艾晉芳 解軍 胡國(guó)輝

(上海大學(xué)力學(xué)與工程科學(xué)學(xué)院, 上海市應(yīng)用數(shù)學(xué)和力學(xué)研究所, 上海市力學(xué)在能源工程中的應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200072)

因?yàn)樵谏锇踩院蛯?dǎo)入效率等方面的優(yōu)勢(shì), 基于力學(xué)方法實(shí)現(xiàn)基因?qū)肴找娴玫綄W(xué)術(shù)界的重視. 本文提出了一種基于零質(zhì)量射流, 對(duì)微管道中運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞施加流體作用力, 引起其發(fā)生變形, 進(jìn)而促使細(xì)胞膜上力敏通道開(kāi)啟的方法, 并通過(guò)數(shù)值模擬進(jìn)行了理論驗(yàn)證. 本文采用浸沒(méi)有限元法, 對(duì)紅細(xì)胞在微管道內(nèi)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中受到零質(zhì)量射流作用的變形情況進(jìn)行數(shù)值模擬, 探討了如何高效地實(shí)現(xiàn)小分子物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞. 數(shù)值模擬的重要參數(shù)有微管道內(nèi)壓力梯度Δp, 零質(zhì)量射流的振幅Am 和頻率f. 經(jīng)過(guò)對(duì)流場(chǎng)特征和紅細(xì)胞受力情況的分析, 發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞某處表面張力T0 大于臨界表面張力τc 時(shí), 細(xì)胞表面力敏通道打開(kāi), 并得到每一時(shí)刻細(xì)胞力敏通道打開(kāi)的百分比Popen. 本文定義了通道開(kāi)啟積分I, 以衡量在不同的流動(dòng)參數(shù)情況下, 細(xì)胞膜力敏通道的開(kāi)啟程度, 進(jìn)而探討了壓力梯度和射流振動(dòng)頻率、振幅對(duì)I 值的影響, 以尋找優(yōu)化的工藝參數(shù). 該方法具有微制造工藝簡(jiǎn)單易行, 在保證高通量導(dǎo)入的同時(shí), 便于對(duì)所施加的流體作用力進(jìn)行精確控制的特點(diǎn), 這使得蛋白質(zhì)、基因等物質(zhì)實(shí)現(xiàn)跨膜輸運(yùn), 進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)生重編程成為可能.

1 引 言

細(xì)胞重編程(cell reprogramming)是細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù), 在再生醫(yī)藥、疾病模型和藥物篩選等方面有著廣泛應(yīng)用. 以往的研究表明[1], 誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, IPSCS)可由特定轉(zhuǎn)錄因子的異位表達(dá)使軀體干細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞重編程得到. 基因遞送(gene delivery)技術(shù)通過(guò)將目的基因?qū)爰?xì)胞, 也可以誘導(dǎo)細(xì)胞重編程發(fā)生.

實(shí)現(xiàn)基因跨細(xì)胞遞送主要有生物和物理方法.生物方法包括基因轉(zhuǎn)化(transformation)、接合(conjugation) 和轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)等[2?4]. 物理方法包括顯微注射(microinjection)、粒子轟擊(particle bombardment)、基因槍、電穿孔(electroporation)和光學(xué)方法等[5?7]. 目前應(yīng)用比較廣泛的遞送方法是病毒轉(zhuǎn)導(dǎo). 病毒載體能保證誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表達(dá), 但其存在發(fā)生腫瘤等生物安全性方面的風(fēng)險(xiǎn)[8]. 一些學(xué)者因而致力于利用蛋白質(zhì)誘導(dǎo)得到多功能干細(xì)胞的研究[9]. 蛋白質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞常見(jiàn)方法之一是電穿孔. 該方法產(chǎn)生電滲透作用的同時(shí), 可能會(huì)隨機(jī)地使細(xì)胞膜發(fā)生破裂而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10,11], 而且轉(zhuǎn)染范圍也受到電場(chǎng)方向的限制[12]. 因此, 現(xiàn)有的生物、物理方法, 或者可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成永久性損壞, 甚至死亡; 或者由于病毒轉(zhuǎn)染和基因插入使得細(xì)胞發(fā)生癌變可能而存在生物安全性方面的隱患; 或者因只能適用于少數(shù)種類或者少數(shù)數(shù)量的細(xì)胞等原因而被限制其廣泛應(yīng)用.

