周文梅，陳洪巖，吳啟南，陳夢，張小龍,*

（1.連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，江蘇連云港 222006；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023）

浮萍是生長在水中的漂浮植物，生長周期短，營養(yǎng)價值高，在飼用、能源開發(fā)、藥用等方面均有巨大的應(yīng)用潛力[1]；在藥用上具有發(fā)汗祛風(fēng)、行水消腫、清熱解毒以及抗感染等諸多功效，素有“發(fā)汗尤勝麻黃，下水捷于通草”的說法[2]。浮萍含有的各種成分與其所生存的水環(huán)境中各種營養(yǎng)元素及其他物質(zhì)的含量存在密切關(guān)系，尤其是各種無機(jī)元素的含量。且越來越多的研究表明，中藥所含有的無機(jī)元素對其藥理藥效發(fā)揮的協(xié)同作用有著重要意義[3-5]。無機(jī)元素的種類及含量不僅是植物遺傳特征的體現(xiàn)，也與不同栽培地區(qū)的環(huán)境因素和種植條件等有很大聯(lián)系[6]。浮萍中含有多種無機(jī)元素，包括各種常量元素、人體必需的微量元素以及對人體有害的重金屬元素等[7]。有研究表明，在一定的條件下，浮萍可用作銅污染的修復(fù)植物[3]，在治理鉛污染水體時是較好的備選植物[8]，其對Hg和Cd污染敏感，可為及時查明水體污染提供簡便的判斷依據(jù)[9]。因此，對浮萍中無機(jī)元素的檢測監(jiān)控，也能夠及時篩選出被重金屬污染的藥用浮萍，防止重金屬對人體產(chǎn)生危害。目前，對于無機(jī)元素的測定常見的方法有原子吸收分光光度法（AAS）、原子熒光光度法（AFS）、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）和電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）等，其中ICP-MS法具有操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好[10]，檢出限低等特點(diǎn)，適用于多種痕量及微量元素的快速同時測定。本實(shí)驗(yàn)采用ICP-MS法測定不同浮萍中25種無機(jī)元素的含量，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量統(tǒng)計分析，從無機(jī)元素含量分布的角度出發(fā)，研究紫萍和青萍之間的差異。

1 材料與方法

1.1 儀器

NexION 350X電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國PerkinElmer公司；EH45B微控數(shù)顯電熱板，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；AG135十萬分之一電子天平，Mettler Toledo公司；Milli-Q純水機(jī)，美國Millipore公司；561B消解罐，美國SAP Molding plastic LLC公司。

1.2 藥品與試劑

來源于不同產(chǎn)地的總計52批浮萍樣品由實(shí)驗(yàn)室自行采收，其中31批為紫萍樣品、21批為青萍樣品，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定分別為浮萍科紫萍屬植物紫萍[Spirodela polyrrhiza（L.） Schleid.]和浮萍科浮萍屬植物青萍（Lemna minorL.）。將采集后的樣品用清水洗凈并挑去雜質(zhì)后曬干，密封于自封袋中置陰涼干燥處保存，備用。

25種無機(jī)元素混和標(biāo)準(zhǔn)溶液，美國Inorganic Ventures公司（批號M2-MEB658480），含鉬（Mo）、錫（Sn）、銻（Sb）濃度為0.5 μg/mL，砷（As）、鎘（Cd）、鈷（Co）、鎳（Ni）、鉻（Cr）、鉛（Pb）、硒（Se）、鉈（Tl）、釩（V）濃度為5 μg/mL，硼（B）、鋇（Ba）、銅（Cu）、錳（Mn）、鈦（Ti）、鋅（Zn）濃度為 50 μg/mL，鍶（Sr）濃度為 100 μg/mL，鋁（Al）、鐵（Fe）濃度為 500 μg/mL，鈣（Ca）、鈉（Na）、鎂（Mg）、鉀（K）濃度為2 000 μg/mL；內(nèi)標(biāo)溶液鍺（72Ge）（批號K2-GE01122AA）、內(nèi)標(biāo)溶液銠（103Rh）（批號K2-RH651766）、內(nèi)標(biāo)溶液鉍（209Bi）（批號K2-BI02014），濃度均為1 000 μg/mL；硝酸，電子級，Aladdin公司；氫氟酸，CMOS級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 測定條件

