周清秋 ，李靜雯，王思敏 ，吳彬 ，陳輝，鄧云，吳建平 *

1.云南大學(xué)/云南省植物繁殖適應(yīng)與進(jìn)化生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.云南大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650500；3.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100875；4.中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶雨林生態(tài)系統(tǒng)研究站，云南 西雙版納 666303

人類活動(dòng)造成大氣CO2濃度持續(xù)增加，由此引發(fā)的氣候變化及溫室效應(yīng)受到社會(huì)各界關(guān)注（Melillo et al.，2002；IPCC，2013）。土壤呼吸作為陸地生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的關(guān)鍵輸出途徑，主要以植物根系、土壤動(dòng)物和土壤微生物的呼吸為主，釋放出的CO2影響全球碳平衡及氣候變化過程（Davidson et al.，2006；徐小鋒等，2007）。土壤動(dòng)物可直接影響土壤碳排放，或通過間接影響土壤微生物和植物生理活動(dòng)調(diào)控土壤呼吸，對(duì)有機(jī)碳礦化起重要作用（王學(xué)霞等，2018）。

土壤線蟲和微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性的重要組分，在生態(tài)系統(tǒng)過程及對(duì)全球變化的響應(yīng)中扮演了重要角色（邵元虎等，2007；陸雅海等，2015）。土壤線蟲可調(diào)控土壤碳、氮等生物地球化學(xué)循環(huán)過程（Van den Hoogen et al.，2019）。食細(xì)菌線蟲和食真菌線蟲在捕食過程中會(huì)釋放出CO2、NH4+及其它含氮化合物，對(duì)土壤的C、N礦化造成直接影響（邵元虎等，2007）。通過室內(nèi)微宇宙實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種線蟲后土壤CO2排放量有顯著提高，且線蟲對(duì)微生物生物量有明顯的調(diào)控作用（Fu et al.，2005）。但是，增溫背景下土壤線蟲對(duì)微生物的調(diào)控及對(duì)土壤碳排放的影響研究還鮮有報(bào)道。

溫度是影響陸地生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)境因素，溫度改變引起的諸多重要生理過程（如土壤生物生存動(dòng)態(tài)及土壤養(yǎng)分循環(huán)）的變化，是全球氣候變化的主要表現(xiàn)形式（Melillo et al.，2002）。溫度升高加重土壤水分流失、改變土壤酶活性及熱應(yīng)激效應(yīng)，使土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化（Briones et al.，2009）。此外，增溫通過調(diào)控植物根系碳輸入和凋落物分解等途徑間接改變土壤生物多樣性，進(jìn)而影響陸地生態(tài)系統(tǒng)功能和全球氣候（Cowles et al.，2016；Daniel et al.，2017）。

熱帶森林土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)氣候變化較為敏感，研究全球變暖背景下熱帶地區(qū)土壤生物群落動(dòng)態(tài)及其對(duì)土壤碳排放的影響具有重要意義（Malhi et al.，2004）。目前，增溫對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)影響的研究多集中在溫帶和寒帶地區(qū)，在熱帶森林開展研究相對(duì)較少（Cavaleri et al.，2015）。因此，本實(shí)驗(yàn)通過研究增溫和線蟲添加條件下熱帶森林土壤呼吸速率和土壤微生物碳利用效率動(dòng)態(tài)，探討土壤呼吸對(duì)全球變暖和土壤生物互作的響應(yīng)及其生物調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

土壤樣品采集于云南省西雙版納熱帶植物園（101°25′E，21°41′N）。該區(qū)海拔 570 m，年均溫21.5 ℃，年均降水量約 1400 mm，屬熱帶雨林氣候，土壤類型為磚紅壤。2018年8月，在20 m×20 m的研究樣地內(nèi)，每隔5 m設(shè)置一個(gè)取樣點(diǎn)，每個(gè)取樣點(diǎn)用直徑5 cm土鉆隨機(jī)取5鉆土，取土深度為0—10 cm。將5鉆土混合成一個(gè)土壤樣品，共采集10個(gè)混合土壤樣品。土樣帶回實(shí)驗(yàn)室后，去除可見根系和石礫，過2 mm篩并測(cè)定土壤理化性質(zhì)（見表1）。有研究表明，熱帶雨林中土壤微生物活動(dòng)的最佳含水量為飽和含水量的 70%（Clarisse et al.，2019）。因此，本實(shí)驗(yàn)通過稱質(zhì)量和添加去離子水來維持此適宜含水量。

