熊小毛，彭 俊，繆禮鴻，趙永威，劉蒲臨

（1.湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司,湖北松滋 434200；2.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢 430023）

自然發(fā)酵是一項歷史悠久的利用微生物生產食品的技術。通過自然發(fā)酵獲得的產品通常表現(xiàn)出獨特的風味、質地或營養(yǎng)特性等特征[1]。許多知名品牌的中國白酒均采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵工藝，沒有特意添加已知的微生物到發(fā)酵過程中去[2]。白云邊濃醬兼香型白酒是我國的主要白酒類型之一，它的發(fā)酵生產可分為3 個重要階段，包括制曲、堆積發(fā)酵和入池發(fā)酵[3]。制曲過程中的微生物構成是造就不同白酒風格的關鍵成因之一[4]。大曲制作是在開放的環(huán)境下，在制曲過程中會接種少量母曲，而其他微生物則與原產地的環(huán)境密切相關[5]。隨著研究技術水平的提高，人們當前更為深入的認識了大曲和發(fā)酵過程中微生物種群結構和多樣性變化，并進一步探索了微生物之間的相互作用及風味物質產生機理[6]。在此基礎上，分離和篩選原產地的功能菌種以強化酒曲性能逐漸引起重視。王耀等[7]試驗將篩選的有益功能菌先制成種曲，然后以1%接種量接種到生料中制作強化曲，在該工藝下所生產出強化曲的各項指標均優(yōu)于或達到傳統(tǒng)大曲標準。唐玉明等[8]在不同酒曲樣品中篩選出1 株發(fā)酵功能菌和1株產香功能菌以及2株糖化菌，將其復合，添加到制曲中，強化曲的微生物數(shù)量和酶活力顯著增加，酯化力增加55.49%，應用到生產中出酒率提高10.89%，總酸、總酯分別提高23.8%和5.9%。

東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）是一種對白云邊酒發(fā)酵有較大貢獻的酵母，其在酒醅中數(shù)量較多，同時也可以在原產地周邊的土壤等環(huán)境中篩選獲得[9]。前期研究表明，白云邊酒醅來源的東方伊薩酵母除具有較強的產乙醇能力外，還具有耐熱、耐酸性好，產酸、產酯能力強等的特點，對濃醬兼香型白酒酒體的形成具有重要作用[10-11]。在此基礎上，我們以從白云邊酒醅中選育的1 株出酒率高、正丙醇含量較低的I.orientalisP43 功能菌種為基礎，制作固態(tài)功能菌劑，追蹤檢測不同固態(tài)菌劑儲藏方法對I.orientalisP43 存活率的影響；并使用該固態(tài)菌劑制作強化曲應用于白云邊原酒的實驗性生產。結果表明使用強化曲所生產原酒正丙醇含量顯著降低，出酒率也有明顯提升。本研究為復合功能強化曲的制備方法和應用提供了參考依據(jù)，為改善濃醬兼香型白酒的發(fā)酵技術和提高原酒的品質奠定了技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

I.orientalisP43 從白云邊酒醅中分離，真空冷凍干燥保藏[9]。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD 培養(yǎng)基[12]：葡萄糖20 g、酵母膏10 g、蛋白胨20 g、蒸餾水1000 mL；115 ℃，25 min滅菌。

馬丁孟加拉紅培養(yǎng)基[12]：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、孟加拉紅33.4 mg、鏈霉素溶液30 μg/mL、蒸餾水1000 mL，121 ℃，20 min滅菌。

牛肉膏培養(yǎng)基[12]：NaCl 5 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、蒸餾水1000 mL；調節(jié)培養(yǎng)基pH7.2～7.4，121 ℃，25 min滅菌（固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉）。

1.1.3 固態(tài)菌劑制備原料

小麥：由湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司提供。小麥中酵母活菌數(shù)少于10 cfu/g，細菌活菌數(shù)少于105cfu/g。

玉米淀粉：市購的食品級面粉，真菌活菌數(shù)少于10 cfu/g，細菌活菌數(shù)少于103cfu/g。

1.2 實驗方法

1.2.1 淀粉吸附東方伊薩酵母菌劑制備及菌體死亡率測定

挑取東方伊薩酵母單菌落接種于YPD 液體培養(yǎng)基，30 ℃，170 r/min，搖床培養(yǎng)24 h。按2%接種量再次轉接到500 mL 的液體YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃，170 r/min 培養(yǎng)12 h，使用血球計數(shù)板對酵母菌數(shù)量進行測定。取擴培12 h 后的菌液100 mL，分別與200 g、250 g、300 g、350 g 面粉，混合均勻。真空包裝后將不同比例混合的菌劑分成兩份，一份放置在4 ℃冰箱存放，一份放置在25 ℃培養(yǎng)箱中存放。每隔1周，取樣測定活菌數(shù)。

