田書娟 黃德暉 楊揚 王曉 吳衛(wèi)平

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性，脫髓鞘疾病。MS主要的病理改變包括血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的破壞、纖維蛋白沉積、炎性細胞浸潤、髓鞘脫失、少突膠質細胞丟失、反應性膠質增生和軸索破壞。實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)是目前最佳的炎性脫髓鞘動物模型，對EAE的研究有助于更進一步理解炎性脫髓鞘的分子和細胞機制。在MS和EAE研究中發(fā)現(xiàn)，早在T細胞浸潤和脫髓鞘開始前腦白質中即發(fā)現(xiàn)BBB破壞和纖維蛋白沉積，并伴有小膠質細胞活化[1-6]，纖維蛋白沉積不僅發(fā)生在MS的早期，在MS的活動期和慢性病變中也有大量沉積，且與脫髓鞘和T細胞浸潤有關[7-8]，表明纖維蛋白沉積參與了MS的整個致病過程且與炎性反應有關。且研究發(fā)現(xiàn)降低纖維蛋白沉積可減輕炎性反應，延遲脫髓鞘的發(fā)生[9]，并有效改善EAE模型發(fā)病動物的臨床癥狀[10]。巴曲酶是蛇毒中提取的一種蛋白酶，具有分解纖維蛋白、降低人體內(nèi)纖維蛋白原的作用。本文作者團隊之前的實驗通過免疫后給予巴曲酶治療，發(fā)現(xiàn)巴曲酶能明顯減輕EAE小鼠的臨床癥狀和發(fā)病過程[11]。但EAE小鼠免疫前預防應用巴曲酶是否也能起到保護作用尚不可知，故本研究于小鼠免疫前后分別給予巴曲酶預防及治療，觀察巴曲酶對EAE的作用。

另有研究顯示，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)可以參與BBB的破壞過程，組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator，t-PA)和 MMP-2和-9均參與了BBB的破壞和MS的發(fā)病過程。這些酶的大量激活均依賴于纖溶酶，表明MMP和纖溶酶原激活酶系統(tǒng)之間存在功能相互作用[12-13]。但纖維蛋白沉積、纖溶活性改變及MMP-9表達間的關系目前尚未明了。因此本研究利用分子生物學技術觀察纖維蛋白對MMP-9表達的影響，以觀察巴曲酶是否會通過影響MMP-9的表達來影響EAE的發(fā)病。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與試劑清潔級8～10周齡的C57BL/6(H-2b)雌性小鼠(河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，體質量約18 g)。福氏完全佐劑(completely freund adjuvant，CFA)(美國Sigma公司)，百日咳活菌疫苗、結核桿菌凍干粉(北京天壇生物制品研究所)，巴曲酶(北京東菱醫(yī)藥生物科技有限公司提供)，鼠源MOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK；西安聯(lián)美生物有限公司)，兔抗CD3抗體、兔抗Fig抗體、鼠抗GFAP抗體、山羊抗MBP抗體及山羊抗MMP-9抗體(美國SANTA CRUZ公司)，生物素標記山羊抗兔IgG二抗(河北博海生物工程開發(fā)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組及EAE造模：將8～10周齡的雌性C57BL/6小鼠55只，根據(jù)體重編號后，隨機分為正常對照組(10只)、EAE模型組(15只)、巴曲酶預防組(預防組，15只)、巴曲酶治療組(治療組15只)，后3組小鼠(簡稱EAE小鼠)均以MOG35-55多肽誘發(fā)EAE模型。各組小鼠具體干預方法見表1。

表1 各組小鼠的干預方法

(1)EAE造模：以200 μg MOG35-55多肽溶入200 μL PBS液，再與等量CFA混和，添加結核桿菌使其終濃度為1.5 mg/mL，攪拌5～10 min使其充分乳化，于小鼠雙側側腹壁腹腔注射，免疫后0時(即腹腔注射MOG35-55多肽乳化液時)及48 h腹腔內(nèi)注射100 μL百日咳活菌疫苗(含菌5×109)。造模操作后存活小鼠時參與后續(xù)實驗，EAE模型組15只，治療組14只，預防組12只。正常對照組：將200 μL PBS液與200 μL CFA乳化，取小鼠雙側側腹壁腹腔注射。