表1 供試土壤理化性狀Table 1 Physico-chemical characteristics of Xishuangbanna tropical rainforest soil

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將過篩后的10個(gè)樣品均勻混合，稱取1000 g混合土置于容器中，攤成2—3 cm薄層，放入-26 ℃冰箱冰凍3 d，再轉(zhuǎn)入生化培養(yǎng)箱于22 ℃下培養(yǎng)7 d，按此操作反復(fù)凍融5—7次。期間用淺盤法進(jìn)行分離檢驗(yàn)，直至去除土壤中所有活體線蟲為止（毛小芳等，2004；周際海等，2017）。

本實(shí)驗(yàn)中添加的線蟲為秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans），由云南省生物資源開發(fā)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。此類線蟲取食細(xì)菌，常被作為模式生物開展研究（周際海等，2017）。實(shí)驗(yàn)開始前，用0.1%硫酸鏈霉素和0.002%放線菌酮的混合消毒液對(duì)線蟲進(jìn)行殺菌，防止其表面微生物對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾（李輝信等，2002）。準(zhǔn)備30個(gè)500 mL的無菌玻璃瓶，每瓶稱取30 g凍融土。根據(jù)該地區(qū)土壤線蟲豐度，往線蟲添加處理的培養(yǎng)瓶中加入20條殺菌后的線蟲（Xiao et al.，2014）。在所有培養(yǎng)瓶蓋子上開一個(gè)小口，接上 PVC管且連接三通氣閥，用熱熔膠密封以保證培養(yǎng)過程的密閉性，采氣時(shí)打開三通氣閥。

依據(jù)西雙版納年均溫和IPCC報(bào)告預(yù)測(cè)的增溫范圍（1.1—6.4 ℃）（IPCC，2013），實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)增溫梯度，共計(jì) 30個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)瓶。線蟲添加完畢后，關(guān)閉所有三通氣閥，并將培養(yǎng)瓶分別放入21.5、24.5、27.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中。參照土壤生物通用培養(yǎng)研究方法（Treat et al.，2014），本實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為30 d。具體實(shí)驗(yàn)處理為：

（1）處理一T21.5：21.5 ℃培養(yǎng)（CK）

（2）處理二T24.5：24.5 ℃培養(yǎng)

（3）處理三T27.5：27.5 ℃培養(yǎng)

（4）處理四 NeT21.5：21.5 ℃培養(yǎng)+線蟲添加（20 條）

（5）處理五 NeT24.5：24.5 ℃培養(yǎng)+線蟲添加（20 條）

（6）處理六 NeT27.5：27.5 ℃培養(yǎng)+線蟲添加（20 條）

1.3 土壤呼吸和土壤微生物生物量碳測(cè)定

基于頂空CO2濃度隨時(shí)間的變化計(jì)算土壤呼吸速率，培養(yǎng)和測(cè)量方法參照Chen et al.（2016）。初次測(cè)量之前，打開玻璃瓶瓶蓋并放入通風(fēng)櫥對(duì)流 1 h。待瓶子中的氣體濃度分布均勻后，用注射器抽取5 mL頂空氣體在氣相色譜儀上測(cè)定CO2含量，此為CO2初始濃度。為避免負(fù)壓造成的潛在影響，抽取頂空氣體后立即將5 mL無CO2空氣注入瓶中。然后將所有玻璃瓶置于各自的設(shè)定溫度下，48 h后，再次抽取5 mL頂空氣體，以測(cè)算期間的CO2濃度變化值，此過程共重復(fù)3次。從實(shí)驗(yàn)的第7天起（即第3次抽氣結(jié)束后），每隔5—8天測(cè)定1次CO2含量，即在實(shí)驗(yàn)開始的當(dāng)天以及培養(yǎng)的第 2、4、6、11、16、23、30天分別對(duì)每個(gè)玻璃瓶進(jìn)行抽氣，依次記錄為 D0、D2、D4、D6、D11、D16、D23、D30。最后1次抽氣完成后，用氯仿熏蒸法測(cè)定土壤微生物生物量碳（Yao et al.，2000）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

