李景芬 夏正龍 欒 生 蔡繆熒 羅 坤 唐瓊英 高權新 孔 杰 楊國梁,

(1. 湖州師范學院 浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術研究重點實驗室, 中國水產科學研究院水生動物繁育與營養(yǎng)重點實驗室, 湖州 313000; 2. 江蘇數豐水產種業(yè)有限公司, 高郵 225654; 3. 中國水產科學研究院黃海水產研究所,農業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點開放實驗室, 青島 266071)

羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)又名馬來西亞大蝦、淡水長臂大蝦, 是世界上最大的淡水經濟蝦類。原產于東南亞地區(qū)以及大洋洲北部和西太平洋島嶼[1]。我國于1976年從日本引進羅氏沼蝦,此后, 它在中國沿海各省得到發(fā)展和推廣。20世紀90年代, 隨著大規(guī)模人工孵化和育苗技術的進步, 我國羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展, 已成為我國水產養(yǎng)殖業(yè)的主要品種之一[2]。到2009年, 我國連續(xù)10年成為世界第一的羅氏沼蝦養(yǎng)殖大國[3]。2010—2018年,我國羅氏沼蝦養(yǎng)殖產量除2013年為1.174×108kg, 其余各年產量均在1.2×108kg以上, 2013—2017年產量連年持續(xù)增長, 2017年產量達1.374×108kg[4]。但是,由于近交和有限的小群體繁殖, 使養(yǎng)殖品種遺傳多樣性減少, 出現種質退化, 表現為抗病力下降、生長緩慢和性成熟提早等現象, 已成為影響羅氏沼蝦產量和經濟效益的嚴重問題[5]。而遺傳多樣性與種群的生存能力、適應能力和進化潛力呈正相關, 是物種進化的基礎[6]。因此, 研究現有羅氏沼蝦種質資源的遺傳多樣性對羅氏沼蝦種質資源的有效利用、改良養(yǎng)殖種群的經濟性狀、選育優(yōu)良的新品種及研究種群的遺傳結構等具有重要意義。

種群遺傳分析已被證明是評價物種種群遺傳多樣性和獲取遺傳結構信息的最佳方法[7]。微衛(wèi)星標記被認為是進行種群遺傳分析最為有效的分子標記之一, 因其具有共顯性、高突變率、遍布全基因組、易于評分和能夠提供豐富的遺傳信息等特

點而被廣泛采用。因此, 在研究羅氏沼蝦群體遺傳多樣性和種群結構方面, 微衛(wèi)星標記也是被廣泛采用的標記之一。國內外關于羅氏沼蝦微衛(wèi)星標記的開發(fā)[8—11]及利用微衛(wèi)星標記研究其遺傳變異的[12—17]已有一些報道。但是同時對來自4個國家的羅氏沼蝦群體的研究卻鮮有報道, 且這4個國家均普遍養(yǎng)殖羅氏沼蝦。此外, 研究羅氏沼蝦群體遺傳變異的微衛(wèi)星標記量大多在5—12個[12—17], 而戴習林等[17]研究顯示: 當標記量5—25時, 等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)等遺傳參數呈現上升趨勢, 當標記量大于20時,各遺傳多樣性指數值已無顯著性差異。鑒于此, 本研究采用16個微衛(wèi)星標記, 對3個國外引進群體和2個本國養(yǎng)殖群體進行了遺傳多樣性分析, 以期為羅氏沼蝦種質資源的開發(fā)利用和優(yōu)良品種的選育提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的羅氏沼蝦分別來自泰國(CP)、孟加拉(BD)、緬甸(MN)和江蘇數豐水產種業(yè)有限公司(MP和DP)。MP是一個不同家系的混養(yǎng)群, DP是一個擴繁群。CP 13尾, BD 15尾, MN 16尾, MP 74尾和DP 29尾, 每個個體剪取蝦背部肌肉組織, 于無水乙醇中保存。

1.2 試驗方法

取出無水乙醇固定的蝦肉于1.5 mL離心管中,揮發(fā)干乙醇, 用小剪刀盡量剪碎, 加入裂解液和蛋白酶K混勻, 于55℃搖床中消化至溶液澄清透明。再向裂解液中加入RNase于37℃水浴鍋中保溫1h。然后按傳統(tǒng)的酚、氯仿和異戊醇法提取基因組DNA。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和完整性, 用紫外分光光度計檢測質量濃度, 并稀釋至50 ng/μL, 存于–20℃冰箱中備用。

