王璐，賀澤英，孫小杰，史小萌，何沛橋，王策，劉瀟威*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津300191；2.SCIEX公司，上海200335）

初級(jí)芳香胺（Primary aromatic amines，PAAs）是一類典型的有毒有害化合物，其中最簡(jiǎn)單的形式是苯胺。苯胺類化合物系指苯胺分子中的氫原子被其他功能團(tuán)取代后形成的一類化合物，是染料工業(yè)的重要原料，其被廣泛應(yīng)用于印染、橡膠、制藥、油漆、農(nóng)藥和人造樹脂等工業(yè)生產(chǎn)中。環(huán)境中所含的苯胺類化合物主要來(lái)自制藥和染料工作廢水、含有硝基苯的礦山酸性廢水在有鋅粉和銅鹽存在的條件下生成的廢水、有色金屬選礦廠廢水等。苯胺類化合物能通過(guò)呼吸道、皮膚、腸道等途徑進(jìn)入人體，其不僅能使氧合血紅蛋白變?yōu)楦哞F血紅蛋白從而降低血液的載氧能力，使組織細(xì)胞缺氧而窒息，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和其他臟器損傷，而且還具有較強(qiáng)的致癌作用[1]。美國(guó)于1976年公布清潔水法，將聯(lián)苯胺納入129種優(yōu)先監(jiān)測(cè)污染物列表[2]，我國(guó)現(xiàn)行的地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，將苯胺和聯(lián)苯胺列為集中式生活飲用水地表水源地特定項(xiàng)目[3]。因此，建立一種快速便捷、靈敏準(zhǔn)確的水中多種初級(jí)芳香胺同時(shí)測(cè)定的分析方法，對(duì)監(jiān)控環(huán)境中初級(jí)芳香胺的排放具有重要的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用意義。

近年來(lái)，針對(duì)水樣中苯胺類化合物檢測(cè)技術(shù)的研究越來(lái)越多，檢測(cè)方法日臻成熟，目前主要有分光光度法[4-5]、熒光光度法[6-7]、毛細(xì)管電泳法[8]、氣相色譜法[9-11]、液相色譜法[12]、質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14]等，另外前處理技術(shù)與儀器設(shè)備聯(lián)用的方法也有報(bào)道，如吹掃捕集與色譜及質(zhì)譜聯(lián)用方法[15]、固相微萃取與色譜及質(zhì)譜聯(lián)用方法[16-17]等。不同的檢測(cè)方法在靈敏度、前處理復(fù)雜程度、分析時(shí)間長(zhǎng)短等方面有著各自的優(yōu)勢(shì)和不足，并且均在不斷地改進(jìn)與發(fā)展。本文探討建立了一種使用高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，采用直接進(jìn)樣方式快速測(cè)定水體中41種初級(jí)芳香胺化合物的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及材料

Qtrap 4500串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)和ExionLC液相色譜（美國(guó)SCIEX公司）；Phenomenex Kinetex F5液相色譜柱（五氟苯基固定相，2.6μm，3 mm×100 mm，博納艾杰爾公司）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher）；甲酸（色譜純，Aladdin）；實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室一級(jí)水；0.22μm濾膜（美國(guó)PALL）；41種初級(jí)芳香胺化合物標(biāo)準(zhǔn)品（天津阿爾塔科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

根據(jù)41種初級(jí)芳香胺化合物的純度和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制體積，準(zhǔn)確稱取一定量標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容后，制備成濃度為100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確吸取一定量各初級(jí)芳香胺化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，混勻并用甲醇定容后，制備成不同濃度的初級(jí)芳香胺化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)樣品制備

通過(guò)向?qū)嶒?yàn)用水中定量添加初級(jí)芳香胺化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備實(shí)驗(yàn)樣品。

1.2.3 樣品前處理方法

實(shí)驗(yàn)樣品混合均勻后，過(guò)0.22μm濾膜，直接上機(jī)測(cè)定。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件

流動(dòng)相A為0.05%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，流速為0.45 mL?min-1，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

時(shí)間Time/min 0578 8.1 12流動(dòng)相A Mobilephase A/%90 10 559 0 90流動(dòng)相BMobilephase B/%10 60 95 95 10 10

