夏芮東，孫加琳，尹瑞娟，隋忠國，

(1.青島大學(xué)藥學(xué)院，青島 266071；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，青島 266000；3.中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，青島 266003)

姜黃素是一類從姜黃中提取的植物多酚[1]。大量研究表明，姜黃素具有抑制腫瘤細(xì)胞活性、降低遷移侵襲能力、誘導(dǎo)自噬及促進(jìn)凋亡等作用，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值[2-4]。但姜黃素具有水溶性較差、生物利用度低、代謝率高等缺點(diǎn)，極大地限制其臨床開發(fā)和使用[5-6]。因此以姜黃素為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理的結(jié)構(gòu)改造，獲取具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗腫瘤藥物具有較好的研發(fā)前景。本團(tuán)隊(duì)前期通過在姜黃素結(jié)構(gòu)骨架基礎(chǔ)上，先后進(jìn)行嘧啶環(huán)取代和四甲基異硫脲取代得到了新型異硫脲修飾姜黃素嘧啶類衍生物(簡稱1g)[7]。本實(shí)驗(yàn)通過人結(jié)腸癌HCT116和HT29細(xì)胞株開展了1g對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲和自噬的作用研究，并進(jìn)一步探討其發(fā)揮作用的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116(批號：TCHu99)、HT29(批號：SCSP5032)細(xì)胞來自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；1g來自中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院；Transwell小室(批號：3422)購自美國Corning公司；CD147克隆載體(批號：G114754)購自長沙優(yōu)寶生物公司；胎牛血清(FBS，批號：FNA500)購自上海依科賽生物公司；RIPA裂解液(批號：P0013E)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0012)、CCK-8檢測試劑盒(批號：C0042)購自上海碧云天生物；PI3K抑制劑LY294002(批號：HY-10108)購自美國MCE公司； CD147(批號：A1566)購自武漢Abclonal有限公司；AKT(批號：AF6261)、p-AKT(批號：AF0016)、GAPDH(批號：AF7021)購自江蘇Affinity有限公司；兔抗LC3(批號：2775)購自美國CST有限公司；兔抗PI3K(批號：ab191606)、p-PI3K(批號：ab182651)購自英國abcam有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 離心機(jī)(5415D)購自德國艾本德公司；光學(xué)顯微鏡(E100)購自日本尼康公司；超低溫冰箱(DW-86L388J)購自中國海爾公司；微量移液器(3120)購自德國艾本德公司；透射電鏡(Tecnai G2 F20)購自美國FEI公司；電子天平(CPA，感量0.1 mg)購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱(MCO-18AIC)購自日本三洋公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29細(xì)胞在含10%FBS、1%青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長，并置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況，2～3 d傳代1次，用0.25%胰酶消化，取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4siRNA序列合成及過表達(dá)載體構(gòu)建 siRNA序列合成根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中CD147基因登記號NM_198589.1及siRNA設(shè)計(jì)原則，使用siRNA在線設(shè)計(jì)工具(http：//sidirect2.rnai.jp/)設(shè)計(jì)CD147基因的siRNA(CCUCACCUGCUCCUUGAAU)，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。CD147過表達(dá)載體構(gòu)建通過用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamHI將克隆質(zhì)粒pDONR223-CD147與pCMV3.1過表達(dá)載體分別進(jìn)行雙酶切，然后將酶切產(chǎn)物用連接酶連接構(gòu)建CD147-pCMV3過表達(dá)載體，構(gòu)建的CD147-pCMV3過表達(dá)載體進(jìn)行DNA測序鑒定。

1.5CCK-8實(shí)驗(yàn) 分別取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的HCT116、HT29細(xì)胞，用含10% FBS及1%青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到1×105個(gè)·mL-1，接入96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)分2組，即正常組和1g組。其中1g組分別加入不同濃度的1g(1，2，4，6，8，10，12，14 μmol·L-1)，另每組設(shè)空白對照孔，每孔重復(fù)3次。加藥后37 ℃培養(yǎng)24 h，加藥培養(yǎng)結(jié)束后加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，然后酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值(A450)。