(2)發(fā)病情況及神經(jīng)功能評分：免疫后(對照組注射后)每日觀察各組小鼠發(fā)病情況并進行神經(jīng)功能評分，并計算發(fā)病率。

神經(jīng)功能評分：免疫后每日上午10時由同一人對小鼠進行神經(jīng)功能評分。Kono’s 5分法評分標準[14]：0分，不發(fā)??；1分，尾部張力降低或輕度步態(tài)笨拙；2分，輕度后肢力弱；3分，后肢明顯力弱；4分，四肢癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)。

發(fā)病小鼠于發(fā)病高峰期處死，無發(fā)病者于觀察50 d后處死。發(fā)病高峰期一般表現(xiàn)為四肢癱瘓、瀕死狀態(tài)，或連續(xù)3 d癥狀無加重。

發(fā)病率的計算方法：發(fā)病率=(各組發(fā)病只數(shù)/各組總存活只數(shù))×100%。

1.2.2組織病理學檢查：各組小鼠給予10%水合氯醛0.2 mL腹腔注射麻醉，冰上快速取出小鼠脊髓，分離腰膨大部分在4%多聚甲醛中固定(同時將脊髓其他部分組織，-80℃冷凍，行實時熒光定量PCR及RT-PCR檢測)，標本石蠟包埋，組織連續(xù)切片，厚度4 μm厚。每組脊髓切片進行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色、Luxol fast blue染色、快速銀染。

(1)HE染色：每只小鼠隨機選5張切片進行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，每張切片隨機選取5個400倍視野，采用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)對各組單個視野炎性細胞進行計數(shù)。(2)Luxol fast blue染色、快速銀染：均每只小鼠隨機選5張切片，每張切片隨機選5個100倍視野，觀察髓鞘及軸索結構及著色情況。(3)免疫組化染色：常規(guī)脫蠟，抗原修復，山羊血清37℃封閉，加入相應的一抗〔兔抗CD3抗體(1︰50)、兔抗Fig抗體(1︰100)、鼠抗GFAP抗體(1︰50)、山羊抗MBP抗體(1︰100)、山羊抗MMP-9抗體(1︰100)〕4℃過夜，加入二抗(生物素標記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG)，37℃孵育20 min，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃ 20 min，DAB顯色，蘇木素復染細胞核1 min，脫水，透明，中性樹脂封片，每只小鼠隨機選5張切片，采用CMOS(日本OLYMPUS公司，美國Imaging技術公司專用軟件)多功能真彩色病理圖象分析系統(tǒng)對進行定量分析。每張切片隨機選取5個400倍視野，觀察染色后各指標陽性表達情況，依據(jù)陽性免疫反應的圖象灰度選擇合適的灰度分割閾值，測定陽性免疫染色強度及面積，獲得免疫組化評分值。免疫組化評分(IHS)方法：結合陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱兩個方面聯(lián)合評分：A為陽性細胞數(shù)分級(0～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4)，B為陽性細胞顯色強度分級(0=陰性、1=弱陽性、2=陽性、3=強陽性)，A、B兩項乘積即為該組織的IHS值。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測MBP mRNA表達水平：取各組小鼠剩余的脊髓組織，按Trizolz說明書提取組織總RNA，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，hprt)作為內(nèi)參對照。并紫外分光光度計進行RNA純度鑒定及定量；用RT-PCR試劑盒將RNA逆轉錄呈cDNA，以cDNA為模板進行PCR。采用SYBR Green法進行實時熒光定量PCR，選用20 μL為擴增體系，反應條件：95℃，2 min，95℃ 2 s，60℃ 3 s，72℃ 11 s，循環(huán)45次。MBP引物序列：上游引物：5′-ACACTAACCTCGGTGGAAA-3′；下游引物：5′-GCAGTATTGGGCTACATCA-3′。按照2-△△CT計算MBP mRNA的相對表達量。

