廖申權(quán)，戚南山，呂敏娜，吳彩艷，李 娟，蔡海明，林栩慧，胡俊菁，于林增，張健騑，謝明權(quán)，孫銘飛

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室茂名分中心，廣東 茂名 525000）

家禽養(yǎng)殖業(yè)是畜牧業(yè)的基礎(chǔ)性產(chǎn)業(yè)，禽肉和蛋已成為人們蛋白質(zhì)消費的主要來源。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計，雞肉成為全球第一大類動物蛋白，產(chǎn)量連續(xù)4年超過豬肉，2019年全球禽肉產(chǎn)量超過3.3億t，雞年養(yǎng)殖量達660億羽；我國禽肉產(chǎn)量世界第一，2019年達8 034萬t，家禽年出欄量超過146億羽，其中白羽肉雞與黃羽肉雞年出欄量達93億羽，肉雞養(yǎng)殖在家禽養(yǎng)殖中占主導(dǎo)地位。雞球蟲病是一種嚴(yán)重危害雞養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展且呈全球范圍流行的寄生蟲病。雖然面臨禽流感及其他重要傳染病的威脅，但是雞球蟲病仍然是導(dǎo)致全球雞養(yǎng)殖業(yè)巨大經(jīng)濟損失的最嚴(yán)重疾病之一。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球每年因雞球蟲病引起的經(jīng)濟損失高達30億美元［1］。預(yù)計到2050年，全球家禽養(yǎng)殖量將是目前的兩倍以上，如何有效防控雞球蟲病將成為養(yǎng)殖行業(yè)關(guān)注的重點。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為雞球蟲有7個種，分別是柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）、毒害艾美耳球蟲（E. necatrix）、堆型艾美耳球蟲（E.acervulina）、巨型艾美耳球蟲（E. maxima）、布氏艾美耳球蟲（E. brunetti）、和緩艾美耳球蟲（E.mitis）和早熟艾美耳球蟲（E. praecox），其致病力由強到弱為柔嫩艾美耳球蟲＞毒害艾美耳球蟲＞布氏艾美耳球蟲＞巨型艾美耳球蟲＞堆型艾美耳球蟲＞和緩艾美耳球蟲＞早熟艾美耳球蟲。目前，雞球蟲病的防治仍主要采用在飼料中添加抗球蟲藥物的手段，但是隨著抗球蟲藥物長期、大量使用，導(dǎo)致雞球蟲抗藥性及藥物殘留等問題，因而雞球蟲病的安全、有效防控措施備受關(guān)注。同時，世界各國已先后提出了抗生素、生長促進劑“退出”計劃［2］，尤其是歐盟已于2012年全面禁止在飼料中添加抗球蟲藥物，雞球蟲病的防控在新形勢下面臨新的挑戰(zhàn)。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在雞球蟲病的流行病學(xué)研究、防治藥物開發(fā)與疫苗研制等方面開展了大量研究工作，本文從雞球蟲病流行病學(xué)、防治藥物開發(fā)及疫苗研制等方面，系統(tǒng)地總結(jié)了國內(nèi)外雞球蟲病的防控研究進展，以期為生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)。

1 雞球蟲病流行病學(xué)