參照Wu et al.（2014）計(jì)算土壤CO2呼吸速率（Rt，μg·g-1·d-1），公式如下：

式中：M：CO2摩爾質(zhì)量，44 g·mol-1；V0：氣體體積常數(shù)，22.4 L·mol-1；Vt+2：測(cè)量當(dāng)天培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)氣體體積（mL）；Ct+2：測(cè)量當(dāng)天培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)CO2濃度（μg·g-1）；Vt：培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)氣體初始體積（mL）；Ct：培養(yǎng)瓶?jī)?nèi) CO2初始濃度（μg·g-1）；m：干土質(zhì)量（g）；P0：標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，1013.25 hPa；P：測(cè)量時(shí)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)實(shí)際氣壓（hPa）；T0：標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)熱力學(xué)溫度，273.15 K；T：測(cè)量時(shí)實(shí)際培養(yǎng)溫度（K）。

土壤呼吸累積量（Rc）的計(jì)算公式參照（王春新等，2017）：

式中：Rc為測(cè)定時(shí)間內(nèi)的土壤呼吸累積量（μg·g-1）；Rt為測(cè)量時(shí)間內(nèi)的土壤呼吸速率（μg·g-1·d-1）；t為測(cè)量時(shí)間（d）。

土壤呼吸速率與溫度間呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系，通常用土壤呼吸的溫度敏感性（Q10）來表示溫度每升高10 ℃土壤呼吸速率增加的倍數(shù)。Q10的計(jì)算公式（毛小芳等，2004）為：

式中：Rt為土壤呼吸速率；θ為土壤溫度；a、b為實(shí)際參數(shù)。

土壤微生物生物量碳（MBC）的計(jì)算公式為：

式中：ω(C)為微生物生物量碳（mg·kg-1）；EC 為已熏蒸土樣的可溶性有機(jī)碳含量與未熏蒸土樣的可溶性有機(jī)碳含量差值（mg·kg-1）；KEC為微生物體中碳被浸提出來的比例，一般定為0.38（陳國(guó)潮，2002）。

微生物碳利用效率（CUE）是衡量微生物群落新陳代謝能力的一個(gè)重要參數(shù)，其數(shù)值大小反映了微生物釋放CO2的強(qiáng)弱程度（Spohn et al.，2016）。CUE的計(jì)算公式參考（Maynard et al.，2017）：

式中：B為土壤呼吸測(cè)定結(jié)束后的微生物生物量碳含量（μg）；R為土壤呼吸測(cè)定結(jié)束當(dāng)天的測(cè)得的呼吸碳含量（μg）。

用單因素方差分析（One-way ANOVA）比較處理間差異性，處理間的主效應(yīng)及交互效應(yīng)用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）檢驗(yàn)，用一元回歸分析（Simple regression analysis）檢驗(yàn)土壤溫度、MBC和 CUE對(duì)土壤呼吸速率的影響，所有分析顯著水平均設(shè)為P＜0.05。統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)整合用Microsoft Excel 2016和SPSS 19.0完成，用Sigma Plot 12.5和Excel軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 增溫和線蟲添加對(duì)土壤呼吸的影響

圖1 增溫和線蟲添加對(duì)土壤呼吸速率的影響Fig.1 Effects of warming and nematodes addition on soil respiration rate

增溫和線蟲添加均顯著影響土壤呼吸速率（P＜0.05，圖1）。在培養(yǎng)期內(nèi)，6組處理的土壤呼吸速率均隨培養(yǎng)時(shí)間呈明顯上升趨勢(shì)。從第 11天開始，T21.5、NeT21.5的土壤呼吸速率逐漸趨于平穩(wěn)，其余處理仍呈明顯上升趨勢(shì)；相同溫度下未添加線蟲與添加線蟲處理的土壤呼吸速率差異顯著（P＜0.05）。第11天時(shí)，T24.5、T27.5分別是T21.5的1.23倍和1.58倍；同一溫度下添加線蟲后土壤呼吸速率比未添加降低4.64%—5.96%。第30天時(shí)，T24.5、T27.5分別是T21.5的1.96倍和2.69倍；同一溫度下添加線蟲的土壤呼吸速率比未添加降低 5.59%—9.25%。

