陳明，段萍，徐作剛，萬紅才，劉曉艷

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)教研室，都勻 558000；2.黔南州檢驗檢測院食品藥品檢驗所化學(xué)室，都勻 558000)

烏蕨[Stenolomachusanum(L.) Ching.]為鱗始蕨科烏蕨屬的多年生草本植物，又名大葉金花草、烏韭等，在我國主要分布于長江流域以南各省份。從20世紀(jì)60年代開始，國內(nèi)外即有學(xué)者對烏蕨的主要成分、藥理作用、臨床應(yīng)用等方面進(jìn)行研究。烏蕨植物資源豐富，在醫(yī)藥、畜牧獸醫(yī)、化妝品、園藝栽培等領(lǐng)域均有較大的開發(fā)利用價值。其內(nèi)服治療感冒發(fā)熱、咳嗽、扁桃體炎、腮腺炎、腸炎、痢疾、肝炎、腎炎、食物中毒、農(nóng)藥中毒等；外用可治燒傷、燙傷、皮膚濕疹，近期報道烏蕨還具有降血糖、抗腫瘤的作用[1-5]。烏蕨具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗酪氨酸酶等生物活性，主要與其含有的黃酮類(葒草苷、葒草苷-2-0-B-D-吡喃葡萄糖苷、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、木犀草苷、芹菜素、山柰酚等)，酚酸類(原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、丁香酸等)等化學(xué)成分有關(guān)[6-7]。根據(jù)文獻(xiàn)[8-12]，目前主要采用紫外分光光度法測定烏蕨中總黃酮量；有部分研究采用高效液相色譜(HPLC)法同時測定其1～2種活性成分，但同時測定烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、木犀草苷6種活性成分含量的方法筆者未見報道。本研究建立了HPLC同時測定烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、木犀草苷6種活性成分含量的方法，并采集了24個烏蕨樣本進(jìn)行檢測。報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260 DAD VL高效液相色譜儀，DAD紫外檢測器，美國安捷倫科技有限公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀，DAD紫外檢測器，美國賽默飛世爾科技公司；賽默飛(Thermo)A型C18(5.0 mm×250 mm，5 μm)色譜柱； Mettler AG 135(感量：0.01 mg)、AL204電子天平(感量：0.1 mg)，瑞士梅特勒-托利多公司；SK250LHC超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)儀器有限公司。

1.2試藥 原兒茶酸對照品(批號：110809-201205，含量99.9%)，原兒茶醛對照品(批號：110810-200205，含量100.0%)，葒草苷對照品(批號：111777-201302，含量97.9%)，牡荊素鼠李糖苷對照品(批號：111668-200602，含量100.0%)，牡荊素對照品(批號：111687-201603，含量95.7%)，木犀草苷對照品(批號：111720-201106，含量99.3%)，均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司色譜純、分析純)；娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

本實驗采集到不同批次的烏蕨24批，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院何順志教授鑒定為鱗始蕨科烏蕨屬Stenolomachusanum(L.)Ching.的干燥品。采割地上部分晾干，粉碎，過三號篩，置干燥器中保存，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1對照品溶液制備 精密稱取葒草苷21.33 mg、牡荊素鼠李糖苷24.84 mg、木犀草苷16.53 mg分別置50 mL量瓶中，原兒茶醛10.62 mg、牡荊素20.33 mg分別置100 mL量瓶中，原兒茶酸10.13 mg置25 mL量瓶中，分別加65%乙醇超聲溶解，放冷，加65%乙醇至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。分別精密量取儲備液加65%乙醇制成每毫升含原兒茶酸0.080 96 mg、原兒茶醛0.031 86 mg、葒草苷0.041 76 mg、牡荊素鼠李糖苷 0.119 2 mg、木犀草苷 0.013 13 mg、牡荊素0.038 91 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備[11]烏蕨粉末約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入65%乙醇50 mL，稱定重量，超聲30 min(53 kHz)后，水浴加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用65%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2色譜條件[12-14]采用賽默飛A型C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)為流動相，梯度洗脫：0～5 min(8%A)，5～15 min(8%A→10%A)，15～30 min(10%A→27%A)，30～31 min(27%A→8%A)，31～40 min(8%A)，同時設(shè)定兩個檢測波長，原兒茶酸、原兒茶醛檢測波長為280 nm，葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、木犀草苷檢測波長為350 nm。柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1，精密量取5 μL注入液相色譜儀。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專屬性實驗 精密量取混合對照品溶液和供試品溶液各5 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，各色譜峰分離度均符合要求(大于1.5)。色譜圖見圖1。