運(yùn)用力學(xué)方法使細(xì)胞膜發(fā)生變形, 可以引起物質(zhì)跨細(xì)胞膜輸運(yùn), 同時(shí)在生物安全性方面具有一定的優(yōu)勢(shì). 通過(guò)精確地控制細(xì)胞膜的受力, 有可能實(shí)現(xiàn)高效的物質(zhì)輸運(yùn), 并保證細(xì)胞的存活率. 麻省理工大學(xué)(MIT)Fetterman 等[13]提出了細(xì)胞擠壓(cell squeezing)技術(shù), 即驅(qū)使細(xì)胞通過(guò)小于其直徑30%—80%的收縮通道, 使其受到擠壓發(fā)生變形,促使細(xì)胞膜上力敏通道(mechano-sensitive channel)打開(kāi)[14]. 目前的研究已證實(shí)該方法可運(yùn)用于很多種類的細(xì)胞, 具有應(yīng)用的廣泛性. 但有兩個(gè)因素制約該方法的發(fā)展: 一方面, 該技術(shù)需要制備直徑僅為數(shù)微米的變截面微管道, 對(duì)微制造技術(shù)要求比較高; 另一方面細(xì)胞尺寸制約了輸送效率[15], 且對(duì)于非同步群體(asynchronous population), 尺寸過(guò)大的細(xì)胞可能堵塞通道, 而對(duì)于尺寸過(guò)小的細(xì)胞, 由于細(xì)胞膜變形不充分會(huì)降低物質(zhì)的輸運(yùn)效率. 為了處理大小和力學(xué)性質(zhì)不同的細(xì)胞種類, 需要設(shè)計(jì)不同規(guī)格的收縮通道[14], 這導(dǎo)致制造成本變高, 阻礙了該項(xiàng)技術(shù)的大規(guī)模發(fā)展和應(yīng)用.

近年來(lái), 基于超聲波空化(ultrasonic cavitation)效應(yīng)的聲致穿孔(sonoporation)成為基因遞送技術(shù)中一個(gè)相當(dāng)活躍的領(lǐng)域[16?20]. 在該方法中,系統(tǒng)中傳播的超聲波在液體中產(chǎn)生氣泡, 氣泡進(jìn)一步生長(zhǎng)并破裂, 在破裂過(guò)程中氣泡形成射流, 對(duì)細(xì)胞膜施加一定的流體作用力, 使細(xì)胞膜破裂或細(xì)胞膜上力敏通道[21?23]開(kāi)啟, 容許大分子從周圍介質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞, 從而實(shí)現(xiàn)物質(zhì)跨細(xì)胞輸運(yùn), 進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生重編程. 細(xì)胞膜上的孔道打開(kāi)一段時(shí)間(毫秒至數(shù)秒)后, 外部作用力消失, 基于自修復(fù)機(jī)理,細(xì)胞膜上的孔道自愈合. 該方法雖然可以同時(shí)作用于大量細(xì)胞, 導(dǎo)入效率較高, 但由于外部壓力對(duì)細(xì)胞的作用很難均勻控制, 所以難以保證大批量細(xì)胞的存活率. 為了克服該方法的不足, Duke 大學(xué)Zhong 課題組[24,25]利用激光在介質(zhì)中的局部加熱效應(yīng), 形成兩個(gè)串聯(lián)的氣泡, 二者之間的相互作用引起二次Bjerknes 力[26]產(chǎn)生離開(kāi)串行氣泡中心的射流(速度可達(dá)50 m/s)作用于細(xì)胞膜. 該方法的射流速度和流體剪切力可以精確控制, 在細(xì)胞膜上形成的孔洞直徑較大(幾百納米乃至微米量級(jí)), 而且保證了細(xì)胞的生理功能. 但同樣由于裝置比較復(fù)雜, 目前還只適用于單細(xì)胞操作.

近期發(fā)展的導(dǎo)入方法有Modaresi 等[27]提出的利用細(xì)胞懸浮通過(guò)微流控芯片作為破壞細(xì)胞膜所需的驅(qū)動(dòng)力來(lái)實(shí)現(xiàn)物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞, 該方法提供了一種即插即用(plug-and-play)的新平臺(tái)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)基因載體和納米顆粒的胞內(nèi)傳遞. 另外, Kizer 等[28]開(kāi)發(fā)了一種基于單純細(xì)胞剪切快速機(jī)械變形的無(wú)堵塞慣性微流控平臺(tái)來(lái)實(shí)現(xiàn)物質(zhì)跨細(xì)胞輸運(yùn)的方法.

本文提出一種基于零質(zhì)量射流, 對(duì)細(xì)胞膜施加射流作用, 促使細(xì)胞在微管道中發(fā)生應(yīng)力變形, 以打開(kāi)細(xì)胞膜表面力敏通道的方法. 1950 年Ingard和Labate[29]提出了零質(zhì)量射流(zero-net-massflux, ZNMF)的概念, 又被稱作合成射流(synthetic jet). 零質(zhì)量射流通常采用活塞或壓電薄膜的往復(fù)運(yùn)動(dòng)吹/吸流體, 在狹小孔口外形成一系列渦環(huán)/對(duì), 向外擴(kuò)展的過(guò)程中這些渦環(huán)/對(duì)相互融合形成一種動(dòng)量射流[30,31]. 自Wiltse 和Glezer[32]于1994 年首次將零質(zhì)量射流方法運(yùn)用于流動(dòng)主動(dòng)控制以來(lái),ZNMF 受到了流體力學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[33?37].

本文運(yùn)用浸沒(méi)有限元(immersed finite element method, IFEM)方法, 研究零質(zhì)量射流作用于微管道中紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的過(guò)程, 分析不同流動(dòng)參數(shù)下細(xì)胞變形和細(xì)胞膜力敏通道開(kāi)啟的情況, 以驗(yàn)證該方法的可行性, 為進(jìn)行該裝置的制造和優(yōu)化設(shè)計(jì)提供了理論支撐.

