秦源 熊宇 徐寅生

【摘要】目的 研究黃芪多糖通過(guò)NF-κB/COX2通路發(fā)揮對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠腦損傷抑制作用的機(jī)制。方法 采用顱內(nèi)血管刺破法建立SAH模型后各組給予相應(yīng)處理，24 h后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，采用HE染色和TEM觀察大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)，免疫蛋白印跡檢測(cè)海馬區(qū)NF-κB、COX2、TNF-α等因子的表達(dá)。結(jié)果 與模型組相比，APS和PDTC均能提高大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)、縮短總路程和降低首次穿越平臺(tái)所需時(shí)間，上調(diào)凋亡抑制因子Bcl2的表達(dá)和抑制NF-κB、COX2、Caspase3等因子表達(dá)，維持神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，且應(yīng)用PDTC效果比APS（40 mg/kg）更明顯。結(jié)論 黃芪多糖能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)通路中相關(guān)損傷因子NF-κB、TNF-α等的表達(dá)來(lái)抑制SAH大鼠海馬部位神經(jīng)元的凋亡，進(jìn)而減輕腦損傷并改善大鼠海馬的功能。

【關(guān)鍵詞】黃芪多糖;腦出血;凋亡;炎癥

【中圖分類號(hào)】R743.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095.6681.2020.26..03

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是臨床常見的重癥疾病之一，其病死率、致殘率、復(fù)發(fā)率高，隨著人口老齡化進(jìn)程的加快，該病的發(fā)病率有上升和逐漸年輕化的趨勢(shì)[1]。由于腦出血發(fā)病迅猛，病機(jī)復(fù)雜、病情變化多端，是臨床治療的難點(diǎn)，目前未有明顯突破，因此也是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦出血多數(shù)存在腦微循環(huán)和神經(jīng)元內(nèi)環(huán)境的變化、腦血流的動(dòng)力學(xué)異常、免疫功能紊亂等，各種變化相互交織影響，最終可以引起細(xì)胞凋亡[2]，繼而引起腦功能損傷表現(xiàn)為偏癱、意識(shí)和功能障礙，嚴(yán)重的即可引起人的死亡，其作用機(jī)制比較復(fù)雜，有待深入研究。

中藥及其提取物因具有多靶點(diǎn)作用，所以常被臨床醫(yī)生用來(lái)治療在諸多病因不明或病情復(fù)雜多變的疾病中，而黃芪多糖具有調(diào)節(jié)免疫力、抗炎、抑制腫瘤和保護(hù)腦神經(jīng)等作用[3]，但具體的作用機(jī)制不明。課題組前期證明黃芪多糖能影響轉(zhuǎn)錄因子κB和下游凋亡蛋白如Caspase-3、Bcl-2的表達(dá)發(fā)揮對(duì)SAH大鼠神經(jīng)元凋亡的抑制作用，但黃芪多糖的具體作用機(jī)制是否通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)未被明確，且NF-κB能與環(huán)氧酶2（cyclooxygenase-2，COX2）基因啟動(dòng)子序列中位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)COX2的表達(dá)，參與腦損傷相關(guān)疾病的病理過(guò)程[4-5]。故課題組擬通過(guò)大腦中動(dòng)脈刺破法建立腦出血模型，進(jìn)一步明確黃芪多糖調(diào)節(jié)NF-κB/COX2通路作用具體機(jī)制。

1 材 料

1.1 動(dòng)物及分組

雄性SD大鼠 ，體重280～300 g，由重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售公司提供。合格證號(hào)SCXK（渝）2018-0005。將動(dòng)物隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組（A）、SAH模型組（B）、黃芪多糖組（C）和NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（pyrrolidine dithiocarbamateacid，PDTC）組即阻斷劑組（D），黃芪多糖腹腔注射黃芪多糖40 mg/kg，阻斷劑組腹腔給予8%PDTC，按0.25 mL/100 g，后再給予黃芪多糖40 mg/kg[6]。

