-628-5p）通過降低干擾素誘導蛋白44 樣蛋白（IFI44L）的表達來增加骨肉瘤細胞的增殖和轉移。然而，miRNA在骨肉瘤進展中的作用尚不清楚。因此，明確miRNAs 的作用及相關分子機制有助于識別骨肉瘤診斷的新型生物標志物，并找到治療的潛在靶點顯得至關重要。

2016 年1 月至2019 年1 月，本研究分析了微小RNA-218-5p（miR-218-5p）在骨肉瘤中的生物學功能及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

Matrigel基質膠購自美國BD公司，胎牛血清購于美國Gibco公司，RT試劑盒、PCR相關SYBRP、逆轉錄試劑盒均購自于日本Takara 生物技術有限公司。兔抗人Wnt家族成員2B（WNT2B）單克隆抗體和鼠抗人三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司，實時熒光定量PCR（RT-q PCR）相關的miR-218-5p 和GAPDH上游、下游引物設計及合成均由武漢天一輝遠生物技術有限公司完成。

1.2 骨肉瘤組織倫理

骨肉瘤組織26 例，鄰近正常成骨細胞組織21 例均選取于2016 年1 月至2019年1 月于河池市人民醫(yī)院住院手術治療，標本均保存于液氮罐中，全部標本均經組織學鑒定。實驗標本的獲取均獲得病人本人或其近親屬同意，本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.3 細胞培養(yǎng)

4 個骨肉瘤細胞系（U2OS、SAOS2、MG63和143B）和正常成骨細胞（hFOB）購自中國科學院細胞庫（上海）。細胞培養(yǎng)均采用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基。在5.0%二氧化碳、37 ℃的條件下培養(yǎng)，每48 小時換液一次，細胞密度達到80%～90%后進行傳代。狀態(tài)良好的細胞用于進一步實驗。

1.4 轉染

miR-218-5p mimics（轉染miR-218-5p 模擬物），mimics NC（轉染miR-218-5p模擬物陰性對照miR-NC）質粒由上海GenePharma（China）合成。對數期143B 細胞經消化后復蘇，培養(yǎng)至6 孔板，細胞密度為1×10個∕孔。培養(yǎng)18～24 h后，細胞融合率達到80%～90%，加入不含血清和抗生素的培養(yǎng)基。細胞轉染采用Lipofectamine 2000（Life Technologies），連續(xù)孵育48 h。

1.5 實時熒光定量PCR

組織或細胞加入1 mL Trizol，裂解10 min。先后加入氯仿、異丙醇，12 000 rpm 離心15 min 后，棄去上清。沉淀經70%乙醇洗滌后，加入30 mL 無酶水，測量RNA 濃度。根據Takara 逆轉錄試劑盒說明，進行逆轉錄。采用二步法PCR 擴增程序上機操作，實驗結果以GAPDH 為內參，采用法進行分析。miR-218-5：正向引物TTGCGGATGGTTCCGTCAAGCA；反向引物GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT。GAPDH：正向引物ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG；反向引物 GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。

1.6 CCK8

骨肉瘤細胞以每孔1 000個鋪入96孔板中，每組設置5 個復孔。分別于6、24、48、72 h 加入10 μL CCK8 檢測試劑液。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在酶標儀450 nm 處檢測各孔的吸光度（OD）值，根據OD值描繪生存曲線。實驗重復3次。

1.7 小室實驗

1×10個不同處理組的骨肉瘤細胞用無血清培養(yǎng)基稀釋成200 μL，接種于鋪有magtrigel 的上室中。下室加入10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基700 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用多聚甲醛固定細胞30 min，結晶紫染色30 min。PBS 洗凈結晶紫染色后，顯微鏡下選取6個視野拍照并記數。

1.8 劃痕

取對數生長期各組的骨肉瘤細胞，接種于6 孔板繼續(xù)培養(yǎng)細胞生長至90%以上。200 μL tip槍頭進行劃痕，用PBS洗后換無血清培養(yǎng)基。于細胞劃痕后0 h及48 h這2個時間點分別拍照，對比兩時間點細胞遷移的距離。