2 數(shù)值模擬方法

2.1 浸沒(méi)有限元法

浸沒(méi)邊界法(immersed boundary method, IBM)由Peskin[38]于1972 年提出, 并運(yùn)用于模擬心臟受力和周圍血流的問(wèn)題[39]. 此后, 浸沒(méi)邊界法吸引了大量關(guān)注, 并且被廣泛地應(yīng)用在流固耦合問(wèn)題的數(shù)值模擬中. 在該方法中, 運(yùn)動(dòng)流體用歐拉網(wǎng)格表示,固體部分則看作在流體網(wǎng)格上的運(yùn)動(dòng)和變形, 用拉格朗日方法描述. 固體和流體的相互作用由光滑離散的Dirac δ 函數(shù), 通過(guò)差值速度和分布節(jié)點(diǎn)力得到[40]. 在浸沒(méi)邊界法中, 假定浸沒(méi)的固體是一維的,并不占據(jù)流體區(qū)域體積, 因此不能精確反映固體部分的真實(shí)情況; 其次, 由于Dirac δ 函數(shù)連續(xù)性的局限性, 其處理幾何形狀不規(guī)則的固體和復(fù)雜邊界條件不夠準(zhǔn)確[41,42]. 為了彌補(bǔ)這些不足, Wang 和Liu[42], Zhang 等[43]提出了浸沒(méi)有限元法(immersed finite element method, IFEM), 并將其運(yùn)用于生物流體力學(xué)計(jì)算中[44,45].

在浸沒(méi)有限元法中, 整個(gè)計(jì)算域Ω由不可壓三維可變形固體結(jié)構(gòu)Ωs和不可壓流體Ωf組成(上標(biāo)s 和f 分別代表固體和流體). 采用有限元法離散計(jì)算網(wǎng)格, 固體部分完全浸沒(méi)在流體部分之中, 即Ωf∪Ωs=Ω,Ωf∩Ωs=?. 整個(gè)計(jì)算區(qū)域Ω的流體網(wǎng)格用與時(shí)間無(wú)關(guān)的位置矢量x表示. 位置矢量Xs和xs(Xs,t)分別表示初始構(gòu)型Ω0s和當(dāng)前構(gòu)型Ωs下的固體物質(zhì)點(diǎn). 對(duì)于流體的計(jì)算, 未知量是速度v和壓力p; 對(duì)于固體部分Ωs, 需要求解的是節(jié)點(diǎn)位移us, 定義為us=xs–Xs, 即當(dāng)前構(gòu)型和初始構(gòu)型下的位移差. 速度vs= dus/dt是位移的物質(zhì)導(dǎo)數(shù). IFEM 的控制方程[43]如下:

式中ρf,ρs分別表示流體密度和固體密度;t是時(shí)間;速度場(chǎng)變量vs表示固體區(qū)域Ωs的速度;v表示整個(gè)計(jì)算域Ω的速度;FFSI,s表示固體區(qū)域Ωs的流固相互作用力(fluid solid interaction);Fesxt,Fefxt分別是作用于固體和流體上的外力;σf是流體壓力;σs是固體壓力. 對(duì)于數(shù)值方法的詳細(xì)介紹可參考文獻(xiàn)[43?47].

IFEM 采用流線迎風(fēng)/Petrov Galerkin (streamline upwind/Petrov Galerkin, SUPG)和壓力穩(wěn)定/Petrov Galerkin (pressure-stablizing/Petrov-Galerkin, PSPG)算法以減小數(shù)值振蕩和耗散[48?50],利用分布算子和差值算子實(shí)現(xiàn)固體邊界和周圍流體力與速度的信息交換, 采用重構(gòu)核粒子法(reproducing kernel particle method , RKPM)形 函 數(shù)[51]來(lái)近似Dirac δ 函數(shù). 離散的Dirac δ 函數(shù)更加高階和光滑, 有助于流固相互作用的計(jì)算和復(fù)雜邊界條件的處理.

方程(3)中速度插值和方程(5)中力的分布表達(dá)成如下離散形式:

式中,ΦI,ΦJ是由RKPM 得到的Dirac δ 函數(shù)的離散重構(gòu)形式;ΩФI,ΩФJ是固體節(jié)點(diǎn)的影響域, 其他變量是在節(jié)點(diǎn)I和J的離散形式[35]. 關(guān)于速度插值和力分布的詳細(xì)處理可參考文獻(xiàn)[43,51].

2.2 零質(zhì)量射流

零質(zhì)量射流通常由空腔振蕩膜或活塞迫使流體通過(guò)孔口交替性地進(jìn)出外流場(chǎng)形成(圖1). 該射流的特點(diǎn)在于, 它完全由流動(dòng)系統(tǒng)的工作流體形成, 確保動(dòng)量傳遞到流動(dòng)系統(tǒng)中而不需要通過(guò)外界流體的質(zhì)量注入. 吹氣沖程中, 噴出的流體在噴孔的尖銳邊緣分離并向上滾動(dòng)形成一對(duì)渦對(duì)或渦環(huán);吸氣沖程中, 渦對(duì)或渦環(huán)離孔口較遠(yuǎn), 由于其自誘導(dǎo)速度而不斷向外傳播. 因此, 渦對(duì)或渦環(huán)會(huì)結(jié)合在一起形成具有動(dòng)量傳遞的射流[52,53].