1.2 主要試劑

黃芪多糖（APS）購(gòu)于西安文竹生物科技公司，批號(hào)：HK-20171421，分子式為C10H7ClN2O2S，分子量254.69，純度90%，用時(shí)稀釋為40mg/kg使用。

1.3 方法

（1）本實(shí)驗(yàn)采用頸內(nèi)動(dòng)脈刺破的方法制作模型，具體步驟參照 Bederson法[7]，應(yīng)用水合氯醛，濃度10%，計(jì)量1 ml/kg，經(jīng)腹腔注射，大鼠仰臥固定，逐層鈍性分離后在頸外動(dòng)脈剪“V”型切口，一次性將4號(hào)尼龍線從切口導(dǎo)入到大腦中動(dòng)脈與大腦前動(dòng)脈分叉處至出現(xiàn)落空感后（深度20～22 mm），停約10 s，抽出并結(jié)扎頸外動(dòng)脈，縫合消毒，術(shù)后黃芪多糖組和阻斷劑組給予阻斷劑8%PDTC腹腔注射黃芪多糖，剩余兩組大鼠腹腔分別給予同劑量的生理鹽水。假手術(shù)組在線栓遇到阻力后立即拔出[3]。

（2）空間探索實(shí)驗(yàn)（spatial probe test）：該實(shí)驗(yàn)屬于水迷宮（Morris water maze）實(shí)驗(yàn)，其目的是測(cè)定觀察對(duì)象的空間記憶能力，與大鼠海馬的功能有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察的是急性損傷，所以僅選擇了利用空間探索的行為實(shí)驗(yàn)反應(yīng)各組大鼠海馬功能的變化情況。在最后一次定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行相應(yīng)處理第二天撤去平臺(tái)，把大鼠放入原先平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)水中，記錄120s大鼠首次通過(guò)平臺(tái)的時(shí)間、穿越平臺(tái)的次數(shù)和游泳總路程作為檢測(cè)指標(biāo)。

（3）大鼠腦組織海馬的病理形態(tài)學(xué)觀察：治療24h取各組大鼠，10%水合氯醛麻醉，用動(dòng)物灌注針將0.9%生理鹽水約300ml沖洗至流出的液體為清澈，用4%多聚甲醛約300 mL滴注10 min左右，然后快速斷頭取腦，放入4%多聚甲醛中后固定（上述液體劑量和灌注時(shí)間為每只大鼠所用）。常規(guī)石蠟包埋切片（厚度10 μm），采用HE染色，光鏡觀察各組大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元的病理形態(tài)學(xué)變化。

（4）Western blotting：取四組大鼠海馬放入蛋白提取試管中，超聲粉碎，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。電泳上樣每孔的蛋白量為60 μg，10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜（100 V，100 min），5%BSA室溫封閉1 h，兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體（1∶500，abcam公司，貨號(hào)：ab52237），等比例的兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體、NF-κB多克隆抗體和TNF-α等多克隆抗體和小鼠抗大鼠β-actin多克隆抗體（1∶4000，北京普利萊基因技術(shù)有限公司）過(guò)夜。復(fù)溫1 h后分別加相應(yīng)二抗，HRP標(biāo)記兔抗小鼠、兔抗山羊和山羊抗兔抗體（1：200，北京普利萊基因技術(shù)有限公司），4℃孵育二天。洗滌后，在PVDF膜上滴加ECL發(fā)光液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），暗室曝光后將蛋白印跡條帶掃描，經(jīng)Image J圖像軟件分析讀取灰度值并比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Sigma Plot 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。應(yīng)用單因素方差分析（ANOVA）對(duì)空間探索數(shù)據(jù)和免疫蛋白印跡檢測(cè)的蛋白條帶灰度值進(jìn)行組間比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪多糖對(duì)SAH大鼠空間探索能力的影響

