周思聰， 趙 宇， 沈匯超， 何 卿， 葛晴宇

（1.江蘇省環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省環(huán)境科學(xué)研究院， 江蘇 南京 210036；2.江蘇省環(huán)科院環(huán)境科技有限責(zé)任公司， 江蘇 南京 210036）

0 引言

湖泊富營養(yǎng)化問題是全球范圍內(nèi)普遍面臨的水環(huán)境問題之一，其發(fā)生的主要原因是水體N，P 等營養(yǎng)元素含量過高，超出了水體的自凈能力，藻類大量繁殖，水質(zhì)惡化，嚴(yán)重威脅生態(tài)健康與用水安全[1-3]。洪澤湖是我國第四大淡水湖， 具有獨(dú)特的自然環(huán)境條件和特殊的濕地生物資源，承接淮河、懷洪新河、新汴河等上游水體來水。 近年來， 由于外源污染加重、內(nèi)源污染釋放、圍湖墾植、外來物種入侵等多種原因，水生資源遭到破壞，湖體自凈能力受到一定損害[4-5]。2018年，洪澤湖總體呈輕度富營養(yǎng)化狀態(tài)，水質(zhì)為V 類， 主要污染指標(biāo)為TP，COD 和CODMn指數(shù)。 洪澤湖西北部濕地位于洪澤湖上游，挺水植物、沉水植物等濕生植物分布廣泛，對懷洪新河、新汴河等上游來水具有重要緩釋作用， 在控制湖區(qū)污染狀況方面具有一定效用。

國內(nèi)外學(xué)者已對濕地的凈化功能進(jìn)行了大量研究。 濕生植物是濕地凈化作用的關(guān)鍵，植物根系及葉面可吸收N，P 等營養(yǎng)物質(zhì)，起到一定的截留作用[6-9]。濕地基質(zhì)和底泥則可吸收和吸附水體中的營養(yǎng)物質(zhì)，達(dá)到控制水體富營養(yǎng)化水平的效果[10-11]。微生物也是濕地生態(tài)系統(tǒng)凈化過程的重要參與者， 通過新陳代謝分解或轉(zhuǎn)化水體中污染物[12-13]， 從而改善水體水質(zhì)， 微生物學(xué)研究也成為了濕地凈化機(jī)制與功能研究的重要環(huán)節(jié)。

本研究將水體、 底泥和微生物作為整體進(jìn)行研究，分析洪澤湖濕地水體富營養(yǎng)化狀況的時(shí)空變化，表征洪澤湖濕地對水體富營養(yǎng)化的控制效果， 對相關(guān)環(huán)境因子的特征進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和保存

水樣和底泥樣品采集自洪澤湖西北部濕地的7個(gè)位點(diǎn)，點(diǎn)位分布見圖1。 水樣的采集和保存均依據(jù)GB/T 5750.2—2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 水樣的采集與保存》。用于檢測常規(guī)指標(biāo)的樣品4 ℃冷藏保存，待微生物檢測的樣品使用干冰保存，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。

圖1 樣品采集點(diǎn)位

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 常規(guī)指標(biāo)

常規(guī)指標(biāo)的測試方法見表1。

表1 常規(guī)指標(biāo)的檢測方法與依據(jù)

1.2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

（1）DNA 抽提和PCR 擴(kuò)增

（2）Illumina Miseq 測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物， 利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences,Union City, CA, USA) 進(jìn)行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。 利用QuantiFluorTM-ST (Promega,USA)進(jìn)行檢測定量。本研究中所有底泥樣品由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進(jìn)行測序。

1.3 富營養(yǎng)化指數(shù)

根據(jù)TN，TP，CODMn，SD 和Chl-a 的測定結(jié)果，基于以下計(jì)算過程得出富營養(yǎng)化指數(shù)[14-15]。

（1）評價(jià)因子營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)

TLI（Chl-a）=10（2.5+1.086 lnChl-a）

TLI（TP）=10（9.436+1.624 lnTP）

TLI（TN）=10（5.453+1.694 lnTN）

TLI（SD）=10（5.118-1.94 lnSD）

TLI（CODMn)=10(0.109+2.661 lnCODMn)

式中：TLI 為富營養(yǎng)化指數(shù)；Chl-a 為葉綠素a 的質(zhì)量濃度mg/m3；TP，TN，CODMn分別為TP，TN，CODMn的質(zhì)量濃度mg/L；SD 為水體透明度cm。

（2）相關(guān)權(quán)重

以Chl-a 為基準(zhǔn)， 歸一化計(jì)算各評價(jià)因子的相關(guān)權(quán)重：

式中：j 為評價(jià)因子；rij為評價(jià)因子與基準(zhǔn)參數(shù)Chl-a的相關(guān)系數(shù)；Wj為第j 種參數(shù)營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)的相關(guān)權(quán)重。