圖1 零質(zhì)量射流示意圖. Dc 表示空腔直徑, H 表示空腔高度, D0 表示孔口直徑, h 表示孔口高度. 典型的合成射流流場(chǎng)可劃分為三個(gè)明顯流動(dòng)區(qū)域, 即近場(chǎng)區(qū)域、過(guò)渡區(qū)域和遠(yuǎn)場(chǎng)區(qū)域Fig. 1. Schematic diagram of ZNMF jet flow. Dc stands for the cavity diameter, H for the cavity height, D0 for the orifice diameter, and h for the orifice height. The typical flow field of synthetic jet can be divided into three flow zones:Near field zone, transition zone, and far field zone.

本文的數(shù)值模擬考慮在微通道中引入零質(zhì)量射流, 計(jì)算區(qū)域如圖2 所示. 微通道尺寸為40 μm ×400 μm × 40 μm, 射流小孔位于通道底部中間, 尺寸為2 μm × 2 μm.

圖2 數(shù)值模擬物理模型示意圖, 其中L1 表示射流小孔左端距離入口距離, L2 表示射流小孔右端距離入口距離,L2–L1 = 2 μm, H 表示管道的高度, v 示意紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向,速度單位為 mm/s. 紅細(xì)胞(red blood cell, rbc)在壓力梯度作用下通過(guò)射流上方Fig. 2. Physical model of numerical simulation, in which L1 stands for the distance between the left end of the jet hole and the inlet, while L2 for the distance between the right end of the jet hole and the inlet, L2–L1 = 2 μm, H is the height of the channel , v is the movement direction of the red blood cells, the units of velocity is mm/s, which passes above the synthetic jet driven by pressure gradient.

本文研究重點(diǎn)是射流對(duì)紅細(xì)胞的影響, 忽略了空腔內(nèi)部流動(dòng)細(xì)節(jié)的模擬, 只考慮由于空腔內(nèi)薄膜運(yùn)動(dòng)引起流體在孔口處的速度邊界條件的變化. 參考Lee 等[44]給出的薄膜運(yùn)動(dòng)規(guī)律得到孔口速度:

其中,Am是射流振幅,f是振動(dòng)頻率. 該公式視為計(jì)算模型中空腔出口處小孔的速度邊界條件, 其方向沿著Z軸豎直向上.

零質(zhì)量通量射流中振幅Am改變射流速度大小, 較大的射流速度可能致使細(xì)胞受到過(guò)大射流作用影響而死亡, 較小的振幅則可能造成細(xì)胞膜打開(kāi)不充分. 因此, 通過(guò)調(diào)整射流的振幅, 可以比較便捷地實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞施加不同大小的作用力.

2.3 紅細(xì)胞的本構(gòu)關(guān)系

本文采用Mooney-Rivlin 模型描述以三維超彈性材料構(gòu)成的紅細(xì)胞的本構(gòu)關(guān)系. 該模型已經(jīng)應(yīng)用于眾多研究領(lǐng)域[54,55], 例如微噴射[56]、細(xì)胞氣穴現(xiàn)象[57]和新型軟執(zhí)行器材料-離子液體凝膠(materialionic liquid gel)的性能研究[58]等.

細(xì)胞的彈性勢(shì)能W表示為

式中,c1,c2和κ 是材料常數(shù);J1=I1I3?1/3,J2=I3=det(C), 柯西-格林變形張量C定義為C=FTF, 變形梯度張量Fij=?xi/?Xj, 對(duì)于不可壓縮材料來(lái)說(shuō)J3= 1.

柯西應(yīng)力和彈性勢(shì)能W之間的關(guān)系是

式中J= det(F)是雅可比矩陣.

2.4 數(shù)值實(shí)現(xiàn)

本文數(shù)值模擬中, 流體是六面體網(wǎng)格, 紅細(xì)胞是雙面凹結(jié)構(gòu), 采用四面體網(wǎng)格. 經(jīng)過(guò)網(wǎng)格和時(shí)間步長(zhǎng)無(wú)關(guān)性測(cè)試, 流體和紅細(xì)胞節(jié)點(diǎn)數(shù)分別為674081 和3266, 單元數(shù)分別為640000 和9908, 計(jì)算時(shí)間步長(zhǎng)dt= 2.5 × 10–5s. 流體和紅細(xì)胞的密度相同,ρf=ρs= 1 g/cm3, 流體黏性μ= 1 g/(m·s).微管道出、入口采用壓力邊界條件, 入口、出口壓力差為Δp. 在本文的模擬中, 選取的壓力梯度值分別是Δp= 20, 30, 40, 50, 60 Pa, 其他邊界采用無(wú)滑移邊界條件, 零質(zhì)量通量射流作為速度邊界條件作用于圖2 的微通道小孔處.

