郝王森，李任任，於麗華，王宇光，耿 貴*

(1.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院,哈爾濱150080；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱150080)

0 引言

甜菜(BetavulgarisL.)是藜科甜菜屬的二年生草本植物，具有喜冷涼濕潤，耐低溫、耐鹽堿等特點(diǎn)，是我國乃至世界上重要的糖料作物之一，供應(yīng)世界上約1/3的糖[1]。內(nèi)蒙古、新疆、黑龍江是我國甜菜的主要產(chǎn)區(qū)，近些年這些地區(qū)的極端低溫天氣對(duì)甜菜的產(chǎn)品質(zhì)量造成較大的傷害[2]，研究發(fā)現(xiàn)，施加外源物質(zhì)能夠提高低溫條件下植物的的抗寒性，如γ-氨基丁酸(GABA)[3]、24-表油菜素內(nèi)酯(EBR)[4]、脫落酸(ABA)[5]、水楊酸[6]、氯化鈣[7]、K+[8]等。

磷酸二氫銨，又叫作磷酸一銨，簡稱一銨，其作為一種復(fù)合肥料，含有作物生長所必須的氮、磷等營養(yǎng)元素[9]，研究發(fā)現(xiàn)，磷酸一銨中所含的磷元素具有較好的移動(dòng)性，揮發(fā)性，在土壤中能夠利于植物的吸收[10]。適量施用磷酸一銨不僅能夠促進(jìn)作物的生長，還能提高作物對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力，增強(qiáng)植物的抗逆性。如杜旭[11]等研究了4種不同的磷肥處理對(duì)尾巨桉DH3229的生長及抗性指標(biāo)影響，發(fā)現(xiàn)磷酸一銨處理不僅能夠促進(jìn)尾巨桉DH3229苗木生長、提高苗木質(zhì)量，還能夠增加SOD、POD、多酚氧化酶(PPO)等多種抗氧化酶含量。陳兵兵等[12]發(fā)現(xiàn)氮肥含量一定時(shí)，施加磷肥，能夠提高低溫處理?xiàng)l件下苗期玉米的干物重，并且能夠減弱低溫對(duì)細(xì)胞膜造成的傷害。

目前針對(duì)磷酸二氫銨的研究主要用作植物肥料、動(dòng)物飼料添加劑、木材、織物的防火劑等[13～14].而將其作為種肥，用于緩解植物低溫脅迫方面的報(bào)道還較少。因此，本文通過研究磷酸二氫銨種肥不同用量對(duì)甜菜子葉期幼苗的凍害緩解效果，嘗試將復(fù)合肥料作為一種抗寒外源調(diào)節(jié)劑，用于提高作物抗寒性、減輕作物低溫寒害。對(duì)進(jìn)一步提高甜菜產(chǎn)量，增加經(jīng)濟(jì)效益具有重要的實(shí)際意義，同時(shí)提供了一種新的作物防寒思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試甜菜品種為 KWS1176。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)于2020年7月在黑龍江大學(xué)甜菜研究所光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行。光照常溫處理使用HPG-280HX人工氣候箱，低溫處理使用LRH-250CL低溫培養(yǎng)箱。

試驗(yàn)共設(shè)置4種處理，每組8次重復(fù)。分別為T0:不加一銨；T1:施加0.25 g一銨；T2:施加0.5 g一銨；T3:施加1 g一銨。播種：每盆統(tǒng)一先放200 g土壤，土壤上層分別加入相應(yīng)重量的一銨，用200 g的土壤覆蓋一銨，再均勻放入20粒帶包衣的種子，最后用100 g土覆蓋。放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，光照14 h/d，黑暗10 h/d，溫度為8～20℃，從零點(diǎn)20℃開始，以2℃/h為標(biāo)準(zhǔn)先降低至8℃后升高回20℃，培養(yǎng)期間定時(shí)澆水，保持土壤相對(duì)含水量在70%左右，定時(shí)倒盆，保證每盆所受光照一致。

播種7 d后開始記錄各個(gè)處理的發(fā)芽率，待幼苗第一對(duì)真葉露尖時(shí)，保留每盆中長勢(shì)一致的甜菜幼苗進(jìn)行低溫處理，低溫處理分成鍛煉期和冷凍期兩個(gè)時(shí)期。鍛煉期和冷凍期培養(yǎng)箱設(shè)置情況見表1。低溫處理后在溫度為8～20℃光照培養(yǎng)箱里 恢復(fù)3 d，統(tǒng)計(jì)甜菜幼苗低溫凍害死亡率。

表1 低溫培養(yǎng)箱溫度設(shè)置情況

1.3 干鮮重的測(cè)定

從各處理每盆中完整取5株幼苗，清理干凈表面土壤，測(cè)定其鮮重，計(jì)算獲得單株鮮重。將已知鮮重的甜菜幼苗放入105℃烘箱中殺青30 min，再以80℃烘至恒重，用萬分之一分析天平稱量5株幼苗干重，計(jì)算獲得單株干重。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 生理指標(biāo)的測(cè)定

