謝慧，武釗，吳琳英，趙凱，李霜，歐陽(yáng)斌，黃偉青

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510120；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，昆明 650032；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，廣州 510120；4.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)，廣州 510120)

心臟驟停是急診醫(yī)學(xué)中常見(jiàn)的急癥之一，因其居高不下的致死率及致殘率給社會(huì)和家庭造成嚴(yán)重威脅。自2010年開(kāi)始，國(guó)際心肺復(fù)蘇指南著重強(qiáng)調(diào)對(duì)于自主循環(huán)恢復(fù)后的高級(jí)生命支持。其中，以腦復(fù)蘇為重點(diǎn)的后期復(fù)蘇階段的處理，一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱門(mén)課題。心臟驟停后引起的腦損害的病理生理主要是缺血缺氧性腦損傷以及自主循環(huán)恢復(fù)后的大腦缺血-再灌注損傷，近年研究發(fā)現(xiàn)，δ阿片受體激動(dòng)劑可以誘導(dǎo)心肌冬眠和加強(qiáng)對(duì)缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用。人工合成的δ阿片受體激動(dòng)劑[d-丙氨酸2，d-亮氨酸5] 腦啡肽[(d-Ala2，d-Leu5)enkephalin，DADLE]在神經(jīng)保護(hù)領(lǐng)域的作用也逐漸得到重視[1]。DADLE對(duì)全腦缺血經(jīng)藥物處理保護(hù)作用是否具有濃度相關(guān)性，筆者尚未見(jiàn)研究[2]。因此，筆者在本研究旨在建立一種快速、簡(jiǎn)便的大鼠腦組織液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)定量檢測(cè)方法，并應(yīng)用于全腦缺血-再灌注模型大鼠腦組織中DADLE濃度的檢測(cè)，為探索DADLE的腦組織保護(hù)作用與其濃度之間是否存在量效關(guān)系提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1儀器 島津超高效液相色譜儀(Nexera UHPLC LC-30A)，菲羅門(mén)公司C18色譜柱(2.0 mm×50 mm，5 μm)。美國(guó)AB公司API 4000液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，AnaLyst 1.6數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))；Millipore Simplicity純水機(jī)； BT25S電子天平(賽多利斯儀器公司，感量：0.01mg)；湘儀H1750臺(tái)式高速離心機(jī)；冠森XH-D旋渦混合器；容聲BCD-229S/EA電冰箱。

1.2樣品與試劑 [d-丙氨酸2，d-亮氨酸5] 腦啡肽(DADLE)對(duì)照品(貨號(hào)：D193335，純度≥95%，多倫多研究化學(xué)品公司)；甲醇為色譜純(色譜純，F(xiàn)isher公司)；甲酸(質(zhì)譜級(jí)，Thermo Fisher公司)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(粵)2016-0167。于室內(nèi)溫度(23±1.5) ℃、相對(duì)濕度(65±10)%環(huán)境中，12 h日夜交替照明，正常飲食飲水適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4色譜條件 色譜柱為Gemini C18(50 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為水相(含0.1%甲酸水溶液)；流動(dòng)相B為有機(jī)相(含0.1%甲酸甲醇溶液)。流速為0.4 mL·min-1，梯度洗脫：0～0.3 min，5%B；>0.3～0.6 min，5%→95%B，>0.6～2.1 min，95%B，>2.1～2.6 min，95%→5%B，>2.6～4 min，5%B。

1.5質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式下，多離子監(jiān)控模式(multi reaction monitoning，MRM)，DADLE檢測(cè)離子對(duì)為m/z570.2→120.4及570.2→136.3，毛細(xì)管電壓5500 V，碰撞能54V(圖1)。

1.6溶液配制 精密稱取并配置DADLE母液1 mg·mL-1(50%甲醇)，臨用前使用空白腦組織稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控樣品。

1.7腦組織取樣及樣品處理 在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)，抓取大鼠并處死，沿枕骨內(nèi)壁中線剪開(kāi)顱骨暴露大腦，取完整腦組織置于研缽，加入適量液氮研磨勻漿后迅速置入1.5 mL離心管，-20 ℃凍存待測(cè)。檢測(cè)時(shí)將腦組織樣品置于常溫融化后，取腦組織樣品100 μL，加入甲醇-水(1：1)5 μL，渦旋混合，加入甲醇200 μL，渦旋混合，14 000×g離心30 min，取上清液10 μL進(jìn)樣分析。