1.1 雞球蟲的感染與繁殖

雞球蟲是一類單宿主型的寄生蟲，生活史不需要中間宿主，其感染是“自限性”的。孢子化卵囊被雞只攝入后侵入腸上皮細(xì)胞，經(jīng)過2～4代裂殖生殖，再經(jīng)配子生殖，形成未孢子化卵囊排出體外。如果雞體沒有再次感染雞球蟲，體內(nèi)就不會有雞球蟲存在，但在實際生產(chǎn)過程中，雞體不斷地從環(huán)境中攝入球蟲卵囊，球蟲的感染不斷發(fā)生，但是雞體需要一次攝入大量孢子化卵囊才出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，致病劑量因球蟲蟲種不同而存在明顯差異［3］。在飼養(yǎng)過程中，雞可以通過少量多次的自然感染獲得免疫力，而沒有攝入卵囊或者攝入卵囊數(shù)量不足以產(chǎn)生堅強免疫力時，雞仍可能因攝入環(huán)境中的卵囊經(jīng)過2～4個生活史循環(huán)后達到致病劑量而感染發(fā)病。雞球蟲的繁殖力較強，不同蟲種的卵囊繁殖力卻存在一定差異，接種最佳劑量孢子化卵囊后，每只雞的最大卵囊繁殖力依次為堆型、柔嫩、布氏、巨型和毒害艾美耳球蟲［4］。研究顯示，雞球蟲的繁殖力受“占位效應(yīng)”的影響，當(dāng)感染劑量低于占位閾值時，裂殖子數(shù)量較少，腸道內(nèi)豐富的未感染腸上皮細(xì)胞給配子體發(fā)育提供了良好條件，卵囊得到充分發(fā)育，平均卵囊產(chǎn)量較高；當(dāng)感染劑量高于占位閾值時，球蟲經(jīng)多次裂殖生殖后產(chǎn)生大量裂殖子，腸上皮細(xì)胞呈現(xiàn)“過飽和”現(xiàn)象，不利于裂殖子發(fā)育和配子生殖，從而導(dǎo)致平均卵囊產(chǎn)量降低［5］。理論上1個柔嫩艾美耳球蟲卵囊感染后可以產(chǎn)生180萬個卵囊后代［6］，而實際上柔嫩艾美耳球蟲的最大卵囊產(chǎn)量僅為4.29萬個［5］。

1.2 流行病學(xué)特征

1.2.1 雞球蟲病流行情況 集約化養(yǎng)雞場是雞球蟲病暴發(fā)的最適宜場所，其發(fā)病率為50%～70%，如不采取有效措施，其死亡率為20%～30%，嚴(yán)重時可高達80%。雞球蟲在世界范圍廣泛流行，在伊朗、羅馬尼亞、尼日利亞、中國、印度、巴基斯坦、韓國及埃塞俄比亞的流行率分別為55.96%、91%、52.9%、65.8%、77.7%、43.89%、78.7%、56%［7-12］。不同地區(qū)不同養(yǎng)殖場各蟲種的感染強度有所不同，但都以數(shù)種球蟲的混合感染為主。研究顯示，羅馬尼亞雞球蟲的優(yōu)勢蟲種為堆型（91%）和柔嫩艾美耳球蟲（61%）［8］，捷克斯洛伐克、法國及瑞典雞球蟲的優(yōu)勢蟲種為堆型（100%）、柔嫩（77%）和巨型艾美耳球蟲（25%）［13］，美國雞球蟲的優(yōu)勢蟲種為巨型（34%）、早熟（24%）、堆型（22%）、柔嫩艾美耳球蟲（15%）［14］，亞洲、非洲及中東地區(qū)雞球蟲的優(yōu)勢蟲種為堆型（19%～87%）、柔嫩（27%～62%）、布氏（10%～60%）、毒害艾美耳球蟲（4%～30%）［15］。我國雞球蟲的流行情況為柔嫩（90%）、早熟（88%）、堆型（72%）、巨型（68%）、和緩（60%）、毒害（26%）、布氏艾美耳球蟲（8%）［11］。按地理區(qū)域分，東北、華北地區(qū)的優(yōu)勢蟲種均為柔嫩、巨型和堆型艾美耳球蟲，總感染率分別為54.6%和67.1%；華中地區(qū)優(yōu)勢蟲種為柔嫩、毒害、堆型和巨型艾美耳球蟲，總感染率為37.9%；華東地區(qū)常見蟲種為柔嫩、毒害、堆型、巨型與和緩艾美耳球蟲，總感染率達63.5%；華南、西南和西北地區(qū)7種球蟲均常見，總感染率分別為 65.6%、21.4% 和 39.7%［16］。