圖2 增溫和線蟲對(duì)土壤總呼吸碳的影響Fig.2 Effects of warming and nematode on total soil respiratory carbon

增溫和線蟲添加對(duì)土壤總呼吸碳有顯著影響（P＜0.05），但二者交互作用不明顯（圖2）。增溫使土壤總呼吸碳顯著升高（P＜0.05），T24.5、T27.5分別是T21.5的1.68倍和2.23倍。相同溫度下，添加線蟲后的土壤總呼吸碳比未添加線蟲降低4.44%—5.43%。

2.2 增溫和線蟲添加條件下土壤呼吸的溫度敏感性

用指數(shù)函數(shù)模型計(jì)算不同處理下Q10的變化。結(jié)果表明，土壤呼吸速率與土壤溫度顯著正相關(guān)（圖3）。線蟲添加條件下Q10顯著提高（P＜0.05），較未添加線蟲處理升高5.98%。

2.3 增溫和線蟲添加對(duì)MBC和CUE的影響

增溫、線蟲添加、增溫+線蟲添加均對(duì)MBC有顯著影響（P＜0.05，圖4a）。與T21.5相比，MBC在T24.5下提高8.50%，在T27.5下降低13.88%，線蟲添加后顯著降低15.57%—20.18%。相同溫度下，MBC在線蟲添加后顯著降低7.31%—23.32%。

增溫和線蟲添加對(duì) CUE均有顯著影響（P＜0.05，圖4b），但增溫與線蟲添加處理間交互作用不明顯。隨著培養(yǎng)溫度的升高，相同線蟲處理的CUE均顯著下降，未添加線蟲降低 30.49%—55.90%，添加線蟲降低36.16%—52.45%。相同溫度下，添加線蟲處理 CUE比未添加線蟲處理降低2.37%—16.85%。

2.4 MBC和CUE對(duì)土壤呼吸的影響

將MBC和CUE與第30天的土壤呼吸速率進(jìn)行回歸分析（圖5），結(jié)果顯示CUE能顯著影響土壤呼吸速率（P＜0.05，圖5a），且模型擬合度較高；而MBC與土壤呼吸速率相關(guān)性不顯著（圖5b）。

圖3 線蟲添加條件下溫度對(duì)土壤呼吸速率的影響Fig.3 Effects of temperature on soil respiration rate under nematodes addition

3 討論

圖4 增溫及線蟲添加對(duì)MBC和CUE的影響Fig.4 Effects of warming and nematodes addition on soil MBC and CUE

圖5 MBC和CUE對(duì)第30天土壤呼吸速率的影響Fig.5 Effects of MBC and CUE on soil respiration rate of the 30th day

本研究中，短期增溫顯著提高土壤呼吸速率，這與增溫可短暫增加土壤呼吸量的研究結(jié)果一致（Melillo et al.，2017；康靜等，2019）。溫度作為土壤呼吸速率的主要調(diào)控因子，增溫可能直接加速微生物分解作用，促進(jìn)CO2向大氣中排放（Melillo et al.，2017）。相反，短期增溫降低了CUE。較高的CUE表明土壤中有充足的有效底物供微生物進(jìn)行自身固碳（Manzoni et al.，2012），而CUE下降則表明微生物同化的碳此時(shí)用于呼吸的比例增加，用于自身合成生物量的比例減少，從而促進(jìn)土壤碳排放。添加線蟲后，土壤呼吸速率明顯下降，CUE下降趨勢(shì)則更強(qiáng)，這可能由于微生物受線蟲捕食導(dǎo)致數(shù)量減少（圖 4）。土壤微生物以異養(yǎng)呼吸方式釋放出的CO2量，通常能占土壤呼吸總量的一半以上（Bond-Lamberty et al.，2004）。線蟲添加后可能大量取食微生物，導(dǎo)致微生物數(shù)量減少，土壤呼吸速率減慢。雖然線蟲對(duì)土壤呼吸也具有一定貢獻(xiàn)（Ingham et al.，1985），但不足以彌補(bǔ)因微生物減少而造成的土壤碳排放損失，說明線蟲可能通過調(diào)控土壤微生物數(shù)量而促進(jìn)土壤碳固定。