引物詳細信息見表 1, 引物均由武漢天一輝遠基因科技有限公司合成。

PCR反應體系總體積25 μL: 10×Buffer 2.5 μL,dNTP 1 μL, 引物2 μL, 50 ng/μL DNA 2 μL, rTaq0.2 μL,ddH2O 17.3 μL。PCR擴增反應程序: 94℃預變性4min; 94℃變性30s, 54—65℃退火30s, 72℃延伸1min, 30個循環(huán); 72℃延伸5min, 4℃終止延伸5min。

STR基因分型委托上海翼和應用生物技術有限公司完成。采用美國ABI公司的PRISM3730測序儀進行STR序列分析。

1.3 數據分析

每個個體的基因型通過STR基因分型確定, 根據等位基因的大小, 按照從小到大按字母排序。Na、Ne、Ho、He、Shannon指數(I)、Nei氏遺傳距離和遺傳相似度采用Popgene Version1.32軟件計算;等位基因豐度(Ar)采用HP-Rare 1.0軟件計算[18]; 多態(tài)信息含量(PIC)采用Cervus3.0軟件計算。

表 1 羅氏沼蝦16對微衛(wèi)星引物信息Tab. 1 16 pairs of microsatellite primers of M. rosenbergii

群體間遺傳分化指數(Fst)、群體分子方差分析(AMOVA)采用Arlequin 3.5軟件進行[19]。系統(tǒng)樹根據Nei氏遺傳距離通過MEGA 5軟件采用非加權配對算數平均法(UPGMA)構建[20], 群體遺傳結構采用STRUCTURE 2.3.1軟件分析[21]、最佳K值(理論群體數)和群體遺傳結構圖利用在線軟件(http://clumpak.tau.ac.il/)得出。

2 結果

2.1 微衛(wèi)星位點多態(tài)性及群體遺傳多樣性

如表 2所示, 16個位點共檢測出298個Na, 等位基因數介于8—26個, 每個位點平均有17個等位基因。Ne介于3.3432—10.3126, 平均值為6.3777個。I介于1.4339—2.5118, 平均值為2.1662。Ho介于0.1168—0.8095, 平均值為0.4664。He介于0.7033—0.9063, 平均值為0.8316。PIC介于0.6364—0.8152,平均值為0.7328。根據Botstein等[22]的標準,PIC≥0.5為高度多態(tài)性, 本研究中的16個位點均為高度多態(tài)性位點, 說明這些位點均可提供豐富的遺傳信息,可用于羅氏沼蝦群體遺傳多樣性的評估。F檢驗數據顯示, 在16個位點中, 有1個位點的近交系數(Fis)值為負值, 其余15個位點為正值, 表明近交程度較高。16個位點遺傳分化指數(Fst)的平均值為0.0977, 根據Wright[23]建議, 有1個位點遺傳分化程度較大(Fst= 0.1503>0.15), 其余15個位點遺傳分化程度中等(0.05

如表 3所示, DP群的Na(6.4375)、Ne(3.6574)、Ar(5.4524)、He(0.7025)、I(1.4454)和PIC(0.6538)均為最低, 而MP群的Na(13.6875)、Ne(6.2415)和I(2.0680)均為最高。MP群的Ho(0.4505)為最低, CP群的Ho(0.5321)、He(0.8594)、Ar(8.6198)和PIC(0.8048)為最高。所有群體的PIC均大于0.5, 表明群體的遺傳多態(tài)性較高, 具有較大的選擇潛力。5個群體的PIC從高到低排列依次為CP>MP>BD>MN>DP, 與各群體平均等位基因豐度(Ar)的大小順序相吻合,更加說明CP群體具有較高的等位基因豐度, 而DP群體的等位基因豐度相對較低。

2.2 群體的遺傳分化及遺傳距離

如表 4所示, 根據Wright[23]的建議, MP群體與MN群體之間的遺傳分化水平最低(Fst=0.03430),MP群體與MN群體、與BD群體(Fst=0.03876)均屬于低程度的遺傳分化(Fst<0.05)。CP群體與DP群體之間的遺傳分化水平最高(Fst=0.17333), CP群體與DP群體、與MN群體(Fst=0.15495)均屬于較大程度的遺傳分化(0.15

