張曉紅

摘 要：對(duì)美術(shù)繪畫(huà)作品中的膠結(jié)物進(jìn)行成分分析，是繪畫(huà)作品保護(hù)和修復(fù)工作的基礎(chǔ)。文章以桃膠為例，對(duì)美術(shù)繪畫(huà)作品非蛋白質(zhì)類(lèi)膠結(jié)物免疫法檢測(cè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果表明：使用0.05M NaCl洗脫桃膠糖蛋白粗提產(chǎn)物，能夠獲得最高的蛋白質(zhì)式樣占比;實(shí)驗(yàn)樣本桃膠抗血清效價(jià)均能夠達(dá)到1：240000，試樣1相比試樣2略低;在抗體靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)樣本可檢測(cè)最大稀釋倍數(shù)分別為105、106的桃膠抗原，差距明顯;對(duì)抗體靈敏度較高的試樣2進(jìn)行抗體特異性檢測(cè)，該試樣抗血清對(duì)桃膠、大漆的反應(yīng)活性較高，能夠檢測(cè)濃度低至10-6的桃膠抗原以及10-9的大漆。

關(guān)鍵詞：繪畫(huà)作品;膠結(jié)物;抗體靈敏度;特異性檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ620.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1001-5922（2020）10-0039-04

Abstract：The composition analysis of cement in fine arts and paintings is the basis for the protection and restoration of paintings. Taking peach gum as an example， this paper makes an experimental analysis on the immunoassay of non protein cement in art and painting works. The results show that the highest proportion of protein pattern can be obtained by eluting the crude product of peach gum protein with 0.05MNaCl; the peach gum antiserum titer of the experimental samples can reach 1：240000， and the sample 1 is slightly lower than the sample 2; in the antibody sensitivity test， the experimental samples can detect peach gum antigens with the maximum dilution factor of 105 and 106 respectively， and the difference is obvious; the antibody specificity test is carried out on sample 2 with high antibody sensitivity. The antiserum of this sample has high reaction activity to peach gum and lacquer， and can detect the peach gum antigens with the concentration as low as 10-6 and lacquer with the concentration as low as 10-9.

Key words：painting works; cement; antibody sensitivity; specificity test

0 引言

膠結(jié)物是各類(lèi)型美術(shù)繪畫(huà)作品（包括油畫(huà)、壁畫(huà)、彩繪等）顏料層的重要組成部分[1]。繪畫(huà)創(chuàng)作人員經(jīng)常使用天然生物材料如蛋清、桃膠、動(dòng)物皮膠等材料用作繪畫(huà)創(chuàng)作中顏料的調(diào)和劑。針對(duì)美術(shù)繪畫(huà)作品中的膠結(jié)材料進(jìn)行成分分析，不僅能夠?qū)δ承┱湎±L畫(huà)作品的創(chuàng)作歷程進(jìn)行追溯，同時(shí)還能夠有效解決美術(shù)繪畫(huà)作品加固和保存防護(hù)難題，對(duì)于美術(shù)事業(yè)的發(fā)展具有重要的技術(shù)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，由于一般美術(shù)繪畫(huà)作品中膠結(jié)物的含量較少且雜質(zhì)多、易老化流失，一般的膠結(jié)材料檢測(cè)技術(shù)難以對(duì)美術(shù)繪畫(huà)作品中的膠結(jié)物成分進(jìn)行準(zhǔn)確分析。

免疫分析技術(shù)是在現(xiàn)代分子生物學(xué)基礎(chǔ)上，利用抗體與抗原之間的特異反應(yīng)所構(gòu)建的一種新式膠結(jié)材料檢測(cè)手段，能夠以極高的靈敏度檢測(cè)某物質(zhì)中的生物源分子，從而進(jìn)行有效的膠結(jié)材料成分鑒別[2]。文章基于免疫法原理，對(duì)該方法在美術(shù)繪畫(huà)作品膠結(jié)物成分檢測(cè)工作中的應(yīng)用效果進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：利用免疫法在美術(shù)繪畫(huà)樣品和橫截面切片上進(jìn)行非蛋白質(zhì)類(lèi)膠結(jié)物檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確判斷該繪畫(huà)作品各層中摻加的有機(jī)膠結(jié)物信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