1.2.2 雞球蟲病流行的影響因素 雞球蟲的感染與雞只日齡、品種，飼養(yǎng)管理，環(huán)境氣候，其他病原及雞體免疫力等影響因素相關(guān)。不同品種、日齡的雞只均可感染球蟲并發(fā)生雞球蟲病。研究顯示，狼山雞、藏雞等10個品種對球蟲的易感性較低，白羽雞、清遠(yuǎn)麻雞等7個品種對球蟲易感性較高［17］，雛雞感染率明顯高于成年雞，15～50日齡雛雞最易感，較小日齡雞接觸卵囊數(shù)量較少，不容易一次性攝入致病劑量的球蟲卵囊，較大日齡雞因在飼養(yǎng)過程中受少量球蟲卵囊的重復(fù)感染而獲得免疫力，可以抵抗致病劑量球蟲卵囊的感染。散養(yǎng)、地面平養(yǎng)、網(wǎng)上飼養(yǎng)及籠養(yǎng)飼養(yǎng)模式下雞球蟲陽性率逐漸降低。高溫高濕氣候有利于球蟲卵囊的孢子化和球蟲感染，但現(xiàn)代養(yǎng)雞場集約化程度高、飼養(yǎng)密度大，墊料與環(huán)境中球蟲卵囊荷載量增多，導(dǎo)致雞群易暴發(fā)球蟲病，發(fā)病季節(jié)性不明顯，呈現(xiàn)常年流行。雞體感染免疫抑制或腸道病原后會加重球蟲病的發(fā)生，雞體是否感染免疫抑制性病原對于采取藥物或疫苗防控球蟲的效果具有重要影響。此外，世界各國先后提出抗生素生長促進劑退出計劃，我國也于2020年7月1日起實施藥物飼料添加劑退出計劃，隨著獸用抗菌藥使用減量化行動的實施，腸道細(xì)菌?。ㄈ珉u壞死性腸炎等）的發(fā)病率和流行率將呈上升趨勢，從而加劇因雞球蟲感染引起的腸炎等癥狀，為雞球蟲病的有效防控帶來新的挑戰(zhàn)。

2 雞球蟲病防治藥物開發(fā)

自1948年磺胺喹噁啉用于預(yù)防和治療雞球蟲病以來，國內(nèi)外研發(fā)了50多種抗球蟲藥物，其中上市的抗球蟲藥物40余種?？骨蛳x藥物包括聚醚類離子載體抗生素、化學(xué)合成藥及天然產(chǎn)物藥，常見抗球蟲藥物見表1、表2［18］。

2.1 聚醚類離子載體抗生素

聚醚類抗生素（Polyether antibiotics, PEs）是一類從鏈霉菌（Streptomycesspp.）、馬杜拉放線菌（Actinomaduraspp.）等發(fā)酵產(chǎn)物中分離，具有離子載體性質(zhì)的抗生素［19］。常見的聚醚類抗生素有莫能菌素（Monensin，MON）、鹽霉素（Salinomycin,SAL）、那拉菌素（Narasin，NAR）、馬杜霉素（Maduramicin，MAD）、山度霉素（Semduramicin，SEM）、拉沙菌素（Lasalocid，LAS）和我國成功研制的海南霉素（Hainanmycin，HAI）等。莫能菌素、鹽霉素和那拉菌素是一類單價離子載體抗生素，分別從肉地桂鏈霉菌（Streptomyces cinnamonensis）、白色鏈霉菌（S. albus）和金黃色鏈霉菌（S.aureofaciens）發(fā)酵物中提取得到［20］。馬杜霉素與山度霉素是一類單價糖苷離子載體抗生素，分別由放線菌Actinomadura yumaensis和A. roseorufa發(fā)酵而制成［21］。拉沙菌素為二價離子載體抗生素，由沙拉鏈霉菌（S. lasaliensis）發(fā)酵生成［22］。