葉片的相對(duì)電導(dǎo)率(REC)參考Xia等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。將處理后的甜菜幼苗用去離子水沖洗干凈，剪成小份，混合均勻，稱取2 g放入20 mL刻度試管中，加入20 mL去離子水，真空抽氣30 min，搖勻后用 DDS-307電導(dǎo)率儀測(cè)定初始電導(dǎo)率R1。再將試管封口沸水浴1 h，冷卻后搖勻，測(cè)定最終電導(dǎo)率R2。相對(duì)電導(dǎo)率=R1/R2×100%。參考李合生等[16]的方法進(jìn)行以下生理指標(biāo)的測(cè)定。MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定; 抗氧化酶活性測(cè)定：SOD活性采用抑制NBT光還原比色法測(cè)定; POD 活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定; APX活性采用紫外線吸收法測(cè)定。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)測(cè)定：可溶性蛋白含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法; 脯氨酸含量測(cè)定采用酸性茚三酮法。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Office2019和SPSS 20. 0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。用單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)不同處理的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)(顯著性水平為P≤0.05)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同水平磷酸二氫銨對(duì)甜菜幼苗生長以及出苗率、低溫死亡率的影響

圖1表明，低溫處理前(圖A)，各處理間的子葉期甜菜幼苗長勢(shì)基本沒有差異；但低溫處理后(圖B)與低溫處理恢復(fù)24 h后(圖C)，與施加磷酸二氫銨的T1～T3組相比未施加的T0組死亡率最高，隨著磷酸二氫銨用量的逐漸增加，幼苗死亡率逐漸降低，說明隨著磷酸二氫銨用量提高，促進(jìn)子葉期甜菜幼苗的抗寒能力。

圖1 不同水平磷酸二氫銨對(duì)甜菜幼苗生長影響表型圖(A)低溫處理前 (B)低溫處理后(C)低溫處理恢復(fù)24 h后Fig.1 Phenotypic diagram of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on growth of beet seedlings (A) before low temperature treatment (B) after low temperature treatment (C) 24 h after low temperature treatment

表2 不同水平磷酸二氫銨對(duì)甜菜種子發(fā)芽率和死亡率的影響Tab.2 Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on germination rate and frostbite rate of sugar beet seeds

由表2可知，不同水平磷酸二氫銨種肥用量對(duì)子葉期甜菜幼苗的出苗率影響不大，各個(gè)處理之間差異不顯著(P>0.05，下同)，但是經(jīng)受凍害之后，各處理之間的幼苗死亡率卻有顯著差異(P≤0.05，下同)，T0處理的幼苗死亡率達(dá)到81.67%，比T1～T3組分別高出18.37%、46.94%、71.43%，T3組幼苗死亡率最低，凍害緩解效果最好。

2.2 不同水平磷酸二氫銨對(duì)凍害處理后甜菜幼苗干鮮重的影響

低溫處理后，施加磷酸二氫銨處理后每株甜菜幼苗干鮮重與不施相比有所增加，其中，T3組增加最為明顯，鮮重比T0～T2組分別增加了52.38%、48.21%、40.48%；干重分別比T0～T2組分別增加了50.44%、50.86%、34.18%，但T0與T1之間差異不顯著。

圖2 (A-B)低溫條件下，不同水平磷酸二氫銨對(duì)甜菜幼苗干鮮重的影響Fig.2 (A-B) Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on dry and fresh weight of beet seedlings at low temperature

2.3 不同水平磷酸二氫銨對(duì)凍害處理后甜菜幼苗葉片質(zhì)膜透性的影響

磷酸二氫銨對(duì)凍害處理后甜菜幼苗質(zhì)膜透性有較大影響(如圖3(A-B))。結(jié)果表明，MDA含量在T0中表現(xiàn)為最高，比T1～T3組分別高出19.61%、35.00%、55.14%；隨著磷酸二氫銨施用水平的增加，各組的相對(duì)電導(dǎo)率逐漸降低，與MDA含量呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。

圖3 (A-B)低溫條件下，不同水平磷酸二氫銨對(duì)甜菜幼苗MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.3 (A-B) Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on MDA content and relative conductivity of beet seedlings at low temperature

2.4 不同比例磷酸二氫銨對(duì)凍害處理后甜菜幼苗葉片抗氧化酶的影響

磷酸二氫銨對(duì)凍害處理后甜菜幼苗葉片抗氧化酶有較大影響(如圖4(A-C))?？梢钥闯?，T3處理?xiàng)l件下，SOD、POD和APX酶的活性最低，而T0處理的幾種酶的活性均為最高，T0組SOD、POD和APX活性分別比T3組高出25.83%、37.04%和33.33%。各處理的幾種抗氧化酶含量均具有顯著性差異。