射頻功率為1 100.00 W，載氣（高純氬氣）流速為1.20 L/min，等離子氣體流速為15.00 L/min，霧化器流量為0.91 L/min，KED碰撞反應(yīng)氣（高純氬氣）流速為3.0 mL/min，檢測電壓為-12.25 V，模擬電壓為-1 600.00 V，脈沖電壓為800.00 V。數(shù)據(jù)采樣模式：跳峰采集模式；重復(fù)次數(shù)為3次，掃描次數(shù)為1 000次。選取同位素72Ge、103Rh、209Bi為本實(shí)驗(yàn)內(nèi)標(biāo)元素，元素以分組形式檢測，其中B、Ca為普通模式檢測，以72Ge為內(nèi)標(biāo)；Sr、Mo、Cd、Sn、Sb、Ba為普通反應(yīng)模式，以103Rh為內(nèi)標(biāo)；Tl、Pb為普通反應(yīng)模式，以209Bi為內(nèi)標(biāo)；Ti、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Si、Na、Mg、K、Al、Fe 為碰撞反應(yīng)模式，以72Ge為內(nèi)標(biāo)；儀器以1 ng/mL的Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U調(diào)諧后進(jìn)行檢測。

1.3.2 對照品及內(nèi)標(biāo)溶液的制備

對照品溶液的制備：取25種無機(jī)元素混和標(biāo)準(zhǔn)溶液，用2% HNO3溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液先稀釋50倍為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再稀釋儲備液配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線以5 μg/mL組元素（即As、Cd、Co、Ni、Cr、Pb、Se、Tl、V）來計算時，標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)分別為 1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、30 ng/mL、50 ng/mL，其他組元素的濃度以此稀釋倍數(shù)來計算。

內(nèi)標(biāo)溶液的制備：分別用2% HNO3配制72Ge、103Rh、209Bi三種單元素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，濃度為1 000 ng/mL；各取1.5 mL加入同一50 mL容量瓶中，用2% HNO3溶液定容至刻度，配制成30 ng/mL的內(nèi)標(biāo)混合液，以三通在線加入內(nèi)標(biāo)溶液及空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液進(jìn)行測定。

1.3.3 供試品溶液的制備

稱取浮萍樣品0.1 g（精確至0.000 1 g）于PFA消解罐（60 mL，耐壓等級為517.11 kPa）內(nèi)，加入5 mL硝酸、1 mL氫氟酸，旋緊蓋子后放置1 h，120 ℃消解1 h，160 ℃消解2 h，冷卻后，緩慢打開蓋子，在電熱板上于100 ℃加熱至消解罐內(nèi)剩余約1 mL左右后用超純水定容至50 mL，混勻備用，同時做空白試驗(yàn)。測定時根據(jù)樣品溶液中元素的含量不同使用2% HNO3溶液進(jìn)行稀釋后進(jìn)樣。

1.3.4 方法學(xué)驗(yàn)證

取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，以各對照品濃度為橫坐標(biāo)，對照品扣除空白后與內(nèi)標(biāo)溶液的響應(yīng)比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，計算檢出限（LOD）；分別取各組元素的同一對照品溶液，按上述條件連續(xù)進(jìn)樣6次記錄結(jié)果，計算精密度RSD，考察精密度；取“1.3.3”項下的同一批供試品溶液，分別在室溫下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，按上述條件進(jìn)樣，計算穩(wěn)定性RSD進(jìn)行穩(wěn)定性考察；精密稱取同一樣品6份，按“1.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按上述條件進(jìn)樣測定，計算各元素含量和重復(fù)性RSD進(jìn)行方法重復(fù)性考察；取同一樣品6份，每份約0.05 g，精密稱定，分別精密加入對照品適量，按“1.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按上述條件進(jìn)樣，進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)考察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SIMCA 14.1（瑞典Umetrics公司）對52批浮萍樣品中25種礦物元素的含量進(jìn)行多維變量及相關(guān)性等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)表明，各元素在各自的線性濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r均大于0.995 0），LOD的范圍在0.000 1～0.360 8 ng/mL。25種無機(jī)元素的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率結(jié)果見表1。如表1所示，精密度試驗(yàn)RSD在0.82%～3.39%，方法重復(fù)性試驗(yàn)RSD范圍為0.83%～4.41%，穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD＜5.91%，說明儀器精密度和方法重復(fù)性均較好，且樣品在24小時內(nèi)穩(wěn)定；25種無機(jī)元素的加樣回收率在82.27%～105.79%，RSD范圍為0.91%～6.61%，表明本方法的回收率良好，準(zhǔn)確度高，能滿足測定要求。