聚醚類抗生素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上含有多個醚基和一個一元有機酸，具有促進離子通過細(xì)胞膜的能力，離子載體類抗球蟲藥物作用于雞球蟲無性繁殖和有性繁殖階段，干擾陽離子的正常轉(zhuǎn)運，破壞球蟲細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓而發(fā)揮藥理作用［23］。該類抗球蟲藥物廣泛應(yīng)用于養(yǎng)雞業(yè)，主要原因是：此類藥物具有廣譜的抗球蟲效果，對7種雞球蟲均有活性；雞球蟲對此類藥物的耐藥性產(chǎn)生較為緩慢；此類藥物不能完全抑制球蟲發(fā)育、繁殖，少量卵囊的刺激有利于雛雞產(chǎn)生一定保護水平的免疫力；此類藥物僅用于畜禽生產(chǎn)，且不用于畜禽食源性細(xì)菌病及人類疾病的治療，對人類健康不構(gòu)成威脅。但是聚醚類抗生素的安全范圍小，禁與泰妙菌素、竹桃霉素、部分磺胺類藥物和抗氧化劑等并用。

2.2 化學(xué)合成類藥物

化學(xué)合成類抗球蟲藥物包括磺胺喹噁啉（Sulfaquinoxaline，SQ）、呋喃西林（Nitrofurazone，NIT）、尼卡巴嗪（Nicarbazin，NCB）、呋喃唑酮（Furazolidone，F(xiàn)UR）、氨丙啉（Amprolium，AMP）、氯羥吡啶（Clopidol，CLO）、丁氧喹啉（Buquinolate）、芐氧喹甲酯（Nequinate）、癸氧喹酯（Decoquinate，DEC）、氯苯胍（Robenidine，ROB）、常山酮（Halofuginone，HAL）、阿德呋啉（Aprinocid，APR）、妥 曲珠 利（Totrazuril，TOL）、 地 克 珠 利（Diclazuril，DIC）、 二 硝托胺（Zoalene，ZOA）、磺胺間二甲氧嘧啶（Sulfamethoxine，SMZ）等。氨丙啉是抗硫胺素類衍生物，可以競爭性抑制球蟲攝取硫胺，使得蟲體不能合成硫胺焦磷酸鹽，從而缺乏α-酮酸脫氫酶系的輔酶，阻礙蟲體的糖代謝，抑制球蟲的發(fā)育［24］。氨丙啉對柔嫩和堆型艾美耳球蟲作用最強，對毒害、布氏和巨型艾美耳球蟲作用較弱，常與乙氧酰胺苯甲酯聯(lián)合使用，可提高抗球蟲活性［25］?；前粪瓏f啉具有抗菌和抗球蟲活性，其基本結(jié)構(gòu)與對氨基苯甲酸（para-aminobenzoic acid，PABA）相似，可競爭二氫葉酸合成酶，影響二氫葉酸形成，從而阻斷核蛋白合成，抑制球蟲生長繁殖［26］，常與乙氧酰胺苯甲酯聯(lián)用，自1948年批準(zhǔn)上市以來，至今仍廣泛應(yīng)用于球蟲病的防治。

表1 抗球蟲藥物及雞球蟲耐藥性情況［18］Table 1 Overview of anticoccidial products and the resistance of Eimeria spp.［18］

表2 抗球蟲天然產(chǎn)物藥物Table 2 Anticoccidial natural products

喹啉類（丁氧喹啉、癸氧喹酯、芐氧喹甲酯）以及氯羥吡啶、尼卡巴嗪、氯苯胍、妥曲珠利等藥物通過抑制球蟲線粒體呼吸作用，影響蟲體正常代謝，從而抑制球蟲的發(fā)育繁殖［27-29］。喹啉類抗球蟲藥物通過破壞蟲體線粒體的電子傳遞，影響線粒體呼吸作用；尼卡巴嗪具有較廣的抗球蟲譜，與鹽霉素有協(xié)同作用，但尼卡巴嗪存在安全范圍窄，在高溫高濕條件下容易引起雞群熱應(yīng)激，還可引起褐色蛋殼顏色變淺及產(chǎn)蛋率和孵化率下降等缺點；妥曲珠利可以抑制呼吸鏈琥珀酸-細(xì)胞色素C還原酶、NADH氧化酶及琥珀酸氧化酶活性，抑制球蟲線粒體氧化磷酸化作用，從而影響球蟲發(fā)育［30］。地克珠利與常山酮具有廣譜抗球蟲效果，但仍不清楚其抗球蟲機理。

