陳蒙恩，侯建光，張振科，韓素娜，李建民，陳偉平，王二英，胡曉龍

（1.河南仰韶酒業(yè)有限公司，河南 三門峽 472400；2.河南仰韶生物科技有限公司，河南 三門峽 472400；3.鄭州輕工業(yè)大學，河南 鄭州 450002）

中國白酒歷史悠久，它是以高粱等谷物為原料，以酒曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、發(fā)酵、蒸餾等工藝而制成的，因此，酒曲在釀酒過程中扮演著重要的角色[1-3]。固態(tài)法白酒大多采用大曲作為糖化發(fā)酵劑，它蘊含了釀酒所需的多種微生物和酶，可促使原料發(fā)生糖化、發(fā)酵和產(chǎn)香等生化反應，從而賦予白酒獨特的風味，而大曲中的微生物則是決定大曲品質的核心因素[4-7]。研究表明，大曲在白酒釀造過程中不僅提供了大量的釀酒功能微生物，其本身所含有的大量風味物質或其前體物質在釀造過程中亦可直接或間接地進入酒體，從而賦予白酒獨特的風味，并對白酒的質量起到關鍵作用[1，5，8]。目前，對大曲的研究多趨向于單一的風味或微生物指標[9]，而對微生物與風味成分之間的相關性以及如何基于現(xiàn)代檢測手段，建立更加全面科學的大曲評價標準的研究較少。

以往對大曲微生物的研究多采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法[10]，但該方法自身存在一定缺陷，無法全面地認識大曲中的微生物[11-12]。相比之下，高通量測序技術作為新一代測序手段，可方便快捷地對樣品中復雜的微生物菌群結構進行分析[9，13-14]，且高通量測序檢測到的是樣品中所有微生物的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）序列，能夠更加客觀的反應樣品中微生物群落結構的真實性[15]。目前，利用高通量技術對大曲中微生物群落結構進行分析，并進一步對大曲的揮發(fā)性風味成分進行相關性研究已有文獻報道[16-17]，但對陶融型大曲[18-19]微生物群落結構多樣性與揮發(fā)性風味成分的相關性研究尚未見報道。

本研究采用高通量測序手段，對成品陶融型大曲的微生物群落結構多樣性進行研究，得出陶融型大曲中主要的微生物群落構成，并與大曲的揮發(fā)性風味成分進行相關性分析，為解析陶融型大曲的生香機理及篩選優(yōu)良釀造功能微生物提供堅實的理論依據(jù)；同時，可通過進一步研究，將個別優(yōu)勢釀酒功能微生物作為優(yōu)質大曲的評判指標，結合原有評價體系，有望形成一套更加合理的大曲評價標準。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 大曲樣品

對河南某公司夏季同時培養(yǎng)的4房陶融型大曲成品進行取樣，大曲的培養(yǎng)時間為30 d，每房曲均采用四點中心法進行取樣（大曲在入房培養(yǎng)室時對要取樣的曲塊進行標記，在大曲培養(yǎng)過程中進行翻曲、打攏、并房時仍將其放至指定位置），樣品粉碎后過40目篩，采用四分法濃縮后至于無菌袋內4 ℃保存。

1.1.2 主要試劑

DNA Ladder 2000、DL 2000 TMDNA Marker：寶生物工程（大連）有限公司；Soil DNA Kit提取試劑盒：美國OMEGA公司；蛋白酶K、溶菌酶：美國Sigma公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒：美國AxyPrepDNA公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-VS2 型超凈工作臺：無錫易純凈化設備有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；NanoDrop 2000微量分光光度計：美國ThermoFisher公司；GeneAmp?9700 型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；MX-S型可調式混勻儀：美國SCILOGEX公司；QuantiFluorTM-ST 藍色熒光定量系統(tǒng)：美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲揮發(fā)性風味成分檢測

利用頂空固相微萃取及氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（headspacesolidphasemicroextractionandgaschromatographymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）[20]對剛培養(yǎng)成熟的4房陶融型大曲的揮發(fā)性風味成分進行檢測。

HS-SPME條件：準確稱取3.0 g大曲樣品置于20 mL頂空瓶中；孵化爐溫度設為60 ℃，孵化10 min；萃取40 min；進樣口溫度設為260 ℃，解吸2 min；后自動進行GC-MS分析。