數(shù)值計(jì)算中, 紅細(xì)胞在壓力梯度Δp作用下從入口處運(yùn)動(dòng), 速度達(dá)到穩(wěn)定勻速后進(jìn)入射流作用區(qū)域. 本文進(jìn)行了不同參數(shù)的模擬, 通過(guò)調(diào)整壓力梯度Δp, 射流振幅Am和頻率f來(lái)分析流動(dòng)參數(shù)對(duì)紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)變形和力敏通道開(kāi)啟的影響.

3 結(jié)果分析

3.1 零質(zhì)量射流

首先分析微管道中沒(méi)有紅細(xì)胞時(shí)的流場(chǎng)特征.當(dāng)零質(zhì)量射流單獨(dú)作用于微通道時(shí), 流場(chǎng)是對(duì)稱分布的, 其具體的分析可參閱文獻(xiàn)[59]. 若沿著Y軸正方向施加壓力梯度Δp, 零質(zhì)量射流將與管道橫流發(fā)生互相影響, 圖3 是射流振動(dòng)頻率f= 625 Hz,射流振幅Am= 78.125π mm, 壓力梯度Δp=60 Pa 時(shí)的流場(chǎng)圖.

結(jié)果顯示, 壓力梯度的施加對(duì)通道內(nèi)零質(zhì)量射流引起的流場(chǎng)有較大的影響, 導(dǎo)致了其中渦結(jié)構(gòu)的變化. 如圖3(a)所示, 在吹氣半沖程剛開(kāi)始(t=T/4)時(shí), 由于左側(cè)壓力較大, 導(dǎo)致孔口兩側(cè)速度場(chǎng)結(jié)構(gòu)的對(duì)稱性遭到破壞, 孔口附近流體偏向右邊,下游的速度值也稍大; 如圖3(b)所示, 當(dāng)t=T/2時(shí), 吹氣沖程達(dá)到最大, 主流的動(dòng)量因射流的加入有所增加, 有助于抑制下游回流區(qū)的出現(xiàn), 因此并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的渦結(jié)構(gòu); 在圖3(c)所示的吸氣沖程(t= 3T/4)中, 由流體速度方向可知, 此時(shí)流體是回流進(jìn)孔口, 說(shuō)明在孔口附近射流對(duì)流體吸力作用大于壓力梯度的影響, 孔口左側(cè)速度值總體大于右側(cè); 如圖3(d)所示, 當(dāng)t=T時(shí), 吹氣沖程達(dá)到最大, 此時(shí)下游由于孔口的吸氣作用, 主流的動(dòng)量有所減少, 導(dǎo)致在孔口右側(cè)出現(xiàn)了兩個(gè)旋渦.

圖3 壓力梯度作用下零質(zhì)量射流流場(chǎng)分布(Am =78.125π mm, f= 625 Hz, Δp= 60 Pa), 其中速度的量綱為mm/s. 截取的截面Y 軸坐標(biāo)范圍170 μm ≤ Y ≤ 230 μm,小孔位于截面正中心Y= 200 μm. 圖中箭頭表示速度方向, 顏色表示速度大小, 顏色越深, 則速度值越大. 四幅圖描述了流場(chǎng)運(yùn)行穩(wěn)定后, 一個(gè)周期(T= 1.6 × 10–3 s)內(nèi)沿著流動(dòng)方向截面上的流場(chǎng)分布情況 (a) t= T/4; (b) t=2T/4; (c) t= 3T/4; (d) t= TFig. 3. Flow field distribution under the action of ZNMF jet and pressure gradient (Am = 78.125π mm, f= 625 Hz, Δp=60 Pa), in which the unit for velocity magnitude is mm/s.The cross-section depicted ranges 170 μm ≤ Y ≤ 230 μm in Y coordinate, and the hole is in the center of the crosssection Y= 200 μm. The arrow in the figure represents the direction of velocity vectors , and the color represents the magnitude of velocity. The darker the color, the greater the velocity magnitude. The four figures describe the distribution of flow field in a period: (a) t= T/4; (b) t= 2T/4;(c) t= 3T/4; (d) t= T.

3.2 紅細(xì)胞在微管道中的運(yùn)動(dòng)

本節(jié)研究零質(zhì)量射流對(duì)微管道中紅細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和變形的影響. 當(dāng)紅細(xì)胞在壓力梯度Δp作用下運(yùn)動(dòng)一段距離, 達(dá)到穩(wěn)定速度, 即速度達(dá)到勻速狀態(tài)后, 進(jìn)入射流作用的區(qū)域發(fā)生變形. 圖4 繪制了紅細(xì)胞的質(zhì)心坐標(biāo)在YZ平面隨運(yùn)動(dòng)時(shí)間變化的規(guī)律, 此時(shí)壓力梯度Δp= 30 Pa, 射流振動(dòng)頻率f=625 Hz, 射流振幅Am= 78.125π mm.