此外，復(fù)方抗球蟲制劑可提高效果作用效果，減緩球蟲抗藥性的產(chǎn)生［31］。商品化的復(fù)合制劑包括國外研制的Unistat-3（二硝苯甲酰胺+磺胺硝苯+洛克沙砷）、Amprol Plus（氨丙啉+乙氧酰胺苯甲酯）、Agribon（磺胺間二甲氧嘧啶+奧美普林）、Maxiban（那拉菌素+尼卡巴嗪）、PoultrySulfa（磺胺二甲嘧啶+磺胺甲基嘧啶+磺胺喹噁啉）等；國內(nèi)研制的鹽酸氨丙啉乙氧酰胺苯甲酯預(yù)混劑、鹽酸氨丙啉乙氧酰胺苯甲酯磺胺喹噁啉預(yù)混劑、氧酰胺苯甲酯預(yù)混劑及甲基鹽霉素尼卡巴嗪預(yù)混劑等。研究表明，尼卡巴嗪+馬杜霉素，尼卡巴嗪+乙氧酰胺苯甲酯等藥物的聯(lián)合使用具有很好的抗球蟲效果［32］。因此，聯(lián)合用藥或復(fù)方制劑的應(yīng)用是防止或減緩球蟲抗藥性產(chǎn)生的有效措施之一。

2.3 天然產(chǎn)物藥物

天然產(chǎn)物是從自然界存在的生物體內(nèi)分離、提取的有機化合物，通過生化作用及光合作用形成，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎癥及抗氧化等活性。研究顯示，植物精油類天然產(chǎn)物如青蒿、百里香、茶樹、丁香等提取的精油可體外破壞球蟲卵囊［33］。商業(yè)化植物精油如香芹酚、香芹酮、異胡薄荷醇、百里香酚、丁香酚等具有一定的抗球蟲活性，通常添加于飼料作為預(yù)防性抗球蟲藥［34］。中草藥單方如青蒿、常山、白頭翁及苦參等［35］，中草藥復(fù)方制劑，如復(fù)方球蟲散、雞球康、艾球康、常青克球靈等均有良好的防治效果［36-37］。植物精油及中草藥等抗球蟲作用機理仍不清晰，主要體現(xiàn)在抑制球蟲發(fā)育、增強動物機體免疫功能等方面。近年來，天然產(chǎn)物因其得天獨厚的優(yōu)勢受到抗寄生蟲藥物研究學(xué)者們的青睞，但由于對天然產(chǎn)物抗球蟲作用機理了解仍較少，并且缺乏有效的藥靶，使得抗球蟲新藥研究進展緩慢。因而，發(fā)現(xiàn)并確證有效的藥靶，并以其為基礎(chǔ)高通量篩選、驗證具有高效抗球蟲效果的天然產(chǎn)物進而研發(fā)抗球蟲藥物，成為抗球蟲天然產(chǎn)物新藥研究的策略之一。目前，雞球蟲藥靶研究取得一定進展，已報道的藥靶包括葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（Glucose-6 -phosphate isomerase，GPI）、 周 期蛋白依賴性激酶2（Cyclin-dependent kinases related kinase 2，CRK2）、丙二酰單酰輔酶A:ACP轉(zhuǎn)?；?酶（Malonyl-CoA:acyl-carry protein transacylase，MCAT）、鈣依賴性蛋白激酶4（Calcium-dependent protein kinase 4，CDPK4）及己糖激酶（Hexokinase，HK）等［38-40］。以這些藥靶為基礎(chǔ)，篩選出BES062021、BES143551、BES241415、BES252034、萘醌、8-羥基喹啉、紫堇塊莖堿及芒果苷等具有較好抗球蟲活性的抑制劑，其中紫堇塊莖堿及芒果苷屬于天然產(chǎn)物，這些抑制劑的發(fā)現(xiàn)為抗球蟲新藥研發(fā)提供有潛力的先導(dǎo)化合物。