1.2.4RT-PCR法檢測MMP-9 mRNA表達水平：總RNA提取及逆轉錄方法同前。MMP-9上游引物：5′-CCACCCTACAAAGTTGTCTTCT-3′；下游引物：5′-CTACGTGACCTACGACCT-3′。反應體系25 μL，反應條件：94℃ 5 min，94℃ 3 min，60℃ 30 s，72℃ 10 min，38個循環(huán)，72℃ 10 min。擴增的產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，采用ChampGel TM 2000凝膠成像系統(tǒng)對凝膠電泳條帶進行掃描分析，獲得各條帶光密度，以MMP-9條帶光密度/hprt條帶光密度的比值作為MMP-9 mRNA相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0軟件進行分析。計量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，多組間樣本均數(shù)比較進行單因素完全隨機方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD檢驗。小鼠發(fā)病率比較采用R×C卡方檢驗，組間兩兩比較采用卡方分割法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠發(fā)病情況正常對照組無發(fā)病，其余3組均有小鼠發(fā)病，其中EAE模型組發(fā)病率〔12(80.0%)〕最高，各組小鼠發(fā)病率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.7，P=0.005)，治療組〔7(50.0%)〕及預防組〔2(16.7%)〕發(fā)病率均低于EAE模型組(均P<0.05)。

EAE小鼠在在免疫后13 d左右陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病癥狀，尾部張力減低、消失，雙后肢無力、癱瘓，可伴有大小便失禁。癥狀嚴重者，前肢也逐漸出現(xiàn)無力、癱瘓，以致不能爬動、翻身。與EAE模型組比較，巴曲酶預防組和治療組發(fā)病及達峰時間均延遲(P<0.05)，神經(jīng)功能評分降低(P<0.05，預防組與治療組比較差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 各組EAE小鼠發(fā)病、達峰時間及評分比較

2.2 各組小鼠脊髓中炎性反應、髓鞘脫失和軸索損害比較HE染色顯示免疫后小鼠脊髓內(nèi)不同程度出現(xiàn)炎性細胞浸潤，小血管明顯擴張，炎性細胞聚集在血管周圍形成袖套樣改變，以白質為著。EAE各組小鼠的脊髓中炎性細胞浸潤的數(shù)量均較對照組明顯增多(P<0.01)，預防組及治療組脊髓中炎性細胞浸潤的數(shù)量與EAE模型組相比明顯減少(P<0.05)，預防組與治療組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。具體見表3。

Luxol fast blue染色顯示正常對照組髓鞘連續(xù)，結構完整，未見明顯的脫失；EAE模型組小鼠脊髓白質疏松呈泡沫狀，髓鞘不連續(xù)，部分白質區(qū)髓鞘呈片狀脫失，預防組及治療組脊髓內(nèi)髓鞘脫失明顯輕于EAE模型組，且預防組髓鞘脫失較治療組輕微(圖1)。

快速銀染結果顯示對照組小鼠軸索染色可見銀染色結構完整、著色均勻，EAE模型組、治療組及預防組均可見脊髓內(nèi)纖維結構松散，銀染著色淺，軸索廣泛缺失，其中以EAE模型組軸索損害最為嚴重(圖2)。

圖1 各組小鼠脊髓中髓鞘脫失比較(Luxol fast blue染色×100)：正常對照組(A)髓鞘連續(xù)，未見脫失；EAE模型組(B)白質疏松呈泡沫狀，髓鞘不連續(xù)，可見片狀脫失；治療組(C)部分泡沫狀白質疏松，髓鞘不連續(xù)；預防組(D)部分髓鞘不連續(xù) 圖2 各組小鼠脊髓中軸索損害比較(快銀染色×100)：正常對照組(A)軸索結構完整，著色均勻；EAE模型組(B)結構松散，著色淺，軸索廣泛缺失；治療組(C)及預防組(D)結構較松散，著色不均勻