GC-MS條件：毛細管色譜柱為DB-FFAP（60m×250μm×0.25 μm），260 ℃條件下自動不分流進樣；程序升溫：35 ℃保持3 min，5 ℃/min升至100 ℃保持3 min，5 ℃/min升至150 ℃保持3min，10℃/min升至230℃保持3 min；載氣：高純度氦氣（He），流速為1.00 mL/min；離子源：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度300 ℃，掃描范圍30～550 u。

定性及半定量：將大曲揮發(fā)性風味物質的質譜圖與標準譜庫（NIST05a.L）進行對比鑒定，匹配度＞800的鑒定結果予以確認；以乙酸正丁酯為內標，將大曲樣品中鑒定的揮發(fā)性化合物的濃度與乙酸丁酯質量濃度作比進行計算。

1.3.2 大曲微生物總DNA提取及PCR擴增定量

采用Soil DNA Kit對大曲微生物總基因組DNA進行提取，提取方法按照試劑公司提供的實驗操作指南進行。利用NanoDrop 2000微量分光光度計對提取的微生物DNA濃度及純度進行檢測，將檢測合格的DNA提取物置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR采用TransGen AP221-02，TransStart Fastpfu DNA聚合酶，20μL反應體系：5×FastPfuBuffer4μL，2.5mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）2 μL；正向引物（5μmol/L）0.8μL；反向引物（5μmol/L）0.8μL；FastPfu聚合酶0.4μL；牛血清蛋白（bovineserumalbumin，BSA）0.2 μL；Template DNA 10 ng；補雙蒸水（ddH2O）至20 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，28個循環(huán)后；72 ℃延伸10 min，10 ℃保持至停止。每個樣本按照正式實驗進行3個重復，同一樣本的擴增產(chǎn)物合并混合后進行電泳檢測，采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒對不同樣本的PCR擴增產(chǎn)物進行切膠回收，Tris HCl洗脫；2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時對不同大曲樣本的PCR擴增產(chǎn)物進行熒光定量。

1.3.3 高通量測序與數(shù)據(jù)分析

樣本的建庫和測序由上海凌恩生物科技有限公司完成。高通量測序針對細菌16S rRNA基因515F_907R區(qū)域，真菌ITS1F_ITS2R區(qū)序列，設計帶核苷酸便簽[21]的特異引物，測序平臺為Illumina MiSeq。通過雙末端測序[22]，將基因序列進行初級篩選，通過barcode找對應編號樣本，去掉引物，再把質量差的序列剔除。通過提取優(yōu)化序列中的非重復序列，降低分析中間過程冗余計算量（http：//drive5.com/usearch/manual/dereplication.html）；去除沒有重復的單序列（http：//drive5.com/usearch/manual/singletons.html）；操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類采用97%的相似性進行，去除嵌合體后得到OTU的代表序列。

1.3.4 相關性分析[23]

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析、繪圖采用Origin9.0軟件、相關性分析采用SPSS19.0軟件，顯著性水平設定在5%。

2 結果與分析

2.1 大曲樣品中揮發(fā)性風味成分檢測

對剛培養(yǎng)成熟的4房陶融型大曲的揮發(fā)性風味成分進行檢測，結果見表1。由表1可知，4房大曲共檢測到45種揮發(fā)性風味成分，分為9類，其中酯類化合物種類及含量最高（17種，含量為331.92 μg/g），其次是醇類化合物（7種，含量為273.34 μg/g）、芳香族類化合物（3種，含量為184.88 μg/g）和吡嗪類化合物（4種，含量為65.99 μg/g）。

2.2 高通量原始數(shù)據(jù)獲取及統(tǒng)計學分析[24-25]

通過Illumina PE250高通量測序篩選獲取有效基因組序列信息，測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計見表2。由表2可知，經(jīng)過分析統(tǒng)計，4房大曲樣品共獲得細菌有效序列145 532條，平均長度在370 bp以上，測序長度主要分布在351～400 bp（99.98%）之間，與設計引物擴增長度接近，由此判斷測序結果較好。共獲得真菌有效序列149 091條，平均長度約為280 bp，測序長度集中分布在251～300 bp，與設計引物擴增序列長度為300 bp左右較接近，說明本次測序結果較合理，保證了足夠的測序數(shù)量，可以滿足后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