2.4 雞球蟲抗藥性研究

20世紀(jì)40—90年代，不斷有新的抗球蟲藥物被開發(fā)、上市，并得到廣泛應(yīng)用。但同時雞球蟲也迅速產(chǎn)生抗藥性，全球范圍內(nèi)均有雞球蟲抗藥性的研究報道，部分藥物的首次抗藥性報道見表1［18］。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同藥物的抗藥性產(chǎn)生速度不同，如聚醚類離子載體抗生素、氨丙啉、尼卡巴嗪等藥物的抗藥性產(chǎn)生較慢；氯羥吡啶、氯苯胍、常山酮、地克珠利等藥物抗藥性產(chǎn)生速度適中；喹啉類（丁氧喹啉、癸氧喹酯、芐氧喹甲酯）藥物的抗藥性產(chǎn)生很快。自90年代，雞球蟲抗藥性問題引起國內(nèi)學(xué)者的關(guān)注，孔繁瑤等［41］從我國12個省區(qū)分離15株柔嫩艾美耳球蟲，并檢測分離株對5種球蟲的敏感性，發(fā)現(xiàn)分離株僅對國內(nèi)尚未廣泛使用的地克珠利敏感，對其他4種抗球蟲藥物均表現(xiàn)不同程度抗藥性；劉群［42］對山東地區(qū)雞球蟲抗藥性進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不同蟲種對聚醚類離子載體抗生素和常山酮等都存在不同程度抗藥性，僅對地克珠利敏感；謝明權(quán)等［43］對廣東地區(qū)雞球蟲抗藥性進行分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)蟲株對聚醚類離子載體抗生素表現(xiàn)為強抗藥性，并存在交叉抗藥性。隨后，國內(nèi)學(xué)者對我國不同地區(qū)雞球蟲抗藥性情況進行研究，進一步證實雞球蟲幾乎對所有抗球蟲藥物都能產(chǎn)生抗藥性，并且存在嚴(yán)重的多重抗藥和交叉抗藥。因此，不斷研制新藥以及合理應(yīng)用已有藥物，延緩球蟲抗藥性的產(chǎn)生，延長抗球蟲藥物的使用壽命，可以提高抗球蟲藥物的治療效果。

3 雞球蟲病疫苗研制

3.1 活卵囊疫苗

雞球蟲免疫是一種帶蟲免疫，雞攝入少量球蟲活卵囊后，卵囊在體內(nèi)繁殖，新產(chǎn)生的卵囊隨糞便排于墊料，并在環(huán)境中完成孢子化，雞再次攝入孢子化卵囊，經(jīng)2～3次輕度的循環(huán)感染而刺激雞體產(chǎn)生免疫力。目前，投入市場應(yīng)用的雞球蟲病疫苗以活卵囊疫苗為主。1951年美國批準(zhǔn)了第一個商品化的雞球蟲病活卵囊疫苗，此后加拿大、英國、捷克、澳大利亞、西班牙、中國等陸續(xù)批準(zhǔn)雞球蟲病活疫苗上市（表3）［44-45］。

3.1.1 強毒活卵囊疫苗 雞球蟲病強毒活卵囊疫苗是由未經(jīng)任何致弱處理的強毒株研制而成。 美國研制的 CocciVac?-B、CocciVac?-D、VACM?、ADVENT?、Inovocox?， 加拿大研發(fā)的 Immucox?C1、Immucox?C2 以及新西蘭研制的Nobilis?COX-ATM為強毒活卵囊疫苗［46］。強毒活疫苗使用期間，不使用抗球蟲藥物，疫苗免疫后出現(xiàn)不良反應(yīng)的風(fēng)險較大，控制接種后雞舍墊料中疫苗蟲株經(jīng)生活史循環(huán)排出的卵囊數(shù)量尤為重要。因此，有學(xué)者提出以抗藥性強毒株制備活疫苗，其中商品化疫苗Nobilis?COX-ATM和VACM?均由抗離子載體類藥物強毒蟲株組成［47］，該類疫苗在免疫過程中可以使用離子載體類抗球蟲藥治療野毒蟲株的感染，不影響雞體產(chǎn)生免疫力，但此類疫苗使用的是抗藥性強毒株，如在野外產(chǎn)生多重抗藥或交叉抗藥，雞群存在暴發(fā)球蟲病的風(fēng)險，其臨床應(yīng)用受到一定的局限性。