1.8全腦缺血-再灌注模型大鼠腦組織濃度實(shí)驗(yàn) 采用前期已建立的二血管阻斷加低血壓法構(gòu)建全腦缺血-再灌注大鼠模型[3-5]。造模成功后，單次經(jīng)左側(cè)頸靜脈給藥，給藥劑量為2，5，10 mg·kg-1，于給藥后10，120 min處死小鼠，取腦組織，按“1.7”項(xiàng)下方法處理分析進(jìn)樣。

圖1 DADLE二級(jí)碎片特征子離子全掃描

2 結(jié)果

2.1方法選擇性 取6個(gè)不同個(gè)體的空白腦組織100 μL，按“1.7”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣 10 μL，得空白腦組織樣品色譜圖；配制0.1 ng·mL-1濃度的腦組織樣品，依同法操作，DADLE的保留時(shí)間約為1.5 min。結(jié)果表明腦組織樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾DADLE的測(cè)定(圖2)。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限 取空白腦組織，配制成相當(dāng)于DADLE腦組織濃度依次為1.00，2.0，5.0，20，100，500和 1000 ng·mL-1的樣品，按“1.7”項(xiàng)下依法操作。以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物的峰面積為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程為Y=940.6660X-255.5192(r=0.995 2)。DADLE在0.1～1000 ng·mL-1線性關(guān)系良好，定量下限0.1 ng·mL-1，精密度為13.5%，相對(duì)誤差為2.0%。

2.3精密度與準(zhǔn)確度 取空白腦組織配制的低、中、高3個(gè)濃度(DADLE腦組織濃度分別為2.0，20和800 ng·mL-1)的質(zhì)量控制(quality control,QC)樣品，每一濃度進(jìn)行 6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3個(gè)批次，根據(jù)當(dāng)批次的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算QC樣品的測(cè)得濃度計(jì)算本法的準(zhǔn)確度與精密度(表1)。LC-MS/MS外標(biāo)法測(cè)得DADLE在每一QC濃度水平的日內(nèi)精密度RSD<10.0%，日間精密度RSD<11.6%，準(zhǔn)確度在95.81%～99.19%。

圖2 空白腦組織(A)及0.1 ng·mL-1 DADLE(B)色譜圖

表1 DADLE在大鼠腦組織中的精密度與準(zhǔn)確度

2.4回收率與基質(zhì)效應(yīng) 取空白腦組織配制的低，中，高濃度QC樣品(腦組織中DADLE濃度分別為2.0，20和800 ng·mL-1)。同時(shí)另取空白腦組織及超純水各100 μL，按“1.7”項(xiàng)下操作，向獲得的全部上清液中分別加入低、中、高濃度對(duì)照品溶液5.0 μL，渦流混合后，14 000×g離心30 min，取上清液10 μL進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)峰面積。以每一濃度不同處理方法的峰面積比值計(jì)算處理回收率及基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明低、中、高QC樣品處理回收率分別為(66.1±8.4)%，(72.3±5.5)%，(78.4±0.95)%，RSD分別為12.7%，8.8%，1.2%；基質(zhì)效應(yīng)分別為(104.0±12.6)%，(97.9±4.8)%，(91.3±3.7)%，RSD分別為12.1%，7.3%，4.0%。

2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)考察DADLE腦組織樣品室溫放置6 h的穩(wěn)定性、經(jīng)蛋白沉淀處理后在自動(dòng)進(jìn)樣器放置24 h的穩(wěn)定性、腦組織樣品經(jīng)歷三次冷凍-解凍循環(huán)、腦組織樣品-80 ℃ 放置30 d的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示DADLE在上述條件下穩(wěn)定性良好。

表2 DADLE在大鼠腦組織中的穩(wěn)定性考察

2.6全腦缺血-再灌注模型大鼠腦組織濃度實(shí)驗(yàn) 模型大鼠單次經(jīng)左側(cè)頸靜脈給藥后10，20 min腦組織DADLE濃度見(jiàn)表3。檢測(cè)結(jié)果提示經(jīng)頸靜脈給藥10 min后，大鼠腦組織中DADLE濃度均處于較低水平(0.13～0.79 ng·mL-1)。在給藥20 min后，DADLE在腦組織中水平有所提高(1.33～2.94 ng·mL-1)。單因素方差分析顯示劑量對(duì)DADLE在腦組織中的濃度具有顯著影響(P<0.05)。但給藥10 min后，腦組織中DADLE的濃度水平與劑量呈反相關(guān)，高劑量10 mg·kg-1組中濃度平均水平僅為(0.13±0.10) ng·mL-1。給藥20 min后，腦組織中DADLE濃度水平隨劑量增加而提升，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.77，P=0.008)。