2.5 不同水平磷酸二氫銨對(duì)凍害處理后甜菜幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

磷酸二氫銨對(duì)凍害處理后甜菜幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)有較大影響(如圖5(A-C))。結(jié)果表明，各個(gè)處理之間的的脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量均有顯著性差異，隨著磷酸二氫銨水平的增加，各處理的脯氨酸和可溶性糖含量逐漸降低，在T0組中脯氨酸和可溶性糖含量最高，脯氨酸含量比T1～T3組分別高出23.97%、33.31%、50.54%，可溶性糖含量分別比T1～T3組高出13.25%、20.02%、29.71%。但T0組可溶性蛋白含量最低，隨著磷酸二氫銨水平的增加，各處理的可溶性蛋白含量也呈逐漸增加，與脯氨酸和可溶性糖呈現(xiàn)的趨勢(shì)相反。

圖4 (A-C)低溫條件下，不同水平磷酸二氫銨對(duì)甜菜幼苗抗氧化酶的影響Fig.4 (A-C) Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphateon antioxidant enzymes in beet seedlings at low temperature

圖5 (A-C)低溫條件下，不同水平磷酸二氫銨對(duì)甜菜幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響Fig.5 (A-C) Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on osmotic regulation substances in beet seedlings at low temperature

3 討論

溫度是影響植物生長發(fā)育的重要生態(tài)因子之一，低溫時(shí)間過長或者溫度過低都會(huì)引起植物的生理功能障礙，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育[17]。低溫冷害同時(shí)會(huì)造成苗弱，植株生長黃化、萎蔫、遲緩、產(chǎn)量降低、品質(zhì)降低的現(xiàn)象[18]。低溫脅迫是限制植物生長的重要環(huán)境因素[19]。在本試驗(yàn)中，施加不同量磷酸二氫銨種肥，甜菜子葉期幼苗的凍死率以及干鮮重均有所不同?？梢钥闯觯词┝姿岫滗@種肥幼苗受凍害最為嚴(yán)重，死亡率達(dá)到82.00%，而隨著磷酸二氫銨種肥用量的增加，子葉期甜菜幼苗的凍死率顯著下降；幼苗干鮮重有不同程度的增加，說明施加磷酸二氫銨能夠減緩低溫對(duì)子葉期幼苗的生長抑制，不同程度的促進(jìn)幼苗的生長，這與杜旭[11]等的研究結(jié)果一致。

細(xì)胞膜是能夠支持多種生理生化反應(yīng)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，研究表明質(zhì)膜是植物凍害的主要部位，對(duì)細(xì)胞膜的損傷可以通過低溫度環(huán)境下的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量來進(jìn)行評(píng)估[20]。在本試驗(yàn)中，隨著磷酸二氫銨比例的增加，T1～T3各處理組的相對(duì)電導(dǎo)率水平和MDA含量都呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，說明施加磷酸二氫銨能夠保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化和胞內(nèi)溶質(zhì)的外滲，而且隨著磷酸二氫銨用量的增加，其對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)作用也在逐漸增加。

抗氧化酶是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，用于清除植物體內(nèi)的活性氧，提高植物的抗逆性，維持植物正常的生長發(fā)育[21]。陳兵兵等指出,在低溫條件下隨著施用磷肥的增加，使得超氧化物歧化酶(SOD)的活性逐漸增強(qiáng)，可以減少細(xì)胞膜透性，增加干物重[12]。杜旭等指出，磷肥對(duì)桉樹進(jìn)行處理后，苗木葉片的可溶性糖、蛋白含量顯著提高，丙二醛(MDA) 含量及多種抗氧化酶活性顯著降低。磷肥處理均有利于促進(jìn)桉樹苗木的生長[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍條件下隨著磷酸二氫銨的不斷增多，SOD、POD和APX活性呈顯著下降趨勢(shì)，這與前人的研究結(jié)果一致。說明磷酸二氫銨的施用一定程度上能夠提高了甜菜的抗寒能力。

滲透調(diào)節(jié)是指植物在適應(yīng)環(huán)境變化過程中重要的調(diào)節(jié)機(jī)制，當(dāng)植物受到低溫脅迫時(shí)，會(huì)有大量的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)劑積累，如可溶性糖、甜菜堿、脯氨酸、蔗糖、游離氨基酸、可溶性蛋白，主要作用是降低滲透勢(shì)，增強(qiáng)細(xì)胞的吸水能力，從而適應(yīng)低溫脅迫的過程[22]。植物在低溫脅迫條件下會(huì)通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來降低自身水勢(shì)，提高葉片保水能力。本研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍條件下隨著磷酸二氫銨量的增加，脯氨酸，可溶性糖呈下降趨勢(shì)。低溫條件下，T0中可溶性蛋白含量較低，施加磷酸二氫銨可增加甜菜子葉期幼苗中的可溶性蛋白含量。

4 結(jié)論

低溫條件下，施加磷酸二氫銨種肥能夠提高子葉期甜菜幼苗的抗寒性，隨著磷酸二氫銨用量的增加，幼苗抗凍害能力不斷增強(qiáng)。磷酸二氫銨作為一種復(fù)合肥料，一定條件下，也可以作為抗寒劑作用于作物，減少低溫對(duì)作物造成的損失。