2.3各組小鼠脊髓中T細胞浸潤、纖維蛋白沉積及GFAP、MBP及MMP-9蛋白表達比較

2.3.2各組小鼠脊髓中纖維蛋白沉積比較：在正常對照組小鼠脊髓切片中未見到纖維蛋白沉積，而EAE模型組，發(fā)病小鼠脊髓白質的大、小血管周圍、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)膠質細胞胞漿中，均可見到明顯的Fig陽性物質沉積，其沉積的范圍遠遠大于炎性細胞浸潤的范圍；免疫組化評分各組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與較EAE模型組比較，預防組及治療組小鼠Fig陽性物質沉積明顯減少(均P< 0.01)(表3、圖4)。

表3 各組檢測指標比較

圖3 各組小鼠脊髓中T細胞浸潤比較(免疫組化×400)：正常對照組(A)、治療組(C)及預防組(D)均可見散在少量陽性細胞，EAE模型組(B)可見較多的陽性細胞(圖中箭頭所示) 圖4 各組小鼠脊髓中纖維蛋白沉積比較(免疫組化×400)：正常對照組(A)未見纖維蛋白沉積；EAE模型組(B)可見大量的纖維蛋白沉積，治療組(C)與預防組(D)少量纖維蛋白沉積(圖中箭頭所示)

2.3.3各組小鼠脊髓中GFAP及MBP蛋白表達比較：正常對照組可見GFAP表達，突起正常，未見免疫活性增強，MBP表達均勻，髓鞘結構正常，EAE模型組可見豐富的GFAP表達，免疫活動增強，突起增多，呈彌漫性分布，而MBP表達減少，治療組和預防組較EAE模型組GFAP表達減少，MBP表達增多(P<0.05)(表3、圖5)。

圖5 各組小鼠脊髓中GFAP、MBP、MMP-9蛋白表達比較(免疫組化×400)：正常對照組可見GFAP表達，細胞突起正常；MBP表達均勻，髓鞘結構正常；未見MMP-9陽性表達。EAE模型組GFAP表達豐富，突起增多，部分胞體腫脹；MBP少量表達，分布不均勻，結構紊亂；MMP-9陽性表達明顯。治療組與預防組GFAP表達稍多，部分突起增多；MBP少量表達，但較圖EAE模型組增多，分布欠均勻；MMP-9陽性表達明顯

2.3.4各組小鼠脊髓中MMP-9蛋白表達比較：正常對照組脊髓內(nèi)未見MMP-9的陽性表達。EAE組中，MMPs-9在脊髓膜、白質血管內(nèi)皮細胞、血管周圍單個核細胞、部分膠質細胞、細胞外間質內(nèi)表達均明顯增加，治療組和預防組小鼠脊髓中MMP-9表達與EAE模型組無明顯差異(P>0.05)(表3、圖5)。

2.4 各組小鼠脊髓中MBP mRNA、MMP-9 mRNA相對表達水平比較實時熒光定量RT-PCR檢測結果顯示各組間MBP mRNA表達比較有統(tǒng)計學意義(F=95.71，P<0.01)。EAE模型組、預防組和治療組MBP mRNA表達較對照組均明顯下調(diào)(P<0.05)，預防組及治療組MBP mRNA的表達均較EAE模型組上調(diào)(P<0.05)，但兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.97)。具體見表3。

普通RT-PCR結果顯示對照組小鼠脊髓中可檢測到MMP-9 mRNA的表達，三組EAE小鼠脊髓中MMP-9 mRNA表達較對照組明顯增加(P< 0.05)，但三組EAE小鼠間MMP-9的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。具體見表3、圖6 。