一般繪畫(huà)用品常用蛋白質(zhì)類(lèi)膠結(jié)材料有：蛋清、牛乳、動(dòng)物皮膠等蛋白質(zhì)類(lèi)膠結(jié)材料以及桃膠、桐油、櫻桃膠、松香等非蛋白質(zhì)類(lèi)膠結(jié)材料[3]。利用免疫法對(duì)蛋白質(zhì)類(lèi)膠結(jié)物的研究和技術(shù)已經(jīng)比較成熟，而針對(duì)非蛋白質(zhì)類(lèi)膠結(jié)物方面的檢測(cè)研究則相對(duì)較少，技術(shù)也相對(duì)匱乏。本試驗(yàn)選擇產(chǎn)自我國(guó)湖北隨州市的美術(shù)繪畫(huà)用特級(jí)桃膠作為實(shí)驗(yàn)用主要原材料。不同樹(shù)種桃膠中多糖的單糖組成以及蛋白質(zhì)、雜質(zhì)的含量各不相同，本實(shí)驗(yàn)用桃膠主要成分含量如表1所示[4]。

除表1中所需實(shí)驗(yàn)用桃膠原材料外，本試驗(yàn)所需實(shí)驗(yàn)試劑和儀器籌備情況見(jiàn)表2。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

桃膠與阿拉伯膠相似，均屬酸性多糖且主要成分均由半乳糖、阿拉伯糖等構(gòu)成[5-7]。利用免疫法對(duì)繪畫(huà)作品中的阿拉伯膠成分進(jìn)行檢測(cè)的研究較為為多見(jiàn)，如英國(guó)切斯特大學(xué)同一課題組分別于2004年、2006年和2010年運(yùn)用不同方法對(duì)阿拉伯膠、熟化處理阿拉伯膠以及魔芋葡甘聚糖等的多糖成分進(jìn)行抗體特異性分析，得到了可以用于檢測(cè)阿拉伯膠的針對(duì)性抗體[8、9]。為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程、提升實(shí)驗(yàn)可信度，本次實(shí)驗(yàn)采用仿照該課題組實(shí)驗(yàn)方法，按1.3實(shí)驗(yàn)步驟培養(yǎng)特異性針對(duì)桃膠的抗體。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

對(duì)桃膠原材料進(jìn)行提純，得到待檢測(cè)的桃膠糖蛋白;將所得試樣分別注入兔子1號(hào)、2號(hào)實(shí)驗(yàn)體內(nèi)進(jìn)行多克隆抗體培養(yǎng);將抗體培養(yǎng)工作交由陜西嘉禾生物科技股份有限公司進(jìn)行。具體提純過(guò)程如下：

1）粗提。將桃膠進(jìn)行粉碎并進(jìn)行90℃條件下的熱水浴;擱置12h后進(jìn)行抽濾并提取濾液。

2）凍干。利用默克 美國(guó)密理博公司生產(chǎn)的最新10kDa超濾管對(duì)濾液進(jìn)行過(guò)濾濃縮;按照V濾液/V乙醇=1/3加入乙醇溶液，置于冷藏箱中（t=5℃）進(jìn)行12h靜置后進(jìn)行過(guò)濾、取沉淀，將獲取沉淀物放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干。

3） DEAE-52纖維素預(yù)處理.取50g纖維素試樣按照V纖維素/V蒸餾水=1/10比例進(jìn)行浸泡（T=1h）。在纖維素得到充分溶脹后進(jìn)行洗滌，去除溶液中的懸浮顆粒;對(duì)溶液進(jìn)行抽濾后用0.5mol/L的NaOH溶液進(jìn)行浸泡（T=1h），再用蒸餾水反復(fù)沖洗至溶液PH=7;用0.5mol/L的HCl溶液進(jìn)行浸泡（T=1h），再用蒸餾水反復(fù)沖洗至溶液PH=7;最后再用0.5mol/L的NaOH溶液進(jìn)行浸泡（T=1h），再用蒸餾水反復(fù)沖洗至溶液PH=7;經(jīng)過(guò)“堿-酸-堿”反復(fù)處理后，纖維素將與溶液中的OH-離子進(jìn)行結(jié)合，從而獲得與桃膠中的糖蛋白陰離子進(jìn)行交換的能力。對(duì)所得溶液進(jìn)行裝柱、平衡處理，獲得能夠進(jìn)行柱層析上樣的溶液。