在圖4 中, 紅細(xì)胞起始質(zhì)心坐標(biāo)Y= 192 μm,Z= 20 μm. 由于射流的作用方向是沿著Z軸正方向, 所以紅細(xì)胞持續(xù)地受到射流吸力和推力作用,在豎直方向(Z軸方向)上發(fā)生伸長(zhǎng)和收縮的變形,其質(zhì)心位置隨著射流周期性地變化.Z坐標(biāo)的最小值為17.6 μm, 對(duì)應(yīng)吸氣沖程, 此時(shí)紅細(xì)胞位于孔口上方, 吸力最大;Z坐標(biāo)的最大值為21.5 μm, 對(duì)應(yīng)吹氣沖程. 紅細(xì)胞在Y方向大致表現(xiàn)出穩(wěn)定的線性變化, 其運(yùn)動(dòng)范圍為192 μm ≤Y≤ 208 μm,但壓力梯度和射流的共同作用顯著地影響著紅細(xì)胞向前的運(yùn)動(dòng)速度大小. 紅細(xì)胞經(jīng)過(guò)孔口區(qū)域的時(shí)間Δt= 58 × 10–5s, 因孔口長(zhǎng)度為2 μm, 紅細(xì)胞速度大約為vs= 3.5 mm/s.

圖4 紅細(xì)胞經(jīng)過(guò)射流作用區(qū)域時(shí), 質(zhì)心的Y 軸和Z 軸坐標(biāo)隨時(shí)間t 變化規(guī)律(Am= 78.125π mm, f= 625 Hz, Δp=30 Pa). 圖 中 綠 線 表 示 質(zhì) 心Z 軸 坐 標(biāo) 變 化, 藍(lán) 線 表 示Y 軸坐標(biāo)變化, 三條黑線分別表示紅細(xì)胞被拉伸到最長(zhǎng)時(shí)的時(shí)刻, 對(duì)應(yīng)為ta= 125 × 10–5 s, tb= 285 × 10–5 s, tc= 445 ×10–5 s, 任意兩條黑線之間時(shí)間間隔為一個(gè)振動(dòng)周期, T=1.6 × 10–3 s. 紅藍(lán)兩條垂直線表示紅細(xì)胞進(jìn)入孔口正上方的時(shí)刻, 紅細(xì)胞經(jīng)過(guò)射流孔口的時(shí)間Δt= 58 × 10–5 sFig. 4. The variation of Y-axis and Z-axis coordinates of cell centroid with time (Am = 78.125π mm, f= 625 Hz, Δp=30 Pa). The green line represents for the change of Z-axis coordinate of the centroid, while the blue line represents for the change of its Y-axis coordinate . The three black lines represent the moment when red blood cells are stretched to the maximum, corresponding to ta= 125 × 10–5 s, tb= 285 ×10–5 s, tc= 445 × 10–5 s, and any two black lines represent a jet period, T= 1.6 × 10–3 s. The red and blue vertical lines indicate the moment when the red blood cells enter the orifice directly above, the interal of the red blood cells pass through the orifice Δt= 58 × 10–5 s.

為了更好地觀察紅細(xì)胞變形時(shí)的流場(chǎng)信息, 分析在一個(gè)射流振動(dòng)周期內(nèi)紅細(xì)胞變形和應(yīng)力以及流場(chǎng)的壓力分布圖(圖5).

圖5 一個(gè)射流周期內(nèi)(T= 1.6 × 10–3 s)紅細(xì)胞變形所受應(yīng)力和流體壓力場(chǎng)(Am= 78.125π mm, f= 625 Hz, Δp=30 Pa) (a)?(d)分別表示不同時(shí)刻紅細(xì)胞質(zhì)心所在XZ 截面的流體壓力分布以及紅細(xì)胞受到的壓力 (a) t=T/4 (Y= 197.7 μm); (b) t= T/2 (Y= 199.5 μm); (c) t=3T/4 (Y= 200.8 μm); (d) t= T (Y= 202.4 μm)Fig. 5. Diagram of stress of red blood cell and fluid pressure field in one peroid for Am= 78.125π mm, f= 625 Hz,Δp= 30 Pa. (a)?(d) represents the fluid pressure distribution in the XZ section of the RBC center of mass at different times and the stress on the RBC membrane: (a) t= T/4 (Y= 197.7 μm); (b) t= T/2 (Y= 199.5 μm); (c) t= 3T/4 (Y= 200.8 μm); (d) t= T (Y= 202.4 μm).