表2 文庫測序情況數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 Statistics of sequences data

2.3 大曲微生物聚類

稀釋曲線可以用來比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，當曲線趨向平緩時，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU[16]。對不同樣品之間共有的以及獨有的OTU數(shù)進行疊加，得出4個大曲樣本中微生物OTU分布的Venn圖[26-28]見圖1。由圖1可知，4房陶融型大曲中共獲得細菌OTU數(shù)目為68個，其中共同擁有的OTU數(shù)目為44個，占OTU總數(shù)的65%；共獲得真菌OTU數(shù)目為47個，其中共同擁有的OTU數(shù)目為25個，占OTU總數(shù)的53%。

圖1 大曲文庫內OTU的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of OTUs of Daqu libraries

2.4 Shannon指數(shù)和Rank指數(shù)分析

為研究樣品的取樣量能否代表原樣品物種豐富度，對樣品的個數(shù)和物種的種類做稀釋分布曲線[29-30]，從而評估所構建的文庫的覆蓋率是否達到飽和，結果見圖2；以97%的序列相似度水平作為OTU的界定，通過分析樣品的OTU數(shù)目及分布情況，來反映樣品中所含種群的多樣性及豐富度；通過Shannon指數(shù)[31]反映樣本中微生物多樣性；Rank-Abundance[32]來解釋樣品物種豐度和物種均勻度，結果見圖3、圖4。

圖2 樣品稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curve of samples

圖3 樣本的Shannon曲線Fig.3 Shannon curves of samples

圖4 OTU等級豐度曲線Fig.4 OTU rank-abundance curves

根據(jù)圖2和圖3的結果可得，各曲樣的稀釋性曲線和Shannon曲線都隨測序深度的增加呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢，這表明測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度能夠反映出樣品中絕大多數(shù)微生物的物種信息。圖2中細菌文庫內OTU數(shù)目表現(xiàn)為ZW4＞ZW5＞ZW1＞ZW2；真菌文庫的OTU數(shù)目表現(xiàn)為ZW4＞ZW1＞ZW5＞ZW2，與細菌文庫基本一致。從Rank-abundance曲線（圖4）可以看出，細菌微生物多樣性豐度及均勻度均高于真菌。

2.5 陶融型大曲群落結構組成

對大曲樣品中微生物OTUs信息豐度進行加權聚類分析[33-34]，結果見圖5、圖6。由圖5、圖6可知，從獲得的145 532條大曲細菌優(yōu)質序列中可以歸類到7個門，分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍藻門（Cyanobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、未分類細菌（Bacteria-Unclassified）。其中變形菌門、厚壁菌門和放線菌門占比較大，分別為52.22%、41.51%和2.52%，厚壁菌門為大曲中的優(yōu)勢微生物，可能是優(yōu)勢細菌屬屬于該門，且厚壁菌門主要由芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭菌綱（Clostridia）等微生物組成[35]，具有很強的環(huán)境適應性，能夠在相對極端的條件保持生長代謝；放線菌廣泛分布于土壤環(huán)境、海洋環(huán)境、植物體及其他極端自然生態(tài)環(huán)境中，和厚壁菌門相似，也具有極強的耐受性[36]。從獲得的149 091條大曲真菌優(yōu)質序列中可以歸類到3個門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）。其中子囊菌門真菌占比最大，達99.38%，接合菌門和擔子菌門共占0.62%。

圖5 聚類樹與柱狀圖組合Fig.5 Cluster tree and histogram combination

圖6 微生物群落結構Fig.6 Structure of microbial community

在屬的水平上細菌共得到40個屬，將豐度低于1%的合并為一類（Others），由圖6可知，4個曲樣中豐度較高的為泛菌屬（Pantoea，45.32%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，15.15%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，10.89%）、克羅諾桿菌屬（Cronobacter，8.36%）、乳桿菌屬（Lactobacillus，6.02%）、魏斯氏菌屬（Weissella，5.02%）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora，1.88%）、嗜熱放線菌（Thermoactinomyces，1.63%）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia，1.58%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus，1.02%）、Mitochondrianorank（1.08%）、乳球菌屬（Lactococcus，0.86%）。4個曲樣的優(yōu)勢細菌屬為泛菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、克羅諾桿菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬。