表 2 羅氏沼蝦微衛(wèi)星位點遺傳多樣性參數和基因流的估計Tab. 2 Genetic diversity parameters and the estimates of gene flow among 16 loci of M. rosenbergii

表 3 五個羅氏沼蝦群體的遺傳多樣性Tab. 3 Genetic diversity of five populations of M. rosenbergii

表 4 五個羅氏沼蝦群體間的遺傳分化指數Tab. 4 Matrix of pair-wise Fst values between five populations of M. rosenbergii

如表 5所示, 群體間變異占總變異的6.22%, 且達到顯著水平(P<0.05), 群體內個體間的變異占總變異的40.72%(P<0.05), 個體內部的遺傳變異占總變異的53.07%(P<0.05)。這表明個體間的遺傳變異遠大于群體間的遺傳變異, 遺傳變異主要存在于個體間。Fst值為0.06215, 群體間有中等程度的遺傳分化。

如表 6所示, 5個群體間的Nei氏遺傳距離介于0.1823—1.4184。MN群體與CP群體間的Nei氏遺傳距離最遠(1.4184), 遺傳相似度最低(0.2421)。MN群體與MP群體Nei氏遺傳距離最近(0.1823), 遺傳相似度最高(0.8334)。根據Nei氏遺傳距離構建的UPGMA聚類樹(圖 1), MN群體首先與MP群體聚為一類, 再與DP群體聚為一類, 之后再與BD群體聚為一類, 最后與CP群體聚為一類。

2.3 群體遺傳結構分析

本研究Length of Burn-in Period設置為100000,預設K值(理論群體數)為1—9, 每個K值重復運算10次。采用Evanno等[21]的方法進行分析計算, 得到最佳K值為5, 此時的DeltaK最大, 表明本研究中所有參試個體最佳可劃分為5個理論群(圖 2)。由圖 2可知, DP、MN、BD、CP群體的個體遺傳結構相對獨立, 尤其是CP群體的個體, 而MP群體的個體遺傳結構有一定程度的混雜, 且該群體的遺傳組成多樣化。

表 5 五個羅氏沼蝦群體的分子方差分析Tab. 5 AMOVA analysis among five populations of M. rosenbergii

圖 1 基于Nei’s遺傳距離構建的5個羅氏沼蝦群體的 UPGMA聚類樹Fig. 1 UPGMA clustering tree of five populations of M. rosenbergii based on Nei’s genetic distance

圖 2 羅氏沼蝦群體在K=5下的遺傳結構圖Fig. 2 STRUCTURE genetic cluster analysis for the five populations of M. rosenbergii (K=5)

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性

遺傳多樣性與物種的生存力、適應力和進化潛力密切相關, 是評估種群資源狀況的重要依據[24]。等位基因數、雜合度、多態(tài)信息含量等遺傳參數是反應群體遺傳多樣性的主要參數, 且與遺傳多樣性和基因豐度呈正相關[25,26]。但是, 在樣本量差異較大時利用等位基因數來衡量遺傳多樣性是不準確的, 原因在于等位基因數量(等位基因豐度)高度依賴于樣本的大小: 大樣本比小樣本包含更多的等位基因[27]。本研究中國外群體引種而來, 樣本量較少, 為排除不同群體間較大樣本量差異的影響, 采用HP-Rare軟件實現對等位基因豐度的無偏估計,5個群體的Ar介于5.4524—8.6198。由于等位基因數(Na)依賴于樣本大小的缺陷, 致使期望雜合度(He)更常用于衡量群體的遺傳多樣性[18]。本研究群體的He介于0.7025—0.8594, CP群體的He最高, 為0.8594, 與孫成飛等[16]的報道相比, 介于其泰國1(He=0.881)和泰國2(He=0.848)之間, 其他群體的He都低于孫成飛所報道群體的He(介于0.848—0.896); 與鐘丹丹等[15]的報道相比, 其所研究的兩個群體的He(0.7376和0.7609)處于本研究He的范圍內; 與朱其建等[17]的報道(He介于0.5519—0.7332)相比, 本研究結果偏高; 與Schneider等[12]的報道(He介于0.5794—0.9356)相比, 本研究群體的He處于中等水平; 與Nguyen Thanh等[14]的報道(He介于0.785—0.835)相比, 本研究中的DP群和MN群的He略偏低, 其余群體的He與之基本一致。通過與他人研究結果比較發(fā)現, 本研究中群體的He處于中等水平。戴習林等[17]的研究也表明樣本量與平均等位基因數和平均有效等位基因數呈高度正相關, 與雜合度呈中度相關?？梢酝浦跇颖竞孔銐虻那闆r下, MN、BD和CP群體的等位基因數和雜合度會更高。Qin等[28]研究表明雜合度越高物種遺傳多樣性越豐富, 對環(huán)境的適應能力則越強。當群體雜合度在0.5—0.8即可認為具有較高的多樣性[29], 當PIC>0.5即認為有高度多態(tài)性[22], 5個群體的平均PIC(0.7328)和平均期望雜合度(0.7829)均在0.7以上, 表明各研究群體的遺傳多樣性均處于較高水平, 說明這些群體種質資源良好、有一定的種群穩(wěn)定性, 具有很大的選擇潛力。