1.6細(xì)胞遷移能力的檢測 實(shí)驗(yàn)分為2組，正常組、1g(6 μmol·L-1)組。藥物處理細(xì)胞24 h后收集各組細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至2×105個(gè)·mL-1。在24孔板中加入10%FBS培養(yǎng)基800 μL，并放入Transwell小室，在Transwell上室加入各組細(xì)胞懸液200 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。拿出Transwell小室后，通過磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液清洗小室，70%乙醇溶液固定細(xì)胞1 h，0.5%結(jié)晶紫溶液染色后室溫下孵育20 min，顯微鏡下觀察攝像。

1.7細(xì)胞侵襲能力的檢測 實(shí)驗(yàn)分為2組，正常組、1g(6 μmol·L-1)組。藥物處理細(xì)胞24 h后收集各組細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至2×105個(gè)·mL-1。在24孔板中加入含10%FBS培養(yǎng)基800 μL，并放入Transwell小室，在Transwell上室加入1 mg·mL-1的Matrigel 100 μL后，37 ℃孵育4～5 h，待Matrigel干成膠狀物后于Transwell上室加入的各組細(xì)胞懸液200 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。拿出Transwell小室后，通過PBS緩沖液清洗小室，70%乙醇溶液固定細(xì)胞1 h，0.5%結(jié)晶紫溶液染色后室溫下孵育20 min，顯微鏡下觀察攝像。

1.8透射電鏡觀察細(xì)胞 藥物處理細(xì)胞24 h后收集正常組、1g(6 μmol·L-1)組細(xì)胞，以2.5%戊二醛和1%鋨酸固定后，乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋后制備超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛分別染色5 min，透射電鏡觀察攝像。

1.9Western blotting檢測LC3的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為4組，正常組、低濃度1g(2 μmol·L-1)組、中濃度1g(6 μmol·L-1)組、高濃度1g(10 μmol·L-1)組。通過相應(yīng)濃度1g處理各組細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次；1500 r·min-1離心半徑r=6.5 cm，離心5 min，棄上清液；隨后加入蛋白裂解液，于冰上震蕩裂解30 min；12 000 r·min-1，離心半徑r=6.5 cm，4 ℃離心20 min后，通過BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。取等量40 μg蛋白樣品以通過凝膠電泳分離，取出凝膠后聚偏氟乙烯(poly vinylidene fluoride,PVDF)轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后于5% 脫脂奶粉緩沖液室溫下封閉2 h，隨后將PVDF膜浸泡于用封閉液稀釋的一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜，再在室溫下用二抗孵育2 h，加電化學(xué)發(fā)光顯影后掃描膠片，通過ImageJ軟件分析灰度值。

1.10Western blotting檢測CD147、LC3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為7組，正常組、1g(6 μmol·L-1)組、CD147干擾組(6 μmol·L-11g+CD147 siRNA)、干擾對照組(6 μmol·L-11g+對照siRNA)、CD147過表達(dá)組(6 μmol·L-11g+CD147過表達(dá)質(zhì)粒)、過表達(dá)對照組(6 μmol·L-11g+對照過表達(dá)質(zhì)粒)、CD147過表達(dá)+PI3K抑制劑組(6 μmol·L-11g+ CD147過表達(dá)質(zhì)粒+ 20 μmol·L-1PI3K抑制劑LY294002)。過表達(dá)質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，通過6 μmol·L-1濃度1g及20 μmol·L-1PI3K抑制劑LY294002處理相應(yīng)組細(xì)胞24 h后收集各組細(xì)胞后，Western blotting法檢測各組細(xì)胞中CD147、LC3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT的蛋白表達(dá)，方法同“1.9”。

2 結(jié)果

2.1CD147過表達(dá)載體構(gòu)建鑒定 結(jié)果如圖1所示，構(gòu)建的CD147過表達(dá)載體經(jīng)測序分析表明插入的序列正確，目的基因CD147的過表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 CD147過表達(dá)質(zhì)粒測序鑒定

2.2CCK-8檢測不同濃度1g對HCT116、HT29細(xì)胞增殖的影響 由圖2的CCK-8檢測結(jié)果可知，1g能夠抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29細(xì)胞的增殖，隨著濃度的增加，1g對HCT116、HT29細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)。