圖6 各組小鼠脊髓中MMP-9 mRNA表達情況(RT-PCR法)

3 討論

現(xiàn)有病理生理學研究證實，炎性反應和凝血過程也是相互關聯(lián)互為整體的，很多炎性反應以凝血激活和纖維蛋白沉積為特征[15]。在炎性反應的短時間內(nèi)凝血酶能引起血管通透性的增加，從而導致急劇、短暫的BBB通透性增高與凝血酶活性增加、纖維蛋白形成并沉積在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)血管周圍，BBB的開放，進一步促進了纖維蛋白的沉積[16]，定量研究顯示纖維蛋白原沉積與炎性細胞(包括小膠質細胞/巨噬細胞和T細胞)的積累呈正相關，且纖維蛋白原沉積的高峰與脫髓鞘和軸索丟失的發(fā)生一致。另外在纖維蛋白原缺乏的EAE小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)其發(fā)病時間明顯推遲，疾病嚴重程度也有所降低，也支持纖維蛋白原在炎性脫髓鞘病變的早期發(fā)病機制和持續(xù)炎性反應中起關鍵作用[17-18]。目前已知巴曲酶具有降解纖維蛋白原、誘發(fā)t-PA釋放、增強t-PA的作用、減少纖維蛋白溶酶原激活劑抑制物(plasminogen activator inhibitor，PAI)生成等廣泛的生物學效應[19]。而清除EAE動物體內(nèi)的纖維蛋白原，可延遲脫髓鞘的發(fā)生，減輕臨床癥狀，改善預后[9-10]。本研究也表明應用巴曲酶降纖治療可使EAE小鼠發(fā)病率下降，發(fā)病時間延遲，臨床癥狀減輕，病理學提示巴曲酶預防組和治療組病灶內(nèi)炎性浸潤減輕，纖維蛋白沉積減少。其中值得關注的是，本實驗中預防組免疫前使用巴曲酶進行系統(tǒng)降纖，其發(fā)病率與發(fā)病時間均明顯低于免疫后3 d開始使用巴曲酶的治療組，但兩組在EAE達峰時間、最大神經(jīng)功能評分以及病理學炎性反應方面均無明顯差別，提示纖維蛋白原可能是EAE發(fā)病的一個先決條件，一旦發(fā)病后，對臨床表現(xiàn)及炎性改變可能無明顯影響，這也支持了纖維蛋白原主要在病灶形成和臨床癥狀出現(xiàn)前起作用，即作用在EAE誘導階段的觀點。故可以推測，對于復發(fā)緩解型MS患者，在病程緩解期，給予巴曲酶降低血漿中纖維蛋白含量可以有效預防復發(fā)，其預防效果可能要大于其治療效果。

一直以來免疫介導的CNS髓鞘破壞和少突膠質細胞丟失被認為是MS的主要病理表現(xiàn)，但是MS導致永久的神經(jīng)功能障礙主要與軸索丟失有關[20-21]。多項有關MRI、MRS、fMRI的影像學研究均證明進行性軸索丟失是導致MS患者發(fā)生不可逆神經(jīng)功能障礙的主要原因[22-25]。在本實驗中，MOG誘發(fā)的EAE小鼠脊髓中可見到明顯的軸索丟失、破壞，而使用巴曲酶干預的小鼠軸索損害明顯減輕，其與臨床癥狀、炎性浸潤和髓鞘脫失程度一致，表明巴曲酶可能有效減輕軸索的損害進而改善預后，但巴曲酶對軸索的保護作用是直接作用還是間接通過改善炎性反應、髓鞘保護等起作用，尚需進一步行體外細胞培養(yǎng)等研究進行證實。