4個曲樣中，在屬的水平上真菌OTU可歸為28個屬。真菌群落豐度不如細菌群落，是因為大曲在培養(yǎng)過程中頂火溫度超過50 ℃，致使大部分真菌死亡，只有少部分耐熱和嗜熱真菌得以存活[37-38]。4個曲樣中的優(yōu)勢真菌屬為嗜熱子囊菌屬（Thermoascus，44.07%）、Unidentified（37.58%）、曲霉屬（Aspergillus，10.04%）、嗜熱真菌屬（Thermomyces，3.79%）、鏈格孢霉屬（Alternaria，1.78%）、泡波曲霉屬（Emericella，1.02%）、威克漢姆酵母（Wickerhamomyces，0.78%）、根毛霉屬（Rhizomucor，0.42%）。

2.6 優(yōu)勢微生物與大曲風味物質的相關性分析

大曲優(yōu)勢微生物與風味物質的相關性分析結果見表3。由表3可知，芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）與吡嗪類、芳香族類、酸類、酯類均呈顯著正相關性（P＜0.05），芽孢桿菌等耐熱微生物是大曲中吡嗪類、芳香族類等風味物質的主要產(chǎn)生菌，在其他學者的研究成果中已有報道[39-43]，這與本研究結果保持一致；魏斯氏菌屬（Weissella）與吡嗪類、酮類、酸類、酯類均呈顯著正相關性（P＜0.05），這與現(xiàn)有文獻相一致[44]。通過對大曲中的微生物和揮發(fā)性風味成分進行相關性分析，結合傳統(tǒng)感官對大曲的認識，能夠找到感官指標與微生物形態(tài)呈現(xiàn)的關系，如果通過進一步研究，將個別優(yōu)勢微生物作為大曲評判的指標，結合原有評價體系，能夠形成一套對大曲更加合理的評價標準。

表3 微生物與風味成分的相關性Table 3 Correlation between microbe and flavor component

續(xù)表

3 結論

大曲是白酒釀造中功能微生物的主要來源，大曲微生物群落結構的組成往往決定著白酒的質量。本研究利用高通量測序技術對成品陶融型大曲的微生物群落結構進行了系統(tǒng)研究，結果表明，剛出房的成品陶融型大曲中細菌的物種多樣性高于真菌，大曲中共檢測到細菌OTU數(shù)為68，真菌OTU數(shù)為47。微生物豐度統(tǒng)計表明，大曲細菌優(yōu)勢菌屬主要為泛菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、克羅諾桿菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬六大類，六類菌屬共占大曲細菌多樣性的90.76%，同時還檢測到了糖多孢菌屬、嗜熱放線菌、Mitochondrianorank、乳球菌屬等；大曲的優(yōu)勢菌屬主要為嗜熱子囊菌屬、曲霉屬、嗜熱真菌屬、鏈格孢霉屬、泡波曲霉屬五大類，五類菌屬共占大曲真菌多樣性的60.70%，同時還檢測到了鏈格孢霉屬、泡波曲霉屬、威克漢姆酵母、根毛霉屬等。相關性分析結果表明，大曲中厚壁菌門下的芽孢桿菌屬、乳桿菌屬與大曲中吡嗪類、酯類、芳香族類等多數(shù)揮發(fā)性風味成分呈顯著正相關性，說明這兩類微生物是大曲制作過程中風味物質的主要產(chǎn)生菌，這與以往其他學者的研究結果相一致。

開放的制作環(huán)境是大曲微生物的主要來源，獨特的制曲工藝和地域菌群環(huán)境是造酒陶融型大曲特有微生物菌群構成的根本。因此，對大曲微生物群落結構的構成及大曲揮發(fā)性風味成分的相關性進行系統(tǒng)研究，將有助于解析陶融型白酒典型風格的成因。同時，可結合大曲傳統(tǒng)的感官評價體系，將個別優(yōu)勢釀酒功能微生物作為大曲評判的指標，有望形成一套對大曲更加合理的評價標準。該研究結果為解析陶融型大曲揮發(fā)性風味物質的形成機理及完善大曲質量評價標準提供了新的視角。