2.31g對HCT116、HT29細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，與正常組相比，1g組HCT116、HT29細(xì)胞的遷移能力下降。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，與正常組相比，1g組HCT116、HT29細(xì)胞的侵襲能力下降。

2.41g對HCT116、HT29細(xì)胞自噬的影響 透射電鏡結(jié)果表明，正常組HCT116、HT29細(xì)胞質(zhì)中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯自噬體，1g組細(xì)胞胞膜輪廓不清，細(xì)胞核皺縮，明顯可見自噬體，結(jié)果見圖5。

圖2 不同濃度的1g對HCT116、HT29細(xì)胞增殖的影響

A.HCT116細(xì)胞正常組；B.HCT116細(xì)胞1g組；C.HT29細(xì)胞正常組；D.HT29細(xì)胞1g。

2.51g對HCT116、HT29細(xì)胞中CD147、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、LC3II/LC3I蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，相比于正常組，2，6，10 μmol·L-11g處理HCT116和HT29細(xì)胞后細(xì)胞中LC3II/LC3I蛋白表達(dá)顯著增加(F=2.136，0.633，0.121，P<0.05；F=4.32，0.071，1.401，P<0.05)，呈劑量依賴性，結(jié)果見圖6。另1g(6 μmol·L-1)組與正常組相比，細(xì)胞中CD147、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)顯著減少(F=0.004，2.156，1.162，P<0.05；F=3.782，0.574，1.752，P<0.05)；相對于1g(6 μmol·L-1)組，CD147過表達(dá)組細(xì)胞中CD147、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)顯著性增加(F=0.112，5.313、0.634，P<0.05；F=6.044，0.433，8.25，P<0.05)，LC3II/LC3I蛋白表達(dá)顯著減少(F=1.632，P<0.05；F=1.331，P<0.05)，CD147干擾組則呈相反趨勢；相對于CD147過表達(dá)組，通過PI3K抑制劑處理后CD147、PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)顯著減少(F=0.003，5.53，2.454，P<0.05；F=0.263，3.313，0.226，P<0.05)，LC3II/LC3I蛋白表達(dá)顯著增加(F=0.663，P<0.05；F=1.056，P<0.05)，結(jié)果見圖7，8。

A.HCT116細(xì)胞正常組；B.HCT116細(xì)胞1g組；C.HT29細(xì)胞正常組；D.HT29細(xì)胞1g組。

A.HCT116細(xì)胞正常組；B.HCT116細(xì)胞1g組；C.HT29細(xì)胞正常組；D.HT29細(xì)胞1g組。

A.正常組；B.低濃度1g組；C.中濃度1g組；D.高濃度1g組；①與正常組比較，P<0.05。

3 討論

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)較為常見的一種癌癥，其發(fā)病率及死亡率在惡性腫瘤中排名第3位，嚴(yán)重威脅人們的生活和健康[8]。近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率出現(xiàn)了上升趨勢，這一趨勢與不良的生活方式、飲食習(xí)慣以及環(huán)境污染等有很大關(guān)系[9]。姜黃素是一類具有開發(fā)成抗腫瘤藥物的多酚類化合物，然而因?yàn)榻S素的水溶性較差、代謝率高等缺點(diǎn)極大地限制了姜黃素的進(jìn)一步應(yīng)用[5-6]。1g是本團(tuán)隊(duì)通過嘧啶環(huán)取代和四甲基異硫脲取代得到水溶性高、化學(xué)性穩(wěn)定的新型異硫脲取代姜黃素嘧啶類衍生物[7]。本研究CCK-8結(jié)果表明，1g對HCT116和HT29細(xì)胞的增殖都有抑制作用，呈劑量依賴性，表明1g有發(fā)展為新藥的潛力。結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其惡化和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵原因，嚴(yán)重影響患者的生存及預(yù)后。自噬與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)，研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的過度自噬能抑制其遷移及侵襲能力[10-11]。與姜黃素對腫瘤的遷移侵襲及自噬方面的作用[12-13]類似，本研究發(fā)現(xiàn)1g作為新型異硫脲取代姜黃素嘧啶類衍生物能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116和HT29細(xì)胞自噬的發(fā)生，對其遷移及侵襲能力有一定的抑制作用。