空間探索實(shí)驗(yàn)中，靶象限穿越平臺(tái)的次數(shù)、總路程和首次穿越平臺(tái)的時(shí)間數(shù)據(jù)分析均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，黃芪多糖組和阻斷劑組的大鼠首次穿越平臺(tái)所需時(shí)間和總路程均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而黃芪多糖組與阻斷劑組相比，阻斷劑組首次穿越平臺(tái)所需時(shí)間和路程要相對(duì)更少，阻斷劑組所需時(shí)間平均為50.39 s;總路程中與假手術(shù)組相比，其他三組游泳路程均高，與模型組相比，黃芪多糖組與阻斷劑組穿越平臺(tái)的路程相對(duì)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中阻斷劑組的路程平均最少為736.34 cm。在120 s內(nèi)，穿越象限平臺(tái)次數(shù)最多的為假手術(shù)組，平均為2.5次，與假手術(shù)組相比，其他三組穿越象限平臺(tái)次數(shù)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而與模型組相比，黃芪多糖組與阻斷劑組穿越象限平臺(tái)次數(shù)有所上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中阻斷劑組與黃芪多糖組相比，上升明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。因大腦動(dòng)脈刺破造模技術(shù)對(duì)出血量無(wú)法準(zhǔn)確控制的原因造成每組大鼠數(shù)值波動(dòng)較大。以上結(jié)果說(shuō)明黃芪多糖組和NF-κB通路阻斷劑能改善蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠的空間記憶能力，且阻斷劑組大鼠的空間記憶能力改善更為明顯。見表1。

2.2 大鼠腦組織海馬的病理形態(tài)學(xué)觀察

假手術(shù)組大鼠海馬HE染色觀察CA1區(qū)錐體細(xì)胞體積完整，排列規(guī)則，胞核呈圓形或橢圓形，核仁明顯，染色質(zhì)質(zhì)地均勻，細(xì)胞數(shù)量多，相比較模型組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞破碎不完整，壞死明顯，結(jié)構(gòu)松散，部分細(xì)胞腫脹明顯，排列雜亂不規(guī)整，細(xì)胞數(shù)量明顯減少;黃芪多糖組和阻斷劑組大鼠正常細(xì)胞胞核呈圓形或橢圓形，核仁清晰，染色質(zhì)豐富，排列較密，存在相對(duì)少量細(xì)胞核固縮而發(fā)生變性的神經(jīng)元。見圖1。

2.3 黃芪多糖對(duì)SAH大鼠NF-κB、COX2、TNF-α蛋白表達(dá)的影響（如圖2）

與假手術(shù)組相比，黃芪多糖組及模型組大鼠海馬NF-κB、COX2、TNF-α蛋白表達(dá)均顯著增加，阻斷劑組COX2、TNF-α蛋白表達(dá)也增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與模型組相比，黃芪多糖組和阻斷劑組大鼠的COX2、TNF-α蛋白表達(dá)均顯著性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;黃芪多糖組NF-κB蛋白表達(dá)也明顯降低，而黃芪多糖組與阻斷劑組比較，阻斷劑組COX2、TNF-α蛋白表達(dá)相對(duì)下降顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 黃芪多糖對(duì)SAH大鼠Bcl 2、Caspase3、IL-1β蛋白表達(dá)的影響（如圖3）

與假手術(shù)組相比，黃芪多糖組、模型組及阻斷劑組大鼠海馬Bcl 2、Caspase3、IL-1β蛋白表達(dá)均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與模型組相比，黃芪多糖組和阻斷劑組大鼠的Bcl 2蛋白表達(dá)升高，而Caspase3、IL-1β蛋白表達(dá)均顯著性降低（P<0.01）;而黃芪多糖組與阻斷劑組比較，阻斷劑組Caspase3、IL-1β蛋白表達(dá)相對(duì)下降顯著，Bcl 2蛋白表達(dá)升高顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討 論