表3 全腦缺血-再灌注模型大鼠腦組織DADLE濃度

Tab.3 Concentration of DADLE in brain tissue of global cerebral ischemia-reperfusion model rats

表3 全腦缺血-再灌注模型大鼠腦組織DADLE濃度

劑量/(mg·kg-1)給藥后10 min給藥后20 min20.79±0.531.33±0.4550.46±0.412.23±1.10100.13±0.102.94±1.41

3 討論

δ-阿片受體激動(dòng)劑DADLE具有誘導(dǎo)心肌冬眠[6]，心臟、大腦、肺等器官缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用[7-8]。無(wú)論是心臟驟停還是腦梗死，缺血-再灌注損傷均是克服缺氧缺血性腦損傷的中心環(huán)節(jié)[9]。在外源性藥物對(duì)腦組織缺血-再灌注損傷的防護(hù)以外，中樞δ阿片受體的激活則在內(nèi)源性保護(hù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，人工合成的δ阿片受體激動(dòng)劑DADLE有望通過(guò)外源性途徑增強(qiáng)腦組織缺血-再灌注的內(nèi)源性保護(hù)作用。本課題組前期研究中實(shí)踐一種二血管阻斷加低血壓手段建立全腦缺血-再灌注大鼠模型。并在這種方法所構(gòu)建的全腦缺血-再灌注的模型大鼠中發(fā)現(xiàn)DADLE可通過(guò)增加絲/蘇氨酸蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的活化，抑制凋亡調(diào)控蛋白Caspase-3(cysteinyl asparatate specific proteinase 3)、Bax(Bcl-2 associated X)、Bcl-2(B cell lymphoma/leukemia-2)的表達(dá)程度，減少細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生腦保護(hù)等臟器保護(hù)作用[3-5]。

3.1大鼠腦組織中DADLE檢測(cè)方法的選擇 針對(duì)DADLE的定量檢測(cè)方法，多為基于液相系統(tǒng)的分析測(cè)試方法，如高效液相色譜-紫外光譜法、高效液相色譜-熒光光譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]。而腦組織中DADLE含量檢測(cè)面臨著更低檢測(cè)限的挑戰(zhàn)。此外，采用高效液相色譜-熒光光譜法涉及DADLE的柱前熒光衍生，雖然利用多維液相系統(tǒng)、固相萃取前處理方法能夠增加檢測(cè)方法的靈敏度，但同時(shí)也增加樣品前處理的復(fù)雜性和檢測(cè)時(shí)間。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法由于具有較高的靈敏度、選擇性，成為檢測(cè)低濃度DADLE的適宜方法。因此，本研究采用液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜作為分析手段?？紤]到處理動(dòng)物、取腦組織、勻漿等復(fù)雜的取樣過(guò)程，在腦組織樣品的前處理部分，筆者采用簡(jiǎn)便、快捷的蛋白沉淀法。經(jīng)驗(yàn)證，蛋白沉淀前處理方法配合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法可滿足DADLE在腦組織中的定量分析要求，最低定量限低至0.1 ng·mL-1。該方法簡(jiǎn)便、靈敏，可滿足體內(nèi)DADLE在低濃度分布組織中的定量檢測(cè)需求。

3.2定量方法的選擇 目前對(duì)DADLE的缺血-再灌注保護(hù)作用的研究多集中在體外實(shí)驗(yàn)。由于其濃度水平高，檢測(cè)方法多為液相色譜-光譜法[10-11]。而對(duì)腦組織中DADLE含量測(cè)定，由于其低濃度水平，液相色譜-光譜法及液相色譜-質(zhì)譜法均有報(bào)道。在液相色譜-質(zhì)譜法中，報(bào)道均采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，以減少操作及檢測(cè)條件波動(dòng)的影響[12]。然而，內(nèi)標(biāo)法對(duì)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)具有一定的要求，如結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)與分析物類(lèi)似，但又可以分離。同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作也有一定的要求。為了提高腦組織中DADLE含量測(cè)定的可操作性，本研究嘗試使用DADLE對(duì)照品，在完全相同的操作下，使用外標(biāo)法對(duì)腦組織中DADLE進(jìn)行定量分析。通過(guò)線性、準(zhǔn)確度、精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)等指標(biāo)的驗(yàn)證，本方法證實(shí)為一個(gè)簡(jiǎn)便、易操作的腦組織DADLE定量檢測(cè)方法。

