常堃，蔡婧，李為民，王鋒尖，李軍，張九玲，肖艷，李世華，劉杰，周向宇，田繼成

（1.十堰市農(nóng)業(yè)科學院，湖北 十堰 442000；2.漢江師范學院生物化學與環(huán)境工程系，湖北 十堰 442000）

據(jù)統(tǒng)計，世界上可食用的大型真菌種類約2500種，其中最昂貴也最受歡迎的大多屬于菌根菌[1]，美味牛肝菌就是其中之一。美味牛肝菌（Boletus edulis Bull.ex Fr.）屬于擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）牛肝菌科（Boletaceae）牛肝菌屬（Boletus Fr.）[2]。美味牛肝菌又名大腳菇、網(wǎng)紋牛肝菌等[3]，因其菌肉肥厚，柄粗壯，食味香甜可口，營養(yǎng)豐富，是餐桌上深受歡迎的美味菌菜。菌根食用菌在栽培過程中，菌根合成和菌根苗的培養(yǎng)是菌根菌栽培成功的基礎[4]，但是菌根合成的高成本也是限制其發(fā)展的主要因素。十堰市生長的牛肝菌以鄖陽區(qū)美味牛肝菌最有名氣，豐富的野生牛肝菌資源為當?shù)匕傩諑砹溯^高的經(jīng)濟效益。近年來，由于過度采挖，野生美味牛肝菌資源正在不斷減少，為此本文對鄖陽區(qū)牛肝菌資源進行采集鑒定，并分離菌絲和篩選最適培養(yǎng)基，為美味牛肝菌的菌種制作和仿野生栽培做好基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

美味牛肝菌子實體于2018年9 月采自鄖陽區(qū)白桑關鎮(zhèn)櫟樹林中，由漢江師范學院王峰尖教授鑒定，對組織分離菌絲和子實體進行ITS 序列分析方法鑒定，分離所得菌絲低溫保存?zhèn)溆肹5]。

1.2 采集方式

野生美味牛肝菌生長處上方往往會有很多飛蟲圍繞盤旋，可借助此特性尋找野生美味牛肝菌。將采集的野生牛肝菌用無菌吸水紙將子實體包裹，分別放入平底紙盒中，盡快運回實驗室進行處理。

1.3 不同部位組織分離對菌絲生長的影響

先將美味牛肝菌子實體外表用無菌水沖洗干凈，用75% 的酒精進行表面消毒后，用無菌鑷子掰開，再分別挑取菌柄、菌蓋以及菌柄菌蓋交界處直徑5 mm左右的組織接入PDA 培養(yǎng)基中心，25℃恒溫暗培養(yǎng)，每個部位分離15個重復，計算分離成活率（分離成功數(shù)/總分離數(shù)），并測量20d后菌落直徑（每個處理隨機取10個）。

1.4 基礎培養(yǎng)基篩選

按照1.2 方法對菌柄進行組織分離，并接入以下培養(yǎng)基：①改良MMN[6]②母種培養(yǎng)基[7]③濱田培養(yǎng)基[8]④1/2MS培養(yǎng)基[9]⑤Ohta瓊脂培養(yǎng)基[10]⑥PDA。每個培養(yǎng)基設10個重復，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)。觀察菌絲生長的形態(tài)變化，培養(yǎng)到20 d 時測量菌落直徑。

1.5 不同培養(yǎng)基的配制

浸提液制作方法：將選取的腐殖落葉、根系和土壤等陰干，取50g 放于1000mL 蒸餾水中文火煮沸30min后過濾[12]，得到浸提液。以親體液配置各培養(yǎng)基再用蒸餾水定容至1 L，獲得所需培養(yǎng)基。