隨著培養(yǎng)溫度的升高，土壤微生物生物量碳呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)溫度從 21.5 ℃升高至24.5 ℃時(shí)，微生物生長(zhǎng)繁殖受到適度促進(jìn)，總數(shù)量增加，微生物生物量碳含量增加；當(dāng)溫度繼續(xù)升高至 27.5 ℃時(shí)，微生物數(shù)量卻大幅減少。一方面，微生物對(duì)環(huán)境溫度變化較為敏感，受增溫刺激后生長(zhǎng)勢(shì)態(tài)和呼吸作用均會(huì)顯著增強(qiáng)；另一方面，如果微生物處在未馴化階段，加速變暖則可能使土壤中的有效底物耗盡，繼而對(duì)微生物活動(dòng)產(chǎn)生負(fù)反饋效應(yīng)，微生物生物量則隨之降低。Allison et al.（2010）發(fā)現(xiàn)微生物特性可間接影響土壤碳排放，通過降低增溫樣地中土壤微生物生物量來減弱土壤呼吸作用，有效彌補(bǔ)了因增溫引起的土壤碳損失。線蟲添加后，微生物量碳明顯下降，除上述的受到線蟲取食外，微生物生存可能還受到生存空間和資源的限制。線蟲加入加快了有限資源的消耗，為適應(yīng)環(huán)境，微生物群落組成或?qū)⒆優(yōu)樯L(zhǎng)和周轉(zhuǎn)迅速的r-對(duì)策型微生物，而這類微生物生物量較低（周正虎等，2016）。

此外，隨著溫度升高，土壤呼吸作用增強(qiáng)，Q10也呈現(xiàn)出增大的趨勢(shì)，這與以往研究結(jié)果一致（張彥軍等，2019）。添加線蟲后，土壤呼吸速率有所減緩，但Q10反而增大，造成這一結(jié)果的原因可能與線蟲大量繁殖有關(guān)，土壤線蟲豐度與溫度有顯著正相關(guān)關(guān)系（Ruess et al.，1999）。本研究選取的秀麗隱桿線蟲是c-p值為1的食細(xì)菌線蟲，此類線蟲世代時(shí)間短，產(chǎn)卵量大，在食物富集條件下能快速繁殖（張曉珂等，2013）。線蟲剛添加時(shí)，充足的土壤養(yǎng)分使其快速繁殖。此時(shí)微生物受線蟲取食而數(shù)量減少，MBC含量明顯下降，土壤呼吸速率也隨之下降。由于線蟲本身呼吸作用，所以線蟲添加也貢獻(xiàn)了一部分呼吸碳，因此Q10比無線蟲處理略高。但由于本實(shí)驗(yàn)處理周期較短，受實(shí)驗(yàn)限制未能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)過程中線蟲數(shù)量變化，且秀麗隱桿線蟲的取食偏好在本實(shí)驗(yàn)中也未能明確。因此，未能定量分析線蟲對(duì)土壤呼吸的貢獻(xiàn)率，后續(xù)研究將從培養(yǎng)過程中線蟲的數(shù)量動(dòng)態(tài)和微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行補(bǔ)充驗(yàn)證。

4 結(jié)論

通過室內(nèi)的短期增溫和線蟲添加實(shí)驗(yàn)，表明增溫顯著增強(qiáng)熱帶雨林土壤的呼吸作用。線蟲添加后土壤呼吸速率減小，土壤呼吸的溫度敏感性發(fā)生變化，且土壤微生物生物量碳隨之減少，從而導(dǎo)致微生物碳利用效率下降，影響土壤碳吸存效應(yīng)，最終可能調(diào)控生態(tài)系統(tǒng)對(duì)全球變暖的響應(yīng)。