蛛網(wǎng)膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage，SAH）具有致死率高、致殘率高及逐漸的年輕化等特點(diǎn)。目前的研究認(rèn)為，蛛網(wǎng)膜下腔出血后出現(xiàn)的腦損傷可能是SAH后患者死亡或致殘的主要原因[9]，其涉及的病理機(jī)制復(fù)雜包括神經(jīng)元凋亡、炎癥反應(yīng)、腦水腫等[10-12]。前期我們的研究證明黃芪多糖能通過(guò)影響NF-κB蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而起到抑制神經(jīng)凋亡的發(fā)生，但是具體作用機(jī)制不清楚。

NF-κB是1986年由Sen和Baltimore發(fā)現(xiàn)提出，因可與kappa鏈基因結(jié)合，故命名為κ基因結(jié)合核因子。它不是一種單體蛋白質(zhì) ，而是一群功能密切相關(guān)的蛋白二聚體，其中在細(xì)胞中最常見的作用形式為p65及p50組成的異源二聚體，未受刺激時(shí)在細(xì)胞質(zhì)中以非活化形式存在，當(dāng)有損傷發(fā)生后，NF-κB可以活化轉(zhuǎn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)，對(duì)酶類介質(zhì)和細(xì)胞因子如炎性相關(guān)因子IL-1、TNF-α、COX2等起到激活作用[13-14]。COX2主要位于細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)，因啟動(dòng)子序列中含有NF-κB特異結(jié)合序列，能與NF-κB結(jié)合后可以促進(jìn)COX2基因的轉(zhuǎn)錄，因此屬于NF-κB通路的重要蛋白因子參與到凋亡及炎癥反應(yīng)中，對(duì)于神經(jīng)元具有重要意義，有的研究顯示NF-κB在腫瘤具有抗凋亡的作用，也有的研究認(rèn)為NF-κB的活化會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤的擴(kuò)散，通過(guò)抑制p65亞基而抑制NF-κB的活性，故而可以抑制腫瘤的增殖[15-16]，且NF-κB/COX2通路在蛛網(wǎng)膜下腔出血的具體作用機(jī)制還未詳細(xì)闡明。課題組研究顯示與模型組相比，SAH大鼠腹腔注射黃芪多糖后能抑制NF-κB（p65）的激活，下調(diào)炎癥因子IL-1β、TNF-α和促凋亡因子Caspase-3的表達(dá)，提高抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，且應(yīng)用NF-κB阻斷劑后，作為NF-κB通路的重要蛋白因子COX2因子的表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），相應(yīng)的炎癥反應(yīng)的相關(guān)因子IL-1β、TNF-α及凋亡因子Caspase-3也均下降明顯，說(shuō)明黃芪多糖能通過(guò)NF-κB/COX2通路抑制SAH引起的大鼠腦部炎癥因子的釋放和神經(jīng)元的凋亡，佐證了上述能通過(guò)抑制NF-κB通路中重要蛋白如p65及COX2蛋白的表達(dá)進(jìn)而起到抑制SAH引起神經(jīng)元凋亡的作用。

海馬結(jié)構(gòu)位于顳葉內(nèi)側(cè)面的基底部，是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，具有多方面的生理功能，目前的研究已證明海馬與學(xué)習(xí)記憶特別是空間認(rèn)知功能有關(guān)，而Morris水迷宮是測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)和記憶非常理想而有效的測(cè)試方法。SAH大鼠的空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與模型組相比，黃芪多糖組與阻斷劑組均能提高SAH大鼠的空間記憶能力，而形態(tài)學(xué)研究HE染色也表明給予黃芪多糖和阻斷劑的大鼠能提高海馬正常神經(jīng)元的數(shù)量，維持神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整和穩(wěn)定?？傊S芪多糖能通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB/COX2通路中NF-κB（p65）、COX2、IL-1β、TNF-α炎癥相關(guān)因子表達(dá)而影響凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而可以降低蛛網(wǎng)膜下腔出血對(duì)大鼠神經(jīng)元的損傷，提高其空間記憶能力。