根據(jù)基礎培養(yǎng)基篩選結(jié)果，以基礎培養(yǎng)基為對照，并在基礎培養(yǎng)基中分別加入5%牛肝菌生長處腐殖落葉浸提液、5%牛肝菌生長處土壤中栓皮櫟根浸提液、5%牛肝菌子實體浸提液及5%牛肝菌生長處土壤浸提液，并在以上培養(yǎng)基中分別設置無VB1和有VB1（濃度為0.001%）[11]兩個處理。每個培養(yǎng)基設10 次重復，25℃恒溫暗培養(yǎng)，觀察菌絲生長的形態(tài)變化，培養(yǎng)到20d時測量菌落直徑。

1.6 ITS測序分析

利用ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGC) 和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）通用引物對美味牛肝菌子實體及純化菌絲進行PCR 擴增鑒定[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位組織分離對菌絲生長的影響

由表1 可知，對美味牛肝菌不同部位進行組織分離，菌絲長勢各有不同。在試驗范圍內(nèi)對美味牛肝菌菌柄進行組織分離所得菌落直徑最大。除菌蓋處分離成活率較低，其余部位分離成活率均為100%；牛肝菌菌蓋含水量較高，且菌肉較菌柄處薄，因此增加了污染的概率，導致成活率較低。

表1 不同部位組織分離對菌絲生長的影響Table 1 Effect of tissue separation on mycelial growth

2.2 基礎培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

基礎培養(yǎng)基對美味牛肝菌菌絲生長的影響，見表2。在試驗范圍內(nèi)，培養(yǎng)基為1/2MS 培養(yǎng)基時菌絲生長良好，菌落直徑最大。

表2 基礎培養(yǎng)基對菌絲生長的影響Table 2 Effect of basis culture medium on mycelial growth

2.3 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

不同培養(yǎng)基對美味牛肝菌菌絲生長的影響，見表3。在試驗范圍內(nèi)，只有1/2MS+腐殖落葉+VB1培養(yǎng)基所得菌落直徑略大于對照1/2MS 培養(yǎng)基，試驗范圍內(nèi)VB1的添加無明顯增強美味牛肝菌菌絲生長的作用。

圖1 菌絲生長情況Fig.1 Mycelial growth states of Boletus edulis

表3 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響Table 3 Effect of culture medium on mycelial growth

2.4 鑒定結(jié)果

美味牛肝菌子實體ITS 序列長度為739個堿基，與GenBank 中的序列（登錄號GQ984158.1）同源性是99.32%；美味牛肝菌分離菌絲序列長度為737個堿基，與GenBank 中的序列（登錄號GQ984158.1）同源性是99.72%，并與美味牛肝菌子實體的序列同源性為99.56%。結(jié)合形態(tài)學初步鑒定結(jié)果，所測菌株均為美味牛肝菌，與漢江師范學院王峰尖根據(jù)子實體特征及顯微結(jié)構(gòu)鑒定的結(jié)果一致[14]。

3 討論

美味牛肝菌的菌根體外合成早已成功[15]，但是菌根合成到進行商業(yè)化出菇，目前來看并不現(xiàn)實，因此根據(jù)本地野生美味牛肝菌生長區(qū)的菌群特點，制作美味牛肝菌菌種進行仿野生栽培，不但可以對本地牛肝菌資源以及林木資源進行保護，同時投入相較菌根合成要低很多。

美味牛肝菌各部位組織分離成活率均很高，試驗范圍內(nèi)菌柄分離所得菌落直徑最優(yōu)。美味牛肝菌菌絲分離培養(yǎng)基的研究很多，但是效果均不明顯，試驗范圍內(nèi)以1/2MS培養(yǎng)基可獲得較大菌落，且明顯優(yōu)于其他培養(yǎng)基，而以1/2MS 培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基加入各種浸提液的培養(yǎng)基，所得菌落均無明顯優(yōu)勢。下一步將利用1/2MS 培養(yǎng)基為基礎研究其他培養(yǎng)基配方及液體菌種配方，以期獲得適合美味牛肝菌生長的培養(yǎng)基配方，從而為美味牛肝菌的菌種制作及仿野生栽培打下基礎。