姚菲菲 王富霞 李增艷

NSCLC的診斷和治療技術(shù)在不斷提高，但肺癌患者的總生存率并未顯著提高，主要由于患者早期就診率低，確診時(shí)大多已處于晚期階段[1]。Rab17是近年來的由人染色體2q32-q37或18q2lq22編碼的Rab GTP酶家族的一員，與其他Rab蛋白不同，它主要在富含上皮細(xì)胞的器官中表達(dá)[2]，在調(diào)節(jié)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用[3]。上皮細(xì)胞的極性喪失被認(rèn)為與癌癥的進(jìn)展息息相關(guān)，在乳腺癌從癌前病變逐漸發(fā)展至浸潤性癌的過程中，伴隨著上皮極性的逐漸喪失[4]。目前研究顯示Rab25的表達(dá)降低可促卵巢癌、乳腺癌和皮膚鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展，提示Rab25在多種上皮性腫瘤中發(fā)揮一定作用[5-7]。Rab17是第一個(gè)被鑒定出來的上皮細(xì)胞特異性小GTP酶，隨著上皮極性的喪失其表達(dá)水平逐漸降低[2]，并有研究顯示Rab17水平降低可增加肝細(xì)胞癌的侵襲性[8]。目前在NSCLC中的研究較少，本文主要探討Rab17在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)水平，對細(xì)胞增殖和侵襲的影響及可能的作用機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

正常人支氣管上皮細(xì)胞Bease-2B和NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、H460、HCC827均購于上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、MTT粉末、多聚甲醛、結(jié)晶紫、顯影劑和Giemsa染料等購于北京鼎國有限公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和lipofeetamine 2000購于日本TaKaRa公司；Transwell實(shí)驗(yàn)的小室和遷移試驗(yàn)中的小室均購于美國Corning公司；anti-VEGF、anti-STAT3、anti-p-STAT3、anti-HIF-1α、anti-β-actin和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購于Cell Signal公司；Rab17質(zhì)粒由廣州銳博生物有限公司合成；BCA蛋白定量試劑盒購于江蘇碧云天有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 按照Trizol試劑說明提取細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測樣品純度，合格的樣本反轉(zhuǎn)錄為cDNA。50μl PCR反應(yīng)體系，94℃，5min，然后 94℃，1min，退火40s，72℃，50s設(shè)置30個(gè)循環(huán)，72℃，7min。Rab17上游引物序列為5′-GTGGGCAACAAGACGGACCT VAG-3′、下游引物序列為5′-CTCGCGGGCC CCTTGT TCAG-3′, GAPDH上游引物序列為5′-GCACCGTCAAGGCTGA GAAC-3′、下游引物序列為5′-TGGTGAAGACGCCAGTG GA-3′。cDNA采用BIO-RAD CFX96系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測 Rab17的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參。每個(gè)待測基因設(shè)6個(gè)復(fù)孔，數(shù)據(jù)通過BIO-RAD CFX96系統(tǒng)進(jìn)行處理，按照公式RQ=2-ΔΔCT計(jì)算各組間的倍數(shù)關(guān)系。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) A549細(xì)胞在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置37℃、5%CO2的恒溫箱中，待細(xì)胞密增生長到80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。A549細(xì)胞以104個(gè)/孔的密度接種于6孔細(xì)胞板，常規(guī)培養(yǎng)24h，細(xì)胞融合度約為70%，將A549細(xì)胞隨機(jī)分為Rab17組(轉(zhuǎn)染Rab17質(zhì)粒)、NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒)、Crontrol組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒)，按照脂質(zhì)體lipofeetamine 2000說明書步驟操作，轉(zhuǎn)染6h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集各組細(xì)胞，qRT-PCR和Western blot 檢測轉(zhuǎn)染效果。

3 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集Rab17組、NC組、對照組細(xì)胞加入蛋白裂解液，收集上清，BCA蛋白定量試劑盒檢測提取蛋白濃度，每個(gè)樣本定取30 μg蛋白，沸水煮變性。制作10%的分離膠和5%的濃縮膠，加入蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。根據(jù)maker和目的蛋白分子量大小切取適當(dāng)大小的膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h、滴加anti-Rab17抗體(1 ∶1000)在4℃冰箱中過夜孵育。采用TBST溶液清洗3遍，每次10 min。滴加二抗(1 ∶4000)室溫孵育1h，采用TBST溶液清洗3遍，每次10min。配置一定量的顯影液，均勻滴加在膜上，置于Amersham Imager600凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

4 MTT實(shí)驗(yàn) Rab17組、NC組和Crontrol組細(xì)胞以每孔2×103的密度接種于96孔板中，接種后每12h檢測一次，每個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6個(gè)平行孔，20 μL MTT溶液加入檢測孔中，放置恒溫箱中繼續(xù)孵育4h。然后去除上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶液，震蕩5 min使細(xì)胞充分裂解，然后用酶標(biāo)儀檢測570nm處的吸光度值(OD)，OD值與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。