3.1.2 弱毒活卵囊疫苗 為克服強毒活卵囊疫苗的不良反應(yīng)，研究人員先后使用加熱、冷凍、輻照、雞胚傳代培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)及早熟選育等致弱方式對球蟲進行毒力減弱研究［48-52］。1989年，第一個早熟選育系雞球蟲病活疫苗Paracox?-5和Paracox?-8研制成功［53］。以雞胚致弱與早熟選育相結(jié)合，Shirley等［54］研制了 Livacox?Q、Livacox?T。隨后，早熟選育技術(shù)成為研制弱毒活卵囊疫苗的首選技術(shù)，國外先后研發(fā)了Eimeriavax?4m、Inmuner?Gel-Coc、Hipracox?Broilers等疫苗；我國于2000年批準(zhǔn)了第一個雞球蟲病疫苗，該疫苗由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜寄生蟲病研究所與上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所共同研制。之后，北京農(nóng)學(xué)院、齊魯動物保健品有限公司、佛山市正典生物技術(shù)有限公司、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所等單位研制的雞球蟲病活卵囊疫苗均獲得國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)。

3.2 重組疫苗

3.2.1 DNA疫苗 DNA疫苗由編碼抗原基因的真核表達質(zhì)粒組成。國內(nèi)外學(xué)者在雞球蟲候選抗原的研究方面已取得一定進展，篩選、鑒定出了保護性抗原：3-1E、14-3-3、EtMIC2、EtMIC1、EnMIC2、MIC4、GX5401、p250、EalA、IMP-1、LDH、EtSAG1、EtCDPK、Gam82、Etp28、cSZ1、SAG10、HSP90和EtHSP70等［55-59］。DNA疫苗存在免疫原性不足等缺點，在免疫過程中可利用疫苗佐劑增強疫苗的免疫原性。DNA疫苗佐劑包括PRR激動劑（TLR1～TLR13）、基因趨化因子（IP-10、CCR7、CCL19、CCL21）、共刺激分子（CD80、CD86、CD40）、干擾素（IFN-α、IFN-γ）和白細(xì)胞介素（IL-1β、IL-2、IL-8、IL-15、IL-17）等［60］。研究顯示，3-1E DNA疫苗與IFN-γ或IL-1β、

IL-8、IL-15的聯(lián)合免疫可有效減少雞體卵囊排出量［61］。Zhang等［62］將pEtK2、IL-2基因亞克隆到真核表達載體pVAX1上，構(gòu)建pVAX1-pEtK2-IL-2質(zhì)粒，肌肉注射免疫發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生免疫力。雞球蟲DNA疫苗研究取得一定進展，但其免疫佐劑、免疫劑量及免疫策略等仍需要進一步研究。

表3 雞球蟲病疫苗Table 3 Vaccines against avian coccidiosis

3.2.2 亞單位疫苗 亞單位疫苗包含重組蛋白或球蟲天然蛋白等保護性抗原。2002年第一個商品化的亞單位疫苗CoxAbic?獲得批準(zhǔn)，該疫苗包含以親和層析純化的巨型艾美耳球蟲配子體天然抗原，疫苗免疫母雞后，可抑制子代雛雞產(chǎn)生卵囊，將雞舍的卵囊數(shù)量控制在一定水平，雛雞通過卵囊循環(huán)而進一步獲得免疫力。Xie等［63］分析了堆型、巨型、毒害和柔嫩艾美耳球蟲裂殖子的保護性抗原，發(fā)現(xiàn)5～12個可溶性蛋白片段和3～7膜蛋白片段。Miller等［64］利用柔嫩艾美耳球蟲子孢子抗原（GX3263）免疫雞1次，可獲得部分保護力，減輕盲腸病變。堆型艾美耳球蟲子孢子表面抗原p240/p160及裂殖子抗原p250均能較好刺激雞體T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)。Belli等［65］克隆、表達重組抗原gam56和gam82（CoxAbic?疫苗的主要抗原組分），免疫雞體可以產(chǎn)生針對堆型、巨型和毒害艾美耳球蟲的部分免疫力。但該類疫苗存在生產(chǎn)成本高、工業(yè)化生產(chǎn)難度較大等缺點。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，利用生物信息學(xué)技術(shù)等設(shè)計可刺激雞體T細(xì)胞、B細(xì)胞表位的免疫原性多肽，為亞單位疫苗的研制提供新思路。