1.9 雙熒光素酶報告基因測定

為了驗證miR-218-5p 是否與WNT2B 結合并調控其表達，進行了雙熒光素酶報告基因實驗。WNT2B 的野生型（Wt）和突變型（Mut）3’-UTR 被合成并亞克隆到psiCHECK-2熒光素酶報告載體（美國Promega Corporation），這兩種突變體包含了miR-218-5p 的可能結合位點。培養(yǎng)24 h 后，143B 細胞與Wt∕Mut 型WNT2B 熒光素酶報告載體和miR-218-5p模擬物共轉染及陰性對照。最后，使用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)（美國Promega）測定熒光素酶活性。Lipo2000（美國Invitrogen）用于瞬時轉染的全過程。

1.10 蛋白印記檢測

蛋白裂解液經牛血清白蛋白（BSA）定量后制樣。樣品經電泳、轉膜至PVDF 膜后，用含5%的脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗（鼠抗人WNT2B 單克隆抗體和鼠抗人GAPDH 單克隆抗體）4 ℃過夜。TBST 洗滌3 次后，再加羊抗鼠IgG后室溫孵育2 h，曝光。以目的條帶與內參GAPDH的灰度值的比值為目的蛋白的表達量。

2 結果

2.1 miR-218-5p 在骨肉瘤臨床樣本及細胞系中的表達

實時熒光定量PCR 實驗檢測miR-218-5p 在26例骨肉瘤組織與21例正常骨組織中的表達，結果顯示miR-218-5p 在骨肉瘤組織低表達（t＝33.15，P＜0.001）。與正常的成骨細胞hFOB 相比，U2OS、SAOS2、MG63 和143B 在這4 株骨肉瘤細胞中miR-218-5p的表達水平分別為（0.712±0.015）%、（0.685±0.016）%、（0.542±0.021）%、（0.524±0.011）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。骨肉瘤細胞143B 中miR-218-5p 表達水平最低，因此，選取143B 細胞進行后續(xù)實驗研究。

2.2 miR-218-5 在體外抑制骨肉瘤細胞增殖

CCK-8實驗測定miR-218-5p對骨肉瘤細胞增殖的影響，分別于6、24、48、72 h 時間點下測得吸光度值繪制細胞生長曲線。miR-NC 組細胞培養(yǎng)6、24、48、72 h后的OD值分別為t（0.271±0.01），t（0.604±0.03），t（1.228±0.12），t（1.825±0.17），miR-218-5p 組細胞培養(yǎng)6、24、48、72 h 后的OD 值分別為t（0.274±0.011），t（0.514±0.04），t（0.828±0.16），t（1.212±0.013），結果表明，過表達miR-1218-5p 抑制了骨肉瘤細胞143B的增殖（P＜0.05）。

2.3 miR-218-5p 抑制骨肉瘤細胞143B 的遷移能力

細胞劃痕實驗檢測miR-218-5p 對肉瘤細胞143B 的遷移能力的影響，骨肉瘤細胞143B 轉染miR-218-5p 過表達質粒后，與對照組相比，過表達miR-1218-5p骨肉瘤細胞143B的遷移距離明顯變短（t＝5.516，P＝0.005），差異有統(tǒng)計學意義，見圖1。

2.4 miR-1218-5p 抑制骨肉瘤細胞143B 細胞的侵襲能力

侵襲實驗顯示：NC mimic 組（376±14）個，過表達miR-1218-5p 后（164±12）個。與對照組相比，過表達miR-1218-5p 的骨肉瘤細胞143B 侵襲數目明顯減少（t＝6.702，P＝0.001），差異有統(tǒng)計學意義，見圖2。