1.2.2 功能強化曲塊的制備

小麥經適當粉碎后，取上述制備好的菌劑按1×107cfu/g(干基)接種，菌粉加水混勻（水分控制在42%）后倒入粉碎的小麥中，攪拌均勻后，采用4 種不同的制曲方式制備實驗曲塊（表1），將做好的曲塊放置在大塑料盒中室內常溫發(fā)酵（塑料盒表面用雙層紗布覆蓋，保持一定通風）。

表1 強化曲的制備方案

表2 不同比例淀粉吸附后菌劑的含水量與酵母死亡率

1.2.3 生產實驗

白云邊酒業(yè)股份有限公司每年9 月開始第一輪次生產。高粱經燜糧、蒸糧、攤晾后加入曲粉，將加曲后的醅料堆積發(fā)酵，頂溫達到工藝要求后，將堆積料轉移進窖池，封窖后發(fā)酵一個月。10月開始第二輪次操作，將已經發(fā)酵一個月的窖池打開，取出酒醅并配上新鮮高粱和清蒸后的稻殼混蒸，混蒸結束后，重復上一輪的操作流程。此二輪操作餾出液酒精含量很低且量少，直接將餾出液回潑到入池酒醅中。11月開始第三輪次操作，將已經發(fā)酵一個月的窖池打開，取出酒醅配入清蒸稻殼進行蒸餾取酒，即為三輪一次酒[12]。此次生產實驗針對三輪一次原酒正丙醇含量偏高的現(xiàn)象，使用以小麥為原料制備強化曲，替代25%的高溫大曲，以改善原酒的品質和乙醇產率。

1.2.4 生產實驗中酒醅的理化分析及酵母菌測定

將10 g 酒醅與90 mL 蒸餾水混合，0 ℃超聲處理30 min，4 ℃離心10 min 后，用上清液測定還原糖含量和酸度[13-14]。通過計算樣品在105 ℃下干燥24 h 后的失水重量來測量酒醅的水分含量。采樣點溫度在采樣時使用溫度計測量。使用Wu 等[13]描述的方法分析淀粉含量。酒醅中的乙醇含量蒸餾后使用氣相色譜（配備有DB-Wax 柱的Agilent 7820A GC 系統(tǒng)）來進行測定[15]。酒醅中酵母菌的測定使用稀釋涂平板法。

2 結果與分析

2.1 淀粉吸附菌劑活菌計數(shù)與死亡率測定

菌劑制備所使用種子液的活菌數(shù)為1.5×108cfu/mL，菌體被不同比例的淀粉吸附后，酵母的死亡率不同（表2）。菌液和淀粉按1∶2 混合，死亡率最低，為34.0 %；菌液和淀粉按1∶3.5 混合，死亡率最高，為65.8%；菌液和淀粉按1∶2.5 和1:3 混合，死亡率較接近（40.5 %和42.3 %），均高于1∶2 混合的死亡率。

2.2 不同儲存條件對吸附菌劑死亡率的影響

4 ℃保存固態(tài)菌劑1 周后活菌數(shù)死亡率最高，1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5 吸附后的死亡率分別是43.3%、31.3%、22.3%和14.9%；從第1～5 周菌劑的活菌數(shù)死亡率在減緩；第5～10 周，菌劑的活菌數(shù)死亡率基本穩(wěn)定，活菌數(shù)變化不大，其中按1∶3.5混粉的死亡率變化最小（圖1a）。25 ℃保存菌劑同樣在第一周活菌數(shù)降低顯著；1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5吸附后的死亡率分別是54.5 %、51.7 %、48.8 %和32.4 %；從第1～5 周菌劑的活菌數(shù)死亡率趨于緩和。其中按1∶3.5 混合吸附的死亡率變化最大，活菌數(shù)從114×105cfu/g下降到4×105cfu/g（圖1b）。比較兩種溫度條件可以看出，在整個儲存期內（1～10周）25 ℃保存菌劑的死亡率明顯高于4 ℃保存的菌劑，且淀粉比例越高活菌數(shù)越少。

2.3 功能強化曲塊的活菌計數(shù)

使用表1 中4 種方案所制成曲塊的微生物數(shù)量統(tǒng)計如表3 所示。方案一小麥接種后壓成曲塊，常溫發(fā)酵6 d 后酵母活菌數(shù)為8×108cfu/g，細菌活菌數(shù)為3.6×109cfu/g，與方案二對比：散料發(fā)酵24 h 后再壓成曲塊對酵母增殖和抑制細菌生長都沒有明顯的效果。方案三小麥粉加水加酸調制pH4.0 后接種壓成曲塊，常溫發(fā)酵6 d 后酵母活菌數(shù)為6×108cfu/g，細菌活菌數(shù)為3×108cfu/g，與方案一對比,加酸后的曲塊發(fā)酵6 d 后細菌數(shù)量級由109下降到108。方案四與方案二相比，加酸后發(fā)酵的曲塊的細菌數(shù)降低了1 倍，表明強化曲制備過程中加入有機酸會使酵母菌數(shù)量有輕微的減少，但對細菌有明顯的抑制效果。所壓制曲塊于室溫下放置30 d 后，4 種方案制作曲塊活菌死亡率都極高，且活菌數(shù)差異不顯著。