表1 25種無機(jī)元素的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率（n=6）

2.2 樣品含量測定

按上述方法和條件，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定了樣品中各無機(jī)元素的含量。測定結(jié)果表明，浮萍中Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Fe 7種元素的含量很高，尤其是K元素的含量最高，在紫萍中的平均含量為42 756.91 μg/g，在青萍中的平均含量為 42 942.55 μg/g，與現(xiàn)有的文獻(xiàn)報道相一致[5,7]，很可能與浮萍的利尿作用相關(guān)；B、Ti、Zn、Sr、Ba的含量也較高，V、Cr、Co、Ni、Cu的含量較低，As、Se、Mo、Cd、Sn、Sb、Tl、Pb含量最低。其中，B、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Mo為人體必需的微量元素，Na、Mg、K、Ca為人體必需的常量元素。不同的樣品中元素的含量差異較大，而紫萍和青萍之間含有的無機(jī)元素總量無明顯差異，紫萍樣品中25種元素總量最低為43.85 mg/g，最高為128.81 mg/g；青萍樣品中最低為37.82 mg/g，最高為125.98 mg/g。

2.3 統(tǒng)計分析

主成分分析是一種重要的多元統(tǒng)計分析方法，采用主成分分析能夠用少量的因子描述多指標(biāo)變量之間的關(guān)系，在中藥質(zhì)量評價中的應(yīng)用日益廣泛[11-12]。數(shù)據(jù)經(jīng)Par尺度化（Pareto Scaling）進(jìn)行歸一之后建立主成分分析（PCA）及偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）的三維模型，擬合的PCA模型有3個主成分，所有樣品均無明顯異常點(diǎn)，R2X（cum）=0.897，能夠較好地反映原始無機(jī)元素含量的信息，第一主成分貢獻(xiàn)率為53.9%，得分圖見圖1；經(jīng)交叉驗(yàn)證后擬合的OPLS-DA模型中有1個預(yù)測主成分和3個正交主成分，R2X（cum）為0.931，得分圖見圖2，經(jīng)200次排列實(shí)驗(yàn)（Permutation test）后的R2Y與Q2Y的截距分別為0.113和-0.276，說明該模型穩(wěn)定，不存在過擬合現(xiàn)象。

可見，在所建立的PCA及OPLS-DA模型中，青萍和紫萍均相互聚在一起，無明顯區(qū)分，表明兩種浮萍中無機(jī)元素的含量無明顯差異；對OPLS-DA模型的相關(guān)系數(shù)分析表明，僅Mg元素的回歸系數(shù)有顯著性差異（P＜0.05），結(jié)合S-Plot及Loading圖可知，Mg元素對于模型的建立具有重要作用，且其含量在紫萍和青萍整體間存有一定區(qū)別，但并不能反應(yīng)兩種浮萍之間存在顯著差異。

3 結(jié)論

采用ICP-MS法測定了浮萍中25種無機(jī)元素的含量，并對各元素含量的測定結(jié)果進(jìn)行了多變量分析。結(jié)果表明，兩種浮萍中含量最高的元素均為K，可能與其利尿功效相關(guān)，人體必需的微量元素Mn、Fe在浮萍中含量很高，B、Zn的含量也較高；浮萍藥理藥效作用的發(fā)揮可能與其體內(nèi)的礦物元素有著密切的關(guān)系，另一方面也說明浮萍存在較高的營養(yǎng)價值。浮萍樣品中元素的含量差異較大，雖然Mg元素的含量在紫萍和青萍整體間存有一定差異，但紫萍和青萍之間含有的無機(jī)元素總量無明顯區(qū)別，PCA及OPLSDA兩種模式識別方法也均表明紫萍和青萍中的礦物元素含量無顯著性差異。

圖1 浮萍無機(jī)元素含量的三維PCA得分圖

圖2 浮萍無機(jī)元素含量的三維OPLS-DA得分圖