2.5 WNT2B 直接調控miR-218-5p

首先，使用Targetscan 在線工具，發(fā) 現WNT2B 在49-56 的AAGCACAA 能與miR-218-5p 的3’UTR 端的UUCGUGU核酸序列互補，WNT2B被預測為miR-218-5p的下游。進一步熒光素酶報告基因測定法驗證這一假設。熒光素酶報告基因測定結果表明，在143B細胞中共轉染miR-218-5p模擬物可以抑制包含WT WNT2B 3′-UTR 序列的報告基因的熒光素酶活性（t＝21.174，P＜0.001）；但是，未能抑制含有MUT WNT2B 3′-UTR的細胞（t＝0.621，P＝0.542）。

2.6 miR-218-5p 抑制WNT2B 蛋白的表達水平

蛋白質印跡法對預測結果進行驗證，檢測結果顯示，過表達miR-218-5p 細胞中WNT2B 蛋白的表達水平較對照組明顯下調（t＝18.04，P＜0.001），結果表明WNT2B 可能為miR-218-5p 的靶基因，提示，miR-218-5p可能通過抑制WNT2B的表達，影響骨肉瘤細胞143B的增殖、遷移和侵襲。見圖3。

圖1 miRNA-218-5p mimic處理后對骨肉瘤細胞143B遷移的影響（×40）

圖2 miRNA-218-5p mimic處理后對骨肉瘤細胞143B侵襲的影響（結晶紫染色×100）

圖3 miRNA-218-5p mimic處理后對骨肉瘤細胞143B中WNT2B表達水平的影響

3 討論

miRNA長度為20～25個核苷酸，為一類內源性的非編碼單鏈RNA，在真核細胞生物中廣泛存在。越來越多的研究表明，miRNA 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程有著密切的關系。其中miR-218-5p 在多種腫瘤組織中均發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用，包括肺腺癌、非小細胞肺癌、肝癌、膽囊癌和乳腺癌。Li等研究表明，miR-218-5p直接靶向脂肪瘤高遷移率融合蛋白樣蛋白3（LHFPL3），抑制膠質母細胞瘤的增殖和轉移。Deng 等研究表明，miR-218-5p 在胃癌中表達顯著降低，且與胃癌病人的淋巴結轉移和預后不良有關。此外，Li等證明，抑制miR-218-5p 可以增加口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖和侵襲性。而在本研究中，我們發(fā)現miR-145-5p 在骨肉瘤組織和細胞系中低表達。增加miR-218-5p 的表達，骨肉瘤細胞的增殖受到抑制，骨肉瘤細胞143B 的遷移和侵襲能力也明顯降低。這是miR-218-5p 作為骨肉瘤腫瘤抑制miRNA的第一個證據。

WNT2B，也叫WNT13，是已克隆的第13個WNT基因。Deng 等研究表明，WNT2B 可以激活WNT信號通路，細胞核中的β-連環(huán)蛋白（β-catenin）表達增加從而促進腫瘤的增殖和轉移。Wang 等研究發(fā)現，miR-577通過調控WNT2B介導的非小細胞肺癌Wnt∕β-catenin 通路，抑制細胞增殖和上皮間質轉化。Li等研究表明，WNT2B在口腔癌的發(fā)生和化療耐藥中發(fā)揮作用，為HNSCC病人的治療提供了潛在的治療靶點。在人胰腺癌組織中，Jiang等發(fā)現Wnt2B 的表達均顯著高于正常胰腺組織，與神經浸潤有顯著相關性。而在本研究中，我們發(fā)現WNT2B直接與miR-218-5p 結合。miR-218-5p 表達的增加抑制骨肉瘤細胞143B 中WNT2B 的蛋白表達水平。miR-218-5p 在骨肉瘤中的異常表達可能預示病人的不良預后、發(fā)生和發(fā)展具有密切的關系。

綜上所述，本研究首次證實miR-218-5p可能在骨肉瘤中作為腫瘤抑制miRNA。結果顯示，miR-218-5p通過靶向WNT2B抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲。miR-218-5p 和WNT2B 可能是診斷骨肉瘤的新的生物標志物，也是治療骨肉瘤的有效靶點。