圖5是一個(gè)流動(dòng)周期內(nèi), 在不同時(shí)刻紅細(xì)胞質(zhì)心Y軸坐標(biāo)截取的XZ截面上流體壓力分布和紅細(xì)胞受到的應(yīng)力變化, 圖5 中紅細(xì)胞應(yīng)力范圍為2.3 Pa ≤σ≤ 32.0 Pa, 流體壓力范圍為–220 Pa ≤p≤ 220 Pa, 壓力值為負(fù)說(shuō)明流體對(duì)紅細(xì)胞是吸力作用, 其中圖5(a),(b)對(duì)應(yīng)吸氣沖程, 紅細(xì)胞處于伸長(zhǎng)狀態(tài), 圖5(c),(d)對(duì)應(yīng)吹氣沖程, 紅細(xì)胞處于壓縮狀態(tài). 在圖5(a)中, 射流在吸氣上半沖程,吸力作用不是很明顯, 紅細(xì)胞受到的應(yīng)力左右對(duì)稱. 在圖5(b)中, 射流吸氣沖程中射流吸力達(dá)到最大, 紅細(xì)胞拉伸到最長(zhǎng)狀態(tài), 紅細(xì)胞幾乎位于射流小孔正上方, 此時(shí)整個(gè)流場(chǎng)區(qū)域壓力達(dá)到最大. 在圖5(c)中, 射流吹氣沖程剛剛開(kāi)始, 盡管紅細(xì)胞也幾乎位于小孔正上方, 但此時(shí)紅細(xì)胞附近流體速度較大, 所以壓力較小, 紅細(xì)胞所受應(yīng)力也較小, 壓縮程度未達(dá)到最大. 在圖5(d)中, 射流吹氣沖程吹力達(dá)到最大, 紅細(xì)胞周圍流體壓力較大, 而且下方壓力大于上方, 紅細(xì)胞繼續(xù)向上壓縮變形達(dá)到最大程度, 而流場(chǎng)除了細(xì)胞周圍以外其他區(qū)域速度大小差不多, 壓力值大小也幾乎相同, 均遠(yuǎn)小于紅細(xì)胞周圍的壓力值.

為了研究在流體作用力下細(xì)胞膜力敏通道的打開(kāi)情況, Sabass 等[60?64]通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞膜變形能的解析模型, 得到了細(xì)胞膜力敏通道開(kāi)啟的臨界表面張力τc, 即當(dāng)細(xì)胞膜表面局部表面張力T0大于τc時(shí), 認(rèn)為此處力敏通道開(kāi)啟. 參照該解析模型[60?64]的公式推導(dǎo), 臨界細(xì)胞膜張力, 其中Rclosed= 2.3 nm 和Ropen=3.5 nm 分別代表力敏通道封閉和開(kāi)啟時(shí)的半徑,疏水錯(cuò)位(hydrophobic mismatch)U= 0.015 μm,Kt和Kb為細(xì)胞磷脂雙分子層物性參數(shù),ε為細(xì)胞膜厚度. 對(duì)于本文的算例, 紅細(xì)胞半徑為3.9 μm,膜厚度為0.05 μm, 可計(jì)算得到τc≈ 79.7 mN/m.本文根據(jù)已有文獻(xiàn)的方法[65], 計(jì)算得到了細(xì)胞膜上受到的表面張力分布, 由此得到每一時(shí)刻細(xì)胞膜力敏通道打開(kāi)的百分比Popen(percentage of mechanosensitive channel to open).

圖6 不同振幅Am 作用下紅細(xì)胞變形時(shí)力敏通道開(kāi)啟百分比Popen 隨運(yùn)動(dòng)時(shí)間t 的變化(f= 625 Hz, Δp= 30 Pa),圖中豎直綠線表示紅細(xì)胞剛好經(jīng)過(guò)孔口正中心位置的時(shí)刻Fig. 6. Variation of Popen for mechano-sensitive channel gating in cell deformation with time t under different amplitude Am (f= 625 Hz, Δp= 30 Pa). The green line in the figure stands for the moment when the cell passes above the orifice.

圖6顯示了當(dāng)射流頻率f= 625 Hz, Δp=30 Pa 時(shí), 不同射流振幅值下細(xì)胞膜力敏通道隨著時(shí)間變化的開(kāi)啟情況. 如圖6 所示, 力敏通道的打開(kāi)百分比隨著射流振幅呈現(xiàn)周期性變化的趨勢(shì). 當(dāng)細(xì)胞接近射流空腔時(shí), 細(xì)胞膜的變形已經(jīng)引起了通道的開(kāi)啟; 當(dāng)其位于空腔上方時(shí), 開(kāi)啟百分比達(dá)到最大值, 此后Popen則隨著細(xì)胞遠(yuǎn)離空腔而逐漸減小,并趨向于零. 如所預(yù)期的, 零質(zhì)量射流振幅Am越大, 紅細(xì)胞受到的射流作用力也越大, 更容易導(dǎo)致力敏通道的打開(kāi). 這個(gè)結(jié)果也驗(yàn)證了本文提出的基于零質(zhì)量射流的物質(zhì)導(dǎo)入技術(shù)在理論上的可行性.

3.3 流動(dòng)參數(shù)的影響

在實(shí)施物質(zhì)跨膜輸運(yùn)的實(shí)際過(guò)程中, 往往希望在力敏通道開(kāi)啟百分比Popen盡可能大的同時(shí), 也保持較長(zhǎng)的持續(xù)開(kāi)啟時(shí)間ts=t2–t1(t1為細(xì)胞進(jìn)入射流作用區(qū)域開(kāi)始發(fā)生變形的時(shí)刻,t2為細(xì)胞離開(kāi)射流作用區(qū)域停止發(fā)生變形的時(shí)刻). 因此, 本文構(gòu)造一個(gè)參數(shù), 即通道開(kāi)啟積分(channel gating integral)來(lái)綜合衡量二者共同決定的力敏通道的開(kāi)啟程度, 并在此基礎(chǔ)上, 分析外加壓力梯度、射流頻率等參數(shù)如何對(duì)力敏通道開(kāi)啟程度產(chǎn)生的影響.