4）上樣、洗脫和收集。取V=2ml的柱層析上樣溶液，按照洗脫速度為0.5mL/min條件進(jìn)行洗脫處理。首先，以0.002Mtris-HCL溶液作為緩沖液，對(duì)桃膠溶液試樣中未完全被吸附的桃膠糖蛋白進(jìn)行洗脫;其次，利用0.05M～0.40M的NaCl溶液進(jìn)行洗脫;最后用分部收集器對(duì)最終洗脫所得的溶液進(jìn)行收集，每管收集6mL。

5）檢測(cè)：①紫外分光光度法檢測(cè)蛋白質(zhì)。利用紫外分光光度計(jì)對(duì)桃膠式樣進(jìn)行糖蛋白檢測(cè)，利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基苯環(huán)共軛體系對(duì)紫外光波段的吸收特征，選擇275至280nm波段中的最大值進(jìn)行檢測(cè)，得到溶液中桃膠糖蛋白質(zhì)的濃度;②苯酚-硫酸法檢測(cè)糖類(lèi)。該法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，再以比色法進(jìn)行糖類(lèi)測(cè)定的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖蛋白分離純化

利用DEAE-52纖維素對(duì)檢測(cè)桃膠試樣進(jìn)行糖蛋白純化，得到圖1所示的桃膠糖蛋白洗脫曲線(xiàn)圖。

由圖1中數(shù)據(jù)可知，利用DEAE-52纖維素對(duì)桃膠蛋白進(jìn)行洗脫的過(guò)程中，四種比例的纖維素均能夠獲得洗脫峰，但0.05M NaCl處獲得洗脫峰值最高，峰面積最大;0.1M NaCl處獲得洗脫峰值最低，峰面積最小。說(shuō)明在0.05處所得到的桃膠蛋白比例最高。因此，本試驗(yàn)將0.05處洗脫所得試樣進(jìn)行乙醇沉淀，得到能夠用于抗血清培養(yǎng)的純化蛋白質(zhì)。

2.2 抗血清效價(jià)測(cè)定

以1、2號(hào)兩只實(shí)驗(yàn)用兔子為例進(jìn)行間接ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià)。得到表3所示的桃膠抗血清效價(jià)結(jié)果。

根據(jù)測(cè)定的OD450-630來(lái)確定兩試樣的抗血清效價(jià)原則可知，試樣測(cè)定OD450-630數(shù)值大于BSA數(shù)值情況下，即可認(rèn)定試樣效價(jià)抗血清稀釋倍數(shù)能夠達(dá)到效價(jià)要求[10]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)可知，兩試樣的效價(jià)均能夠達(dá)到1：240000。其中2號(hào)試樣的抗血清效價(jià)略高于1號(hào)試樣。

2.3 抗體靈敏度檢測(cè)

按照1：500條件對(duì)桃膠溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)瑥亩鴻z測(cè)試樣對(duì)不同抗原稀釋倍數(shù)的響應(yīng)值，從而測(cè)定1、2號(hào)試樣抗體靈敏度，最終得到表4所示兩試樣桃膠抗體靈敏度結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4中數(shù)據(jù)可知，同等桃膠稀釋倍數(shù)條件下1號(hào)試樣抗血清的響應(yīng)值相對(duì)2號(hào)而言略低，在桃膠稀釋倍數(shù)超過(guò)1：105（不含）以后不再具備可以實(shí)際應(yīng)用的桃膠抗體靈敏度;2號(hào)試樣在桃膠稀釋倍數(shù)超過(guò)1：106（不含）以后不再具備可以實(shí)際應(yīng)用的桃膠抗體靈敏度，比1號(hào)試樣情況略好。

2.4 抗體特異性檢測(cè)

由于2號(hào)試樣對(duì)桃膠稀釋溶液的抗體靈敏度更高，因此本試驗(yàn)在抗體特異性檢測(cè)環(huán)節(jié)選擇2號(hào)試樣作為實(shí)驗(yàn)樣本，分別進(jìn)行桃膠、大漆、動(dòng)物膠、蛋清、牛乳、松香、蜂蠟等的反應(yīng)活性檢測(cè)。按照抗原濃度和抗體濃度分別為1：1000和1：500進(jìn)行檢測(cè)，得到圖2所示檢測(cè)結(jié)果。

由圖2可知，2號(hào)試樣抗血清對(duì)動(dòng)物膠、蛋清等的反應(yīng)活性較低，但是對(duì)桃膠和大漆的反應(yīng)活性較高。本試驗(yàn)根據(jù)這一結(jié)果重新進(jìn)行桃膠和大漆的反應(yīng)活性對(duì)比實(shí)驗(yàn)，得到表5所示結(jié)果。