3.2.3 活載體疫苗 活載體疫苗是利用基因工程技術(shù)將編碼抗原的基因?qū)牖钶d體而制成。雞球蟲病的活載體疫苗主要以細(xì)菌、病毒和球蟲為活載體。目前應(yīng)用于球蟲的細(xì)菌載體包括沙門氏菌、大腸桿菌、卡介苗、谷草桿菌和乳酸桿菌等。覃宗華等［66］以減毒沙門氏菌為載體表達堆型艾美耳球蟲子孢子表面抗原cSZ1，經(jīng)口免疫4日齡雛雞，免疫后2周可檢測到特異性抗體，3周時抗體水平達到高峰，隨后進行感染試驗，發(fā)現(xiàn)免疫組排卵囊量明顯減少。已有研究構(gòu)建了重組ZJ111/pcDNA3-5401減毒鼠傷寒沙門氏菌，重組 pMV261-ADF、pMV361-ADF、pMV361-rho、pMV361-rho-IL2卡介苗，重組EtAMA1乳酸桿菌和重組3-1E芽孢桿菌等以細(xì)菌為載體的疫苗，以及重組rFPV-Rhomboid的雞痘病毒疫苗和重組Etp28的桿狀病毒疫苗［67］。隨著CRISPR/Cas9等轉(zhuǎn)基因技術(shù)在球蟲上的成功應(yīng)用，使得以轉(zhuǎn)基因球蟲作為疫苗活載體成為可能，為活載體疫苗研究提供技術(shù)儲備。

4 展望

傳統(tǒng)的雞球蟲病防控策略主要采用“預(yù)防為主、治療為輔”的方式。自1948年磺胺喹噁啉及1951年雞球蟲病活卵囊疫苗上市以來，國內(nèi)外先后有40多個抗球蟲藥物和20余種雞球蟲病活疫苗在臨床應(yīng)用。自1986年瑞士開始實施“禁抗”以來，挪威、丹麥、歐盟、美國、中國和巴西等國家或地區(qū)先后實施“減抗替抗”政策，歐盟于2012年全面禁止在飼料中添加抗球蟲藥物預(yù)防雞球蟲病，限制或禁止抗球蟲藥物在飼料中添加使用已成為一大趨勢，集約化養(yǎng)雞場球蟲病的防控面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。目前，雞球蟲病活疫苗已得到較為廣泛的使用，但由于雞球蟲特殊的生物學(xué)特性，免疫接種不能完全取代抗球蟲藥物。自1990年成功研制山度霉素以來，至今無新的抗球蟲藥物面世，主要原因在于對雞球蟲藥靶研究仍較少，而雞球蟲病傳統(tǒng)活卵囊疫苗存在病原擴散等問題，重組疫苗僅能誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生部分保護力無法取代傳統(tǒng)活卵囊疫苗。因此，未來需要聯(lián)合多組學(xué)與生物技術(shù)，進一步研究雞球蟲抗藥性機制，挖掘藥靶，闡明球蟲入侵機制及球蟲與宿主的相互作用機理，進而利用各種平臺技術(shù)篩選高效抗球蟲先導(dǎo)化合物和重要的保護性抗原，為抗球蟲新藥研究與疫苗研制提供理論基礎(chǔ)。