為此, 本文在壓力梯度和射流頻率( Δp-f)平面, 繪制了射流振幅Am= 78.125π mm 時(shí)通道開(kāi)啟積分的變化情況(圖7). 對(duì)于較小的壓力梯度,細(xì)胞受到的流體剪切力較小, 但細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度較慢, 在管道中滯留時(shí)間較長(zhǎng); 而壓力梯度較大時(shí),雖然細(xì)胞受到的剪切應(yīng)力較大, 但細(xì)胞滯留時(shí)間較短. 因此存在一個(gè)壓力梯度的優(yōu)化值, 使得通道開(kāi)啟程度I達(dá)到較大值. 結(jié)果表明(圖7), 在本文計(jì)算參數(shù)下, 對(duì)于不同的振動(dòng)頻率, 當(dāng)Δp= 30 Pa時(shí), 通道開(kāi)啟程度總能達(dá)到最優(yōu)值.

射流頻率的高低對(duì)細(xì)胞的變形也有重要的影響, 這與細(xì)胞膜對(duì)流動(dòng)剪切作用的響應(yīng)時(shí)間有關(guān).頻率過(guò)高, 可能導(dǎo)致細(xì)胞膜來(lái)不及對(duì)外加剪切作用產(chǎn)生響應(yīng), 進(jìn)而影響其發(fā)生變形, 導(dǎo)致蛋白質(zhì)跨膜輸運(yùn)效率低下. 因此, 需要尋找理想的射流振動(dòng)頻率. 在本文計(jì)算參數(shù)下, 圖7 表明, 通道開(kāi)啟積分I的最大值對(duì)應(yīng)于振動(dòng)頻率f= 2500 Hz, 同時(shí)在f=625 Hz 處I出現(xiàn)了另一個(gè)較低峰值. 導(dǎo)致出現(xiàn)兩個(gè)峰值的原因是否與細(xì)胞膜的本征振動(dòng)頻率有關(guān),是將來(lái)工作中希望進(jìn)一步研究的問(wèn)題.

圖7 通道開(kāi)啟程度I 隨著壓力梯度Δp 和射流振動(dòng)頻率f 的變化. 顏色代表I 的大小, 顏色越深, I 值越大.圖中豎直黑線表示Δp= 30 Pa,兩條水平橫線分別代表f=2500 Hz 和f= 625 HzFig. 7. The variation of channel gating integral I with the pressure gradient Δp and the jet vibration frequency f. The color represents the magnitude of I, the darker the color,the greater of I. The black line stands for Δp= 30 Pa,while the two horizontal lines for f= 2500 Hz and f=625 Hz, respectively.

4 結(jié) 論

在生物醫(yī)學(xué)研究中, 為更好實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)、基因、藥物等小分子物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi), 研究細(xì)胞膜變形和力敏通道開(kāi)啟的機(jī)理, 進(jìn)而探索高效、安全的基因?qū)爰夹g(shù)至關(guān)重要. 本文提出了一種基于零質(zhì)量射流的方法, 通過(guò)其作用于微管道中運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞, 希望實(shí)現(xiàn)高通量、易于控制的細(xì)胞跨膜輸運(yùn)技術(shù). 因?yàn)槿藗儗?duì)紅細(xì)胞的本構(gòu)關(guān)系結(jié)構(gòu)比較熟悉,本文運(yùn)用浸沒(méi)有限元方法, 數(shù)值模擬了紅細(xì)胞在零質(zhì)量射流作用下的變形和運(yùn)動(dòng), 分析了其力敏通道的開(kāi)啟情況. 本文分析了在周期射流作用下, 紅細(xì)胞在流場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)、變形和力敏通道開(kāi)啟的情況,通過(guò)調(diào)節(jié)壓力梯度以及射流的振幅和頻率, 使紅細(xì)胞膜表面力敏通道打開(kāi)百分比更大, 且打開(kāi)時(shí)間更長(zhǎng), 并構(gòu)造參數(shù)I來(lái)衡量力敏通道開(kāi)啟的總體效果. 數(shù)值模擬結(jié)果表明, 在本文的計(jì)算參數(shù)下, 使I最大的壓力梯度是Δp= 30 Pa,I值最大的振動(dòng)頻率是f= 2500 Hz. 射流振幅的增大有助于細(xì)胞膜力敏通道的開(kāi)啟, 這使得人們可以方便地調(diào)節(jié)此振幅值, 既保證了細(xì)胞的存活率, 又充分地保證了細(xì)胞導(dǎo)入的效率. 這些結(jié)果也說(shuō)明了該技術(shù)在理論上的可行性. 基于零質(zhì)量射流的細(xì)胞跨膜輸運(yùn)技術(shù)具有微制造工藝簡(jiǎn)單, 流動(dòng)參數(shù)便于精確控制的特點(diǎn),有望高效、安全地實(shí)現(xiàn)對(duì)不同種類細(xì)胞的物質(zhì)導(dǎo)入.因此,本文的工作為進(jìn)一步制作和優(yōu)化該基因遞送裝置打下了理論基礎(chǔ).