5 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn) Rab17組、NC組和Crontrol組細(xì)胞以每皿100萬的密度接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)14 d，用Giemsa液染色15 min；在倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)所形成的克隆(≥50個(gè)細(xì)胞計(jì)為克隆)。

6 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) Rab17組、NC組和Crontrol組細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基懸浮以2×104的密度接種于小室里面(遷移實(shí)驗(yàn)的小室不含有基質(zhì)膠，侵襲實(shí)驗(yàn)的小室含有基質(zhì)膠)。在小室下部加入500 μL含有10%血清的培養(yǎng)基，孵育48h。取出小室放入多聚甲醛中固定10 min，然后至于0.1%結(jié)晶紫中染色30 min。用棉簽輕輕擦去小室上部未發(fā)生遷移或侵襲的細(xì)胞，置于顯微鏡下，每個(gè)孔從上至下選擇5個(gè)視野拍照。

三、 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、 Rab17在正常人支氣管上皮細(xì)胞和NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)情況

NSCLC細(xì)胞A549、H460和HCC827中Rab17 mRNA的相對表達(dá)水平均低于正常人支氣管上皮細(xì)胞Bease-2B，P<0.001。Rab17在NSCLC細(xì)胞中表達(dá)與Bease-2B細(xì)胞相比均較弱，A549細(xì)胞中的表達(dá)水平最低(見圖1)。

圖1 Rab17在NSCLC細(xì)胞中表達(dá)減弱

二、 Rab17質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中使其表達(dá)增加

Rab17質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，NC組細(xì)胞Rab17 mRNA的相對表達(dá)水平與對照組相比無差異，Rab17組細(xì)胞Rab17 mRNA的相對表達(dá)水平高于對照組和NC組，P<0.001。對照組和NC組Rab17的蛋白表達(dá)水平無明顯差異，Rab17組Rab17的蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組和NC組，Rab17質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中(見圖2)。

圖2 Rab17質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞

三、 Rab17對細(xì)胞增殖的影響

Rab17組細(xì)胞在培養(yǎng)72h時(shí)的OD值小于Control和NC組，Rab17組細(xì)胞培養(yǎng)14d后形成的集落數(shù)顯著少于Control和NC組(見圖3)。

圖3 Rab17抑制A549細(xì)胞的增殖

四、 Rab17對細(xì)胞遷移和侵襲的影響

Rab17組細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯少于Control和NC組(見圖4)。

圖4 Rab17減弱細(xì)胞遷移和侵襲能力

五、 Rab17抑制STAT3/HIF-1α/VEGF信號通路傳導(dǎo)

Rab17組細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)水平與Control組和NC組相比無明顯差異，p-STAT3、HIF-α和VEGF蛋白的表達(dá)水平與Control組和NC組相比有所減弱(見圖5)。

圖5 Rab17抑制STAT3/HIF-1α/VEGF信號通路傳導(dǎo)

討 論

Rab家族的小GTP酶是膜運(yùn)輸和膜靶向的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，該家族中有60多個(gè)成員已被鑒定出在人類中具有特殊作用，例如Rab5參與早期內(nèi)吞作用，Rab7參與晚期內(nèi)吞途徑和蛋白質(zhì)降解，而Rab11調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)循環(huán)[9]。另外Rab-GTPase家族成員對膜表面離子通道具有調(diào)節(jié)作用，參與許多細(xì)胞生物學(xué)行為，其中包括細(xì)胞極性消失、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等[10-11]。本研究結(jié)果顯示，Rab17在NSCLC細(xì)胞系中表達(dá)水平降低，將Rab17質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞后可顯著抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在肝細(xì)胞癌中Rab17的下調(diào)在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中均可顯著促進(jìn)細(xì)胞的致癌性，如增強(qiáng)細(xì)胞增殖、集落形成、侵襲和遷移和促進(jìn)移植瘤的增殖及血管生成[12]。

VEGF-A被認(rèn)為是NSCLC發(fā)病機(jī)理中的主要旁分泌介質(zhì)，STAT3和HIF-1α為調(diào)節(jié)VEGF的主要轉(zhuǎn)錄因子，在各種癌癥中表達(dá)上調(diào)，且與患者的臨床預(yù)后不良相關(guān)[13-15]。STAT3是確定的致癌基因，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1和Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活，通過調(diào)節(jié)E-鈣粘蛋白，MMP-9誘導(dǎo)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，通過靶向VEGF和HIF1α表達(dá)，促進(jìn)血管生成等多種生物學(xué)作用[16-17]。VEGF和HIF-1α作為STAT3的重要轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，是重要的促血管生成因子[18]。本研究結(jié)果顯示Rab17過表達(dá)可減弱VEGF的蛋白表達(dá)水平，這表明Rab17可以通過抑制VEGF信號傳導(dǎo)來抑制血管生成。此外，Rab17可以通過抑制NSCLC細(xì)胞中的HIF-1α表達(dá)來抑制STAT3信號通路。綜上所述，Rab17在NSCLC細(xì)胞中表達(dá)水平降低，Rab17的過表達(dá)通過抑制STAT3/HIF-1α/VEGF信號通路傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，Rab17有望成為治療NSCLC的潛在靶點(diǎn)。