表3 不同方案制曲后的微生物計數(shù)

圖1 固體菌劑4 ℃和25 ℃條件下活菌數(shù)隨時間變化

2.4 強化曲生產發(fā)酵實驗中酒醅理化指標分析

以12.8 kg 強化曲添加到白云邊二輪入池操作中，替代150 kg 傳統(tǒng)大曲參與發(fā)酵。實驗組和空白組堆積溫度變化較為接近，堆積48 h 溫度緩慢上升至30 ℃左右，48 h 后迅速升溫，96 h 左右基本達到入池要求溫度55 ℃左右，溫度變化在生產工藝范圍內。出入池酒醅的理化指標和酵母菌數(shù)量如表4和表5 所示。實驗組堆積發(fā)酵后分入兩個窖池，入池酒醅的水分較對照組要高，酸度、還原糖和酵母數(shù)量與對照組無較大差異，均在工藝范圍內。

2.5 原酒中乙酸乙酯、乙醇和正丙醇的含量分析

三輪一次原酒的3 個對照組和2 個實驗組乙酸乙酯、乙醇和正丙醇的含量分析結果如表6 所示。不同組中，乙醇、乙酸乙酯和正丙醇的含量都有較大的差異，乙酸乙酯含量最高為7457 mg/L，最低為3768 mg/L，相差約2 倍，乙醇含量最高為40 %vol，最低為31%vol，正丙醇最高含量17713 mg/L，最低為14590 mg/L。可見傳統(tǒng)白酒三輪一次酒的酒質差異較大，且正丙醇含量較高。兩個實驗組窖池原酒乙醇的平均含量為43 %vol，正丙醇平均含量為11812 mg/L，乙酸乙酯的平均值為5314 mg/L。正丙醇相對于對照組平均含量降低了27.4%，乙醇含量提高了22.9%。

表5 三輪出池酒醅理化指標與酵母菌計數(shù)結果

表6 三輪一次原酒乙酸乙酯、乙醇和正丙醇檢測結果

3 討論

酵母是迄今為止最有效的產乙醇微生物，并且是發(fā)酵食品和酒精飲料中最為常用的微生物種類。除Saccharomyces cerevisiae外，雖然大多數(shù)酵母乙醇發(fā)酵能力和發(fā)酵效率較低，但它們產生的揮發(fā)性物質對白酒風味的形成產生積極作用[16-17]。I.orientalis是濃醬兼香型白酒中的優(yōu)勢菌株，將其制備成可保存的固態(tài)菌劑可以使運輸、保存、投放等環(huán)節(jié)變得更加方便。本研究采用淀粉吸附的方法制備固體菌劑。不同比例淀粉的使用和保存溫度不同均顯著影響菌體的存活率。當菌液與淀粉不同比例混合吸附時，按1∶2 混合初始死亡率最小，當菌液與淀粉比例進一步變化至1∶3.5 時死亡率達到了65.8 %，可見水分快速喪失會對I.orientalis活力造成較大影響。固態(tài)菌劑分別在4 ℃和25 ℃儲存10 周后，25 ℃儲存的活菌數(shù)明顯較4 ℃少，尤其是1∶3.5 混合吸附的活菌數(shù)較其他混合比例低了9～18 倍。4 ℃條件下1∶2、1∶2.5 和1∶3 混合比例的活菌數(shù)差異不大。綜合比較可知，制作I.orientalis淀粉吸附固態(tài)菌劑，淀粉比例過高不僅會導致初始死亡率升高，而且菌劑在后續(xù)儲存過程中也存在大量死亡的現(xiàn)象。

由于功能強化曲制備過程使用生料接種，不可避免的會有雜菌存在。實驗表明，加入一定量乳酸可以很大程度抑制雜細菌生長，同時不影響I.orien-talis的增殖。散料發(fā)酵或直接制成曲塊均對I.orientalisP43的增殖影響不大。但散料發(fā)酵會導致細菌數(shù)量增加。在高接種量條件下，I.orientalis強化曲發(fā)酵6 d 后酵母活菌數(shù)可達到6～8 億/g，活菌數(shù)量增加了80 倍。然而，自然晾干一個月后曲塊的活菌數(shù)僅0.26 億/g，這也說明I.orientalis不耐受低水分環(huán)境，水分散失越多，死亡率越高。

通過制備正丙醇含量低的功能菌劑和強化曲加大濃醬兼香型白酒中的原生優(yōu)勢酵母I.orientalisP43 的數(shù)量，可以通過競爭的方式影響發(fā)酵過程。使用復合功能強化曲替代25%大曲的生產實驗在堆積過程中溫度上升梯度和各項理化指標（水分、酸度、殘?zhí)堑龋┚诠に囈蠓秶鷥?。強化實驗組原酒中正丙醇降低了27.4 %，乙醇含量提升了22.9%。采用強化曲替代部分大曲投入生產，所得三輪一次原酒品質和出酒率效果改善明顯。