3.3液相質(zhì)譜方法條件摸索 本方法采用常規(guī)的水-甲醇體系作為流動(dòng)相。在其中加入0.1%甲酸以適應(yīng)質(zhì)譜離子源正離子模式并控制噴霧酸堿值。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，也顯示含0.1%甲酸的水-甲醇體系用于腦組織樣品測(cè)定時(shí)，較水-乙腈體系具有更少的干擾，基線和色譜峰形較好。質(zhì)譜采用MRM，在碰撞能54 V條件下，選取兩個(gè)碎片離子的離子對(duì)(m/z570.2→136.3、m/z570.2→120.4)對(duì)DADLE進(jìn)行監(jiān)測(cè)。除了文獻(xiàn)報(bào)道的離子對(duì)m/z570.2→136.3以外，考慮到本研究采用外標(biāo)法，增加m/z570.2→120.4離子對(duì)來(lái)對(duì)DADLE進(jìn)行共同監(jiān)測(cè)，通過(guò)兩個(gè)離子對(duì)的共同監(jiān)測(cè)，可排除其他離子干擾，保障對(duì)DADLE的高選擇性。本方法檢測(cè)腦組織中DADLE的濃度，由于腦組織脂溶性成分較高，在前期使用乙酸乙酯液液萃取法進(jìn)行前處理樣品干擾物質(zhì)偏多，且回收率偏低，最低檢測(cè)限偏高。因此，采用在樣品前處理步驟，筆者采用簡(jiǎn)單的甲醇沉淀蛋白方法，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，該方法簡(jiǎn)便，回收率可達(dá)到66%以上。本方法對(duì)腦組織基質(zhì)效應(yīng)的考察中顯示，3個(gè)濃度質(zhì)控樣品其基質(zhì)效應(yīng)控制在91.3%～104%，這可能是由于本方法色譜分離時(shí)間控制在4 min，且采用梯度洗脫的液相方法，減少DADLE保留時(shí)間時(shí)的共流出物成分有關(guān)。雖然有報(bào)道指出，前處理采用固相萃取的方法能夠有效降低檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)[12]。但本研究證明在本方法的條件下，簡(jiǎn)便的蛋白沉淀前處理方法能夠提供不劣于復(fù)雜固相萃取前處理的效果。

3.4檢測(cè)方法的應(yīng)用與結(jié)果分析 在二血管阻斷加低血壓法建立全腦缺血-再灌注模型大鼠中，前期研究經(jīng)頸靜脈給藥后10，20 min大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的變化。因此，筆者檢測(cè)2，5，10 mg·kg-1劑量下經(jīng)頸靜脈注射給藥10，20 min后腦組織中DADLE的含量，并對(duì)照蛋白表達(dá)水平評(píng)分初步探索這種變化是否具有一定的相關(guān)性。雖然DADLE在腦組織中的水平受到劑量的顯著影響，但給藥10 min后中、高劑量組DADLE濃度水平反而較低，而給藥20 min后，腦組織中濃度又與給藥劑量水平呈現(xiàn)一致趨勢(shì)。除了因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物個(gè)體導(dǎo)致的差異以外，筆者推測(cè)DADLE需要一定時(shí)間完成由頸靜脈跨越血腦屏障到達(dá)腦脊液，再分布到全腦組織這一過(guò)程。這一分布的快慢還可能受到腦血流量、腦組織脂肪含量、血腦屏障藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)水平等的影響。這一結(jié)果為后續(xù)研究DADLE腦組織保護(hù)的量效關(guān)系中，采樣時(shí)間點(diǎn)的設(shè)置提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)。在初步的相關(guān)性分析中，Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平與給藥20 min后DADLE腦組織濃度之間存在一定的指數(shù)型線性關(guān)系[Y=0.99ln(X)+0.61，R2=0.999 9]。而明確DADLE腦組織保護(hù)作用的量效關(guān)系模式尚需要進(jìn)一步的研究，包括明確DADLE在大鼠腦組織中分布代謝消除時(shí)間，以及在這個(gè)過(guò)程中相關(guān)信號(hào)通路中蛋白表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化。而本方法的建立則提供一個(gè)快速、簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)的液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜的定量檢測(cè)方法，為后續(xù)探索DADLE腦組織保護(hù)作用的量效關(guān)系提供較好的技術(shù)支撐。