2.3.2線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液2，5，8，10，15 μL，注入液相色譜儀，按“2.2”項下的色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量數(shù)(μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸計算。原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、木犀草苷含量均與峰面積線性關(guān)系良好。見表1。

2.3.3精密度考察 取“2.1.1”項下的對照品溶液，按“2.2”項下色譜方法，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、木犀草苷峰面積的RSD分別為0.18%，0.26%，0.31%，2.09%，1.11%，2.09%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性考察 取供試品溶液(批號：20140728)，分別于0，2，8，12，24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量5 μL，測定峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、木犀草苷的RSD分別為2.13%，1.87%，1.67%，1.03%，2.56%，2.22%。說明供試液在24 h內(nèi)均很穩(wěn)定。

2.3.5重復(fù)性考察 取烏蕨樣品(批號：20140728)按“2.1.2”項下方法平行配制6份供試品溶液，取“2.1.1”項下的對照品溶液，按“2.2”項下方法測定峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、木犀草苷的平均含量分別為0.9689，0.6552，1.1995，2.4594，1.1587，0.5745 mg·g-1，RSD分別為 1.83%，1.48%，1.53%，1.36%，1.39%，2.04%。

A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 1.原兒茶酸；2.原兒茶醛；3.葒草苷；4.牡荊素鼠李糖苷；5.牡荊素；6.木犀草苷。

表1 原兒茶酸等6種成分線性關(guān)系結(jié)果

2.3.6加樣回收率實驗 精密稱取已測定含量的樣品(批號：20140728)約1.0 g，共6份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入原兒茶酸(15.36 mg→500 mL)、原兒茶醛(6.30 mg→500 mL)、葒草苷(13.77 mg→500 mL)、牡荊素鼠李糖苷(12.00 mg→500 mL)、牡荊素(11.68 mg→500 mL)、木犀草苷(16.53 mg→50 mL，取20.00 mL→500 mL)(濃度分別為0.030 69，0.012 60，0.026 96，0.024 00，0.022 36，0.013 13 mg·g-1)的混合對照品溶液50 mL，按“2.1.2”項下方法配制供試品溶液，按“2.2”項下方法測定峰面積。6種活性成分的加樣回收率結(jié)果見表2。

2.3.7樣品測定 取24批樣品按“2.1.2”項下方法配制供試品溶液，取“2.1.1”項下的對照品溶液，按“2.2”項下方法測定上述6種活性成分的含量。測定結(jié)果見表3。

3 討論

烏蕨活性成分較多，通過紫外掃描，酚酸類主要成分原兒茶酸、原兒茶醛在280 nm有最大吸收或較大吸收；而黃酮類主要活性成分葒草苷、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、木犀草苷在350 nm有較大或最大吸收。在280 nm能夠檢測出6個指標(biāo)成分，但在此波長檢測黃酮類主要活性成分，干擾峰較多，峰純度較低。本實驗條件下其他干擾峰吸收減小或無吸收，能夠排除干擾，達(dá)到峰純度檢測要求，因此同時設(shè)定兩個檢測波長測定6個活性成分，方法簡單，結(jié)果準(zhǔn)確。

嘗試選擇乙腈-水、甲醇-0.1%醋酸及乙腈-0.4%磷酸3種流動相進(jìn)行HPLC梯度洗脫，結(jié)果顯示，乙腈-水、甲醇-0.1%醋酸作流動相，所得部分色譜峰的峰形拖尾，分離度較差；乙腈-0.4%磷酸作流動相，各成分分離度符合要求，所得峰形較好，故選擇乙腈-0.4%磷酸作為烏蕨HPLC分析測定的流動相。

通過測定多批次不同季節(jié)、不同地區(qū)的烏蕨中6種活性成分的含量，可為篩選黃酮含量高的優(yōu)良種源提供參考，也可為今后人工栽培選取優(yōu)良品種。

本方法簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性、穩(wěn)定性較好，有助于烏蕨質(zhì)量控制水平的提高。

表2 原兒茶酸等6種成分回收率實驗結(jié)果

表3 烏蕨樣品測定結(jié)果