譚 軍，譚傳鑫，陳瑞鋼，鄭 瀾

(湖南師范大學體育學院體育學國家級實驗教學示范中心，湖南師范大學體適能與 運動康復湖南省重點實驗室，長沙 410012)

科學研究中，實驗動物的福利日益受到研究者的重視，研究是在獲得理想數(shù)據(jù)的同時要符合替代、減少、優(yōu)化3R實驗動物倫理原則。大鼠血液是良好的樣本，可以根據(jù)研究需要檢測多種不同階段大鼠的功能變化指標。采血檢測替代階段性取材、提高采血質(zhì)量是體現(xiàn)3R原則的良好研究策略。依據(jù)采血位點的不同，大鼠常用的采血方法有鼠尾采血、眼眶采血、頸靜脈采血、隱靜脈采血、面部采血、心臟采血、腹主動脈采血和斷頭采血等，這些方法需對大鼠采取麻醉措施，采血中易造成相應器官創(chuàng)傷，不適宜大鼠日常采血。本研究采用大鼠尾靜脈延長策略，在體外形成適宜的持續(xù)負壓，使采血量穩(wěn)定充足，達到定期反復多次取血的目的。

1 研究方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠購自長沙市天勤生物技術有限公司(動物許可證號：SCXK(湘)2014-0011)，27周齡雄性大鼠45只和9周齡雌性大鼠40只。第一次進行適宜水溫試驗，一周后進行最大采血量、采血時間試驗，分別采血10只。動物飼養(yǎng)環(huán)境監(jiān)測：每天上午8點、下午6點測量溫度、濕度并做好記錄。室內(nèi)溫度保持在(22±2)℃，相對濕度50%～60%，每天光照周期為12 h，室內(nèi)通風良好。本實驗由湖南師范大學醫(yī)學倫理委員會批準(倫理科第(2017122)號)。

1.2 實驗器材

如圖1中1所示，采用自行設計的大鼠固定器。固定器前后長度可調(diào)，內(nèi)徑大小可選。固定器的后部預留一小孔，便于鼠尾伸出。此裝置已獲國家實用新型專利授權。

1.大鼠固定器，2.蛙板，3.靜脈采血針，4.一次性負壓采血管(抗凝)，5.試管架，6.靜脈輸液針，7.真空泵，8.電源 圖1 大鼠“體外延長尾靜脈”采血裝置Fig.1 Rat “invitro extended tail vein” blood collection device

1.3 實驗方法

1.3.1 采血適宜水溫試驗

試驗前對大鼠隨機編號，從1開始，按大鼠體重從大到小排序，依次放入第一、二、三組，然后放入第三、二、一組。第一組(32±2)℃；第二組(42±2)℃，第三組(52±2)℃。浸泡時間5 min，采血量在1 ml以上，且未出現(xiàn)溶血，為采血成功。

1.3.2 最大采血量、采血時間試驗

最大采血量試驗是指：不管真空泵增大或減小三次無血液流出的采血量；采血時間試驗是指：當采血針管里出現(xiàn)回血開始計時、采集1 ml血液后停止計時的時長。

2 結(jié)果與分析

2.1 取血裝置與方法的優(yōu)化

減輕大鼠的應激反應。較強的應激反應操作會對大鼠的神經(jīng)內(nèi)分泌及血液學指標產(chǎn)生影響。根據(jù)實驗大鼠的大小調(diào)整自制大鼠固定器裝置。取血時，大鼠的體位可調(diào)節(jié)至適宜位置。鐵制大鼠固定器的穩(wěn)定性強，可以保證一名操作者獨立完成取血。

尾部兩外側(cè)靜脈血管表淺粗大，是良好的穿刺部位。同種動物不同采血位點的采血量不同。每2～7周可以采集血量為循環(huán)血容量的10%，每7 d可以采集循環(huán)血容量的7.5%。301～350 g體重的大鼠可采血3 ml左右。

2.2 尾靜脈水浴適宜溫度分析

前期預實驗大鼠尾部不進行水浴處理，基本找不到尾靜脈位置；適當對大鼠尾部進行水浴加溫，使血管擴張是常用的方法。SD大鼠尾42℃水浴2～3 min為宜，超過45℃大鼠開始焦躁不安。斷尾快速采血法的大鼠應在45℃～50℃水浴中。取血前采用(32±2)℃和(42±2)℃溫水浸泡5 min，使血管得到擴展。27周齡大鼠(42±2)℃能提高采血的成功率，顯著高于(32±2)℃。(52±2)℃水溫太高，可燙傷大鼠尾部，無法進行正常采血實驗。

2.3 最大采血量、采血耗時試驗

眼內(nèi)眥采血與腹靜脈血液的血常規(guī)檢測值有較大的差異。割尾取血的方法使組織液、血液甚至其他成分混合，影響測試的可靠性。28周齡大鼠平均采血量為(2.3±1.0)ml，采血時間為(56.4±19.2)s；10周齡大鼠平均采血量為(1.5±0.6)ml，采血時間為(64.6±21.1)s；血液純凈，沒有出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。體外延長尾靜脈采血可避免采血中組織液混入、導致生化分析中測試值的偏差。為減小誤差，采血時間都在1 min左右。

3 結(jié)論

采用自制采血裝置可以實現(xiàn)體外延長尾靜脈采血，血液無污染，可多次成功采血，在大鼠安全范圍內(nèi)采集足量血液，滿足檢測需要，對動物傷害小，體現(xiàn)3R原則。