Akassoglou等[26]通過建立動物坐骨神經(jīng)損傷模型觀察到給予巴曲酶處理可減少纖維蛋白在神經(jīng)細胞外基質中的沉積，促進施萬細胞分化，增加髓鞘化軸突的數(shù)量，即神經(jīng)軸突的再髓鞘化而促進損傷后坐骨神經(jīng)的再生。雖然中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)再生能力與周圍神經(jīng)不同，但本研究中發(fā)現(xiàn)，應用巴曲酶清除纖維蛋白原后MBP陽性細胞數(shù)明顯增加，MBP mRNA表達上調(diào)，提示在CNS中，調(diào)控纖維蛋白原的沉積/清除可能是神經(jīng)損傷后修復的一個關鍵因素。Petzold等[27]研究發(fā)現(xiàn)GFAP水平高低與患者臨床殘疾評分呈正相關，故可以將其作為不可逆損害的標志。本實驗中EAE模型組小鼠脊髓中有大量纖維蛋白沉積，星形膠質細胞細胞增生明顯，引起的臨床癥狀嚴重，造成了神經(jīng)功能的不可逆損害，而巴曲酶干預后星形膠質細胞增生減少，臨床癥狀輕且預后好，降低了造成神經(jīng)功能不可逆損害的機率，這也與本文作者團隊之前的研究結果相一致，提示降纖治療可能改善臨床患者的預后。

EAE早期BBB的破壞除與凝血-纖溶系統(tǒng)有關外，還需特別關注另一種蛋白酶——MMPs。MMPs是一組降解細胞外基質的蛋白酶，參與了腦缺血、MS和帕金森病等多種神經(jīng)疾病的發(fā)生和發(fā)展。其中，MMP-9在MS和EAE相關研究中涉及最多。在MS發(fā)病過程中，MMP-9主要參與了BBB破壞、炎細胞浸潤及髓鞘脫失等多個環(huán)節(jié)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在EAE組小鼠發(fā)病急性期，病灶區(qū)、血管周圍單個核細胞、血管內(nèi)皮細胞及膠質細胞內(nèi)均可見到MMP-9表達，并且EAE組小鼠MMP-9 mRNA表達均有明顯增加，這些結果與以往文獻結果一致。既往多項研究已證實，EAE動物脊髓中MMP-9 mRNA表達升高程度與臨床癥狀嚴重程度相關，臨床表現(xiàn)越重者則MMP-9 mRNA表達越高[29]?；诖?，本研究進行實驗設計與預期，但實驗結果顯示，預防組和治療組小鼠脊髓中MMP-9 mRNA表達與EAE模型組無明顯差異，其原因尚不清楚。但有研究發(fā)現(xiàn)纖溶酶系統(tǒng)在MMPs激活過程中起決定性的作用，t-PA和尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-tyoe plasminogen activator，u-PA)將纖溶酶原激活為纖溶酶，纖溶酶進而激活MMP-3和MMP-1，二者可使MMP-9前體裂解轉變?yōu)橛谢钚缘腗MP-9，另外，tPA還能以纖溶酶非依賴的方式作用于MMP-9，間接調(diào)節(jié)MMP-9基因的轉錄，并在EAE發(fā)病中與MMPs協(xié)同誘導，參與炎性反應和軸索損傷[30]。由上推測本實驗結果可能與使用巴曲酶后機體內(nèi)tPA活性增高有關。

綜上，本次研究表明長期、間斷給予巴曲酶可以減緩EAE小鼠炎性反應發(fā)生及髓鞘的損傷，EAE造模時在免疫前使用效果最佳，并且未發(fā)現(xiàn)持續(xù)給予巴曲酶的小鼠有出血傾向及其他毒副作用。纖維蛋白沉積是促進MS發(fā)生、進展的重要因素之一，它可能涉及到炎性反應、BBB通透性增高、神經(jīng)膠質增生、軸索損害等多個方面。巴曲酶對于MS患者是否有效，用藥時機、劑量及療程長短均需進一步研究，但以纖維蛋白為治療靶點的抗凝治療對炎性脫髓鞘疾病可能有潛在的治療益處，值得進一步研究探討。