各評價(jià)因子的rij和Wj見表2。

表2 相關(guān)系數(shù)與相關(guān)權(quán)重

（3）綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)

TLI（∑）即富營養(yǎng)化指數(shù)，其數(shù)值大小可表征水體所處的富營養(yǎng)化狀態(tài)，數(shù)值越高，營養(yǎng)程度越重。判定標(biāo)準(zhǔn)為：TLI（∑）＜30 指貧營養(yǎng)；30 ≤TLI（∑）≤50 指中營養(yǎng)；TLI（∑）＞50 指富營養(yǎng)；50 ＜TLI（∑）≤60 指輕度富營養(yǎng)；60 ＜TLI（∑）≤70 指中度富營養(yǎng)；TLI（∑）＞70 指重度度富營養(yǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics 分析環(huán)境因子間的相關(guān)性。 使用GraphPad Prism 分析點(diǎn)位間及月份間環(huán)境因子數(shù)據(jù)的差異性。 使用美吉生物云平臺分析底泥樣品高通量測序數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 富營養(yǎng)化特征

2.1.1 水體富營養(yǎng)化狀況

洪澤湖濕地富營養(yǎng)化狀況見圖2。 由圖2 可知，洪澤湖濕地水體在10月份呈輕度富營養(yǎng)化，其余月份基本呈中營養(yǎng)化狀態(tài)。 從時(shí)間上來看，富營養(yǎng)化指數(shù)呈下降趨勢，秋季水體的富營養(yǎng)化指數(shù)高于冬季。溫度可影響物質(zhì)循環(huán)與生物活動(dòng)， 是影響水體富營養(yǎng)化狀態(tài)的關(guān)鍵因素， 較低的溫度可抑制藻類增殖[16]，有助于濕地生態(tài)系統(tǒng)起到更好的富營養(yǎng)化控制效果[17]。從空間上來看，上下游水體富營養(yǎng)化狀態(tài)無顯著差異。 在所有點(diǎn)位中，S4 的富營養(yǎng)化指數(shù)最高，S6的富營養(yǎng)化指數(shù)最低?？臻g差異與水體生態(tài)環(huán)境、人類活動(dòng)量等要素相關(guān)[18]，S6 位于退漁還濕的生態(tài)修復(fù)區(qū)域，植有大量荷花，水體清澈，無人類活動(dòng)干擾，生態(tài)條件較好；S4 位于新挖航道，來往船只較多，水流擾動(dòng)大。 由此可見，濕地植物生長茂盛、人類活動(dòng)量較小的區(qū)域水體質(zhì)量更高， 自然保護(hù)區(qū)管理處采取的濕地生態(tài)修復(fù)措施對改善水體富營養(yǎng)湖狀態(tài)具有一定效果。

圖2 洪澤湖濕地富營養(yǎng)化狀況時(shí)空變化

2.1.2 底泥N，P 含量

底泥N，P 變化見圖3。 由圖3 可知， 從時(shí)間來看， 底泥含N 量總體呈上升趨勢，2月的底泥含N量最高；含P 量變化無明顯規(guī)律。根據(jù)單因素方差分析，10月至次年1月間的底泥含N 量沒有顯著差異，前4 個(gè)月份與次年2月的底泥含N 量均有顯著差異。 根據(jù)自然保護(hù)區(qū)科學(xué)考察報(bào)告，洪澤湖出、入湖水量主要集中在7 ～9月，12月至次年2月為枯水期，因此外源輸入的可能性較小，2月底泥含N 量的顯著增加可能與濕地植物的腐敗降解等內(nèi)源輸入相關(guān)。10月和次年1月、1月和2月間的底泥含P 量有顯著差異，其余月份間無顯著差異。

從空間上來看，各點(diǎn)位的底泥中N，P 含量均無顯著差異，S1，S6 的N，P 含量季節(jié)性波動(dòng)較大，其余點(diǎn)位波動(dòng)較小。 S1 位于入湖河口，沖淤變化比較顯著， 造成底泥N，P 含量的較大波動(dòng)；S6 位于生態(tài)修復(fù)區(qū)， 水體-植物-底泥間的物質(zhì)交換相對頻繁，低溫季節(jié)植物體的枯死可能是造成底泥N，P 含量波動(dòng)的主要原因[19]。

圖3 底泥含N，P 時(shí)空分布統(tǒng)計(jì)

2.1.3 相關(guān)性分析

秋季水體和底泥中N，P 含量的相關(guān)性分析顯示見表3。由表3 可知，水體TP 和底泥TP 顯著負(fù)相關(guān)，說明水體和底泥間存在P 的遷移。對冬季樣本的分析結(jié)果則顯示，水體和底泥中N，P 含量無顯著相關(guān)性，說明冬季水體和底泥間的N，P 含量處于相對平衡的狀態(tài)。

表3 秋季水體與底泥N，P 含量相關(guān)性

2.2 底泥微生物群落結(jié)構(gòu)