CD147是細(xì)胞表面粘附分子，又叫細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extra-cellular matrix metallo proteinases inducer，EMMPRIN)，在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，其可以通過自分泌的方式增加基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinase，MMPS)的合成。高表達(dá)的CD147還可刺激纖維母細(xì)胞分泌MMPS，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞基底膜和間質(zhì)成分降解，并和MMPS形成致密復(fù)合物，高度集中在腫瘤細(xì)胞膜上，加快腫瘤間質(zhì)的降解，由此促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的浸潤和遷移[14-17]。PI3K/AKT信號通路由PI3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)等分子組成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。PI3K/AKT通路中PI3K主要指I類PI3K(PI3KC I)，它是有一個(gè)催化亞基和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基組成的異源二聚體，可被G蛋白耦聯(lián)受體、蛋白酪氨酸激酶受體、RAS蛋白等激活。PI3K活化后可產(chǎn)生脂質(zhì)類產(chǎn)物PIP3，PIP3可作為第二信使與含有PH結(jié)構(gòu)域的AKT蛋白結(jié)合使其磷酸化從而活化 AKT，因此p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT表達(dá)高低能體現(xiàn)PI3K/AKT通路的活化程度。激活后的PI3K/AKT通路經(jīng)過一系列的調(diào)控能抑制自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)從而抑制細(xì)胞自噬[19-20]。近年來有研究顯示，CD147對腫瘤細(xì)胞的自噬具有抑制作用，CD147可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路而影響細(xì)胞的自噬[21-22]。FEI等[23]認(rèn)為CD147與CD98的重鏈在腫瘤細(xì)胞膜上可以形成復(fù)合物，該復(fù)合物可以通過激活PI3K/Akt通路來影響腫瘤細(xì)胞的生長，下調(diào)CD147的表達(dá)可以進(jìn)一步降低腫瘤細(xì)胞中激活絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT的表達(dá)。GOU等[24]研究也顯示，CD147通過影響PI3K/Akt通路的表達(dá)而下調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)，進(jìn)而證實(shí)CD147通過PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的自噬。本研究Western blotting檢驗(yàn)結(jié)果表明，1g能夠抑制HCT116和HT29細(xì)胞中CD147表達(dá)和PI3K及AKT的磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。而高表達(dá)的CD147明顯逆轉(zhuǎn)了1g的作用，促進(jìn)HCT116和HT29細(xì)胞中PI3K及AKT的磷酸化，激活PI3K/AKT通路。以PI3K抑制劑處理CD147過表達(dá)的細(xì)胞后，其細(xì)胞內(nèi)PI3K及AKT的磷酸化明顯下降，PI3K/AKT通路活化程度降低，說明1g能抑制腫瘤細(xì)胞中CD147表達(dá)和PI3K/AKT通路。由此，lg有望在結(jié)腸癌的治療中，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，達(dá)到減緩腫瘤的發(fā)展的目的，成為新的治療藥物。但其作用效果以及副作用均有待臨床研究和驗(yàn)證。

A.正常組；B.1g組；C.CD147干擾組；D.干擾對照組； E.CD147過表達(dá)組；F.過表達(dá)對照組；G.CD147過表達(dá)+PI3K抑制劑組；①與1g組比較，P<0.05；②與CD147過表達(dá)組比較，P<0.05。

Fig.7ExpressionofCD147,p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKTandLC3II/LC3IinHCT116cells

A.正常組；B.1g組；C.CD147干擾組；D.干擾對照組；E.CD147過表達(dá)組；F.過表達(dá)對照組；G.CD147過表達(dá)+PI3K抑制劑組；①與1g組比較，P<0.05；②與CD147過表達(dá)組比較，P<0.05。

Fig.8ExpressionofCD147,p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKTandLC3II/LC3IinHT29cells

綜上所述，抑制CD147及PI3K/AKT通路可能是1g誘導(dǎo)HCT116和HT29細(xì)胞發(fā)生自噬，抑制其增殖、遷移侵襲能力的分子機(jī)制之一。