本研究中每個群體的Ne均小于Na, 王豐等[30]認為主要是等位基因在群體中分布不均, 導致某些等位基因的頻率不夠均勻。這說明本研究中各群體均存在等位基因分布不均勻的情況, 這種不均勻程度依次為MP>BD>MN>DP>CP。

3.2 群體遺傳分化

遺傳分化指數(Fst)是用來衡量群體間遺傳分化程度的重要參數。5個羅氏沼蝦群體間的Fst值介于0.03430—0.17333, 表明群體間均有不同程度的遺傳分化。MP群與MN群(Fst=0.03430)、與BD群(Fst=0.03876)間遺傳分化較小, 此結果與生產實際相符, MP群為家系的混養(yǎng)群, 緬甸家系的親本就來源于MN群, 孟加拉家系親本來源于BD群。除去MP群, 其余所有群體間均為中等和較大程度的遺傳分化(0.07515≤Fst≤0.17333), 可能因為這些群體分屬不同國家, 由于地域的限制, 基因交流較少, 而呈現出中等和較大程度的遺傳分化。CP群與DP群和MP群間的Fst值分別為0.17333和0.09502, 分屬較大和中等程度的遺傳分化。系統(tǒng)樹顯示DP群和MP群最后與CP群聚為一支。這與孫成飛等[16]的研究結果基本一致, 中國和泰國羅氏沼蝦群體間存在中等程度的遺傳分化, 親緣關系較遠?；蛄?Nm)就是基因在群體間的運動[31], 是引發(fā)群體內和群體間遺傳變異的一個非常重要的來源[32]。Wright[33]認為當Nm大于1時可以抵制因遺傳漂變造成的群體間遺傳分化, 使群體間遺傳分化程度降低。本研究中所有位點Nm均大于1, 其平均值為2.3089, 說明本研究中的5個群體不容易因遺傳漂變而引起種群間的分化。

3.3 群體遺傳結構

STRUCTURE軟件是分析群體遺傳結構的理想工具, 因該軟件不受各群體樣本量的影響, 是基于個體的遺傳組成進行群體模擬分析的[21]。本研究所有個體被劃分為5個理論群體, 圖 2顯示5個樣本群基本獨立成群, 該遺傳結構圖支持聚類結果。MP群是一個不同家系混養(yǎng)群, 故遺傳結構圖顯示該群由多種遺傳背景的個體構成, 有些個體的遺傳成分混雜。該群中緬甸家系個體較多, 所以首先與MN群體聚為一類。DP群是親蝦擴繁群, 包含MP群的親蝦, 即MP群某些個體含DP群的血統(tǒng), 且這些個體數量僅次于緬甸家系個體, 所以MP群與MN群聚為一支后再與DP群聚在一起。MP群中也包含孟加拉家系, 只是孟加拉家系個體稍少, 所以與DP群聚在一起后再與BD群聚在一起。因MP群中無泰國家系, 所以最后與CP群聚在一起。

綜上所述, 本研究結果表明5個羅氏沼蝦群體存在高度的遺傳多樣性, 說明這些群體種質資源狀況良好、有一定的種群穩(wěn)定性, 具有較大的選擇潛力。中國群體與泰國群體親緣關系較遠。所獲得的基于微衛(wèi)星標記的羅氏沼蝦的遺傳數據豐富了羅氏沼蝦的遺傳信息, 對于制定行之有效的選育和保護策略有一定的參考價值。