微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，14 個(gè)底泥樣本的有效序列數(shù)為20509-555692， 測得的8 387 條OTUs 分屬于59 個(gè)門，158 個(gè)綱，299 個(gè)目，551 個(gè)科，1 012 個(gè)屬和2 220 個(gè)種。通過群落組成分析，洪澤湖濕地底泥微生物主要門類包括變形桿菌門、綠屈撓菌門、酸桿菌門、放線菌門、硝化螺旋菌門、厚壁菌門、藍(lán)細(xì)菌門、Nitrospinae、 疣微菌門、Ignavibacteriae、Aminicenantes、Parcubacteria、螺旋體門、芽單胞菌門、Latescibacteria 和浮霉菌門。 優(yōu)勢門類為變形桿菌門（29.7%～44.4%）、綠屈撓菌門（12.0%～23.5%）、酸桿菌門（5.0%～13.4%）、放線菌門（5.1%～7.6%）、硝化螺旋菌門（3.6%～8.9%）、厚壁菌門（0.9%～8.6%）、藍(lán)細(xì)菌門（1.3%～6.2%）和Nitrospinae（1.9%～4.2%），其它門類的細(xì)菌豐度均低于3%。

眾多研究顯示， 變形桿菌門是湖泊底泥中豐度最高的細(xì)菌門類， 豐度較高的細(xì)菌門類還包括綠屈撓菌門、酸桿菌門、放線菌門、硝化螺旋菌門、厚壁菌門等，但豐度排序與研究對象有關(guān)。本研究中豐度最高的細(xì)菌門類同樣為變形桿菌門， 豐度排序靠前的細(xì)菌門類也與其它研究大致相同。

2.3 環(huán)境因子與微生物群落結(jié)構(gòu)

對秋冬季樣品的RDA 分析結(jié)果見圖4。 由圖4（a）可知，底泥N 含量對底泥微生物群落結(jié)構(gòu)影響的顯著性最高（p=0.004），其次為Chl-a（p=0.12），其余因子的影響不顯著。 底泥N 含量與主要門類細(xì)菌正相關(guān)；Chl-a 與豐度排序第二的綠屈撓菌門正相關(guān)， 與豐度排序第一的變形桿菌門和第三的酸桿菌門負(fù)相關(guān)。 由圖4（b）可知，底泥P 含量對秋季底泥微生物群落結(jié)構(gòu)影響的顯著性最高（p=0.019），其次是底泥N 含量（p=0.148）。 底泥P 含量則與變形桿菌門正相關(guān)，與綠屈撓菌門和藍(lán)細(xì)菌門負(fù)相關(guān)；底泥N 含量和變形桿菌門、綠屈撓菌門和藍(lán)細(xì)菌門正相關(guān)。由此推測，底泥N，P 含量和TN 對濕地底泥的細(xì)菌群落的影響較大。

圖4 秋冬季底泥細(xì)菌門分類群落與環(huán)境因子的RDA 分析

基于威爾科克森秩和檢驗(yàn)，在門水平上，秋冬季2 組樣品微生物相對豐度無顯著性差異。 基于克魯斯卡爾-沃利斯秩和檢驗(yàn)，秋季樣本中，各點(diǎn)位間底泥微生物群落的硝化螺旋菌門、Aminicenantes、Ignavibacteriae、 螺旋體門豐度存在顯著性差異；冬季樣本中，各點(diǎn)位間底泥微生物群落的放線菌門、藍(lán)藻菌門、Nitrospinae、疣微菌門、Parcubacteria、芽單胞菌門、和浮霉菌門豐度存在顯著性差異。隨著季節(jié)變化，底泥微生物群落結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，但不同點(diǎn)位底泥的微生物種群具有差異性。

3 結(jié)論

（1）洪澤湖濕地自然保護(hù)區(qū)水體秋冬季基本呈富營養(yǎng)化狀態(tài)，冬季富營養(yǎng)化水平低于秋季，潛在影響因素有溫度、人類活動(dòng)和植物生長狀態(tài)。

（2）底泥N 含量和P 含量無顯著差異在空間上無顯著性差異。秋季水體和底泥間存在P 遷移；2月的底泥N 含量顯著增加，可能原因是低溫季節(jié)植物枯死，導(dǎo)致N 由植物體向底泥基質(zhì)遷移。

（3）底泥細(xì)菌群落優(yōu)勢門類為變形桿菌門（29.7%～44.4%）、綠屈撓菌門（12.0% ～23.5%）、酸桿菌門（5.0%～13.4%）、放線菌門（5.1%～7.6%）、硝化螺旋菌門（3.6%～8.9%）、厚壁菌門（0.9%～8.6%）、藍(lán)細(xì)菌門（1.3%～6.2%）和Nitrospinae（1.9%～4.2%），微生物群落結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，但空間上有差異性。

（4）底泥N，P 含量和TN 及水體透明度對濕地底泥的物種影響較大。