由表5中數(shù)據(jù)可知，2號(hào)試樣抗體血清在檢測(cè)濃度低至1：106桃膠稀釋溶液時(shí)仍能夠保持較高的反應(yīng)活性，檢測(cè)效果優(yōu)秀;然而該血清在對(duì)大漆稀釋溶液進(jìn)行抗體檢測(cè)時(shí)能夠檢測(cè)最低達(dá)1：109的大漆抗原。表明該抗血清盡管能夠準(zhǔn)確檢測(cè)桃膠抗原但是一旦檢測(cè)過(guò)程中溶液混合了大漆抗原，則容易影響檢測(cè)精度，無(wú)法幫助檢測(cè)人員獲得精準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果。

3 結(jié)語(yǔ)

在充分吸收西方相關(guān)學(xué)者研究經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)提出了一套非蛋白質(zhì)類(lèi)膠結(jié)物的檢測(cè)方法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析可知：

1） 0.05M NaCl處洗脫所得桃膠試樣進(jìn)行乙醇沉淀，能夠得到能夠用于抗血清培養(yǎng)的最佳純化蛋白質(zhì);

2）對(duì)試樣1、2號(hào)兔子進(jìn)行抗血清效價(jià)測(cè)定，兩試樣的效價(jià)均能夠達(dá)到1：240000。其中2號(hào)試樣的抗血清效價(jià)略高于1號(hào)試樣。

3）在抗體靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，2號(hào)試樣能夠在桃膠稀釋倍數(shù)超過(guò)1：106之前具備可以實(shí)際應(yīng)用的桃膠抗體靈敏度，比1號(hào)試樣情況略好。

4）在抗體特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，2號(hào)試樣能夠?qū)μ夷z呈現(xiàn)出非常高效的反應(yīng)活性，但對(duì)大漆抗原的反應(yīng)活性更高。

綜合分析，利用免疫法對(duì)美術(shù)繪畫(huà)作品中的非蛋白質(zhì)類(lèi)膠結(jié)物進(jìn)行檢測(cè)，能夠獲得較好的檢測(cè)精度和反應(yīng)活性，但是一旦該繪畫(huà)作品中存在大漆抗原，則檢測(cè)結(jié)果并不完全可靠。

參考文獻(xiàn)

[1] 胡文靜，張秉堅(jiān).古代彩繪文物膠結(jié)材料免疫分析技術(shù)[J].自然雜志，2015，37（5）：332-340.

[2] FANG S Q， ZHANG H， ZHANG B J， et al. The identification of organic additives in traditional lime mortar [J]. Journal of Cultural Heritage， 2014， 15： 144-150.

[3] JOHNSON M， PACKARD E. Methods used for the identification of binding media in Italian paintings of the fifteenth and sixteenth centuries [J]. Studies in Conservation， 1971， 16： 145-164.

[4] 梁美宜，蔡延渠，董碧蓮，等不同產(chǎn)地桃膠多糖的體外抗氧化活性研究[J]. 現(xiàn)代食品，2019（16）：185-188.

[5] 蔡延渠，董碧蓮，陳利秋，等桃膠多糖體內(nèi)外抗氧化作用的研究[J] 食品工業(yè)科技，2020（2）：13.

[6] 鄭秦， 吳小鋒， 鄭海玲. 利用絲素蛋白抗體鑒定古代絲織品[J].蠶業(yè)科學(xué)， 2014， 40（3）： 520-526.

[7] 陳冬梅，司長(zhǎng)代，龍世佳.光譜技術(shù)在文物繪畫(huà)用膠結(jié)材料中的研究進(jìn)展[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2020，40（3）：961-966.

[8] Micro FTIR imaging for the investigation of deteriorated organic binders in wall painting stratigraphies of different techniques and periods[J] . Sophia Sotiropoulou，Zoi Eirini Papliaka， Lisa Vaccari.? Microchemical Journal . 2016

[9] H.E. Ireland， A. Clutterbuck， J.P Cloquet， et al. The development of immunoassays to identify and quantify species source of gumarabic[J]. JournalofAgriculturaland Food Chemistry， 2004， 52（26）： 7804-7808.

[10]顏菲， 葛琴雅. 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）初探古代墓葬壁畫(huà)膠結(jié)材料中的狗膠原蛋白[J]. 文物保護(hù)與考古科學(xué)， 2014，26（1）： 71-75.