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）；離子源溫度：600℃；離子化電壓：2 000 V；氣簾氣壓力：30 psi（1 psi=6.895 kPa）；噴霧氣壓力：9 psi；霧化氣（GS1）壓力：40 psi；輔助氣（GS2）壓力：50 psi；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。41種初級(jí)芳香胺多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)的串聯(lián)質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)中，初級(jí)芳香胺化合物數(shù)量較多，極性分布范圍較寬，間苯二胺、苯胺等化合物極性較強(qiáng)，故需對(duì)色譜柱進(jìn)行優(yōu)化選擇，以確保各化合物既有良好的保留行為以及峰型，又有較好的分離效果。選擇Phenomenex Omega、Phenomenex Kinetex F5和Waters HSST3這3款針對(duì)極性化合物檢測(cè)常用的液相色譜柱進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，采用五氟苯基丙基固定相的KinetexF5色譜柱對(duì)41種化合物均有較好的色譜保留和分離效果（圖1），同時(shí)也能有效分離4對(duì)同分異構(gòu)體（序號(hào)分別為11-12、13-14、22-23和36-37），因此最終選擇了Kinetex F5色譜柱作為本實(shí)驗(yàn)的分離色譜柱。

表2 41種初級(jí)芳香胺多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)的串聯(lián)質(zhì)譜條件Table 2 UPLC/ESI-MS/MSparameters for 41 PAAs in MRM mode

2.1.2流動(dòng)相的選擇

基于初級(jí)芳香胺化合物稍溶于水、易溶于有機(jī)溶劑的理化性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水和乙腈-水兩個(gè)液相色譜常用流動(dòng)相體系。通過(guò)靈敏度實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在甲醇體系里，所有化合物靈敏度均優(yōu)于在乙腈的體系中，故而選擇甲醇作為洗脫相。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中甲醇初始比例的不同對(duì)極性較強(qiáng)的化合物靈敏度有非常大的影響，甲醇含量越高，化合物的靈敏度越高，但同時(shí)造成部分同分異構(gòu)體不能完全分離。因此，在兼顧靈敏度和分離度的前提下，選擇了10%的甲醇作為流動(dòng)相的初始比例。同時(shí)，考慮到質(zhì)譜正離子模式下，甲酸可使化合物形成[M+H]+峰，有助于促進(jìn)離子化，提高分析靈敏度，因此實(shí)驗(yàn)比較了0、0.01%、0.05%、0.1%和0.2%5個(gè)不同濃度甲酸溶液對(duì)化合物靈敏度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲酸濃度為0.05%時(shí)，所有化合物的響應(yīng)值均已能夠滿足方法定量限的要求（圖1），因此最終固定水中甲酸濃度的添加水平為0.05%。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，通過(guò)全掃描模式確定41種初級(jí)芳香胺化合物的保留時(shí)間及高強(qiáng)度的一級(jí)離子，選擇高強(qiáng)度一級(jí)離子作為母離子，分別對(duì)其進(jìn)行不同碰撞能量的電離轟擊試驗(yàn)，通過(guò)主要離子碎片的相對(duì)離子豐度確定最佳碰撞能量。各組分保留時(shí)間及MRM條件見(jiàn)表3。同時(shí)，為了獲得最佳的靈敏度，本實(shí)驗(yàn)對(duì)離子源參數(shù)部分進(jìn)行了詳細(xì)優(yōu)化，在進(jìn)行離子源噴霧電壓優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同電壓下，41種芳香胺化合物的靈敏度有較大差異。最終發(fā)現(xiàn)，當(dāng)電壓設(shè)定為2 000 V時(shí)，所有化合物的靈敏度都是最佳，見(jiàn)圖1。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

針對(duì)建立的檢測(cè)方法開(kāi)展添加回收率實(shí)驗(yàn)，添加濃度為5μg·L-1。結(jié)果表明，41種初級(jí)芳香胺化合物的回收率范圍為64.2%～110.3%，其中39種化合物的回收率＞80%。另外，通過(guò)在實(shí)際空白水體樣品中添加濃度分別為0.1、5、20μg·L-1的初級(jí)芳香胺化合物標(biāo)準(zhǔn)品，開(kāi)展方法重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，41種初級(jí)芳香胺化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均在2.31%～7.90%。同時(shí)，不同時(shí)間下測(cè)得41種初級(jí)芳香胺化合物的日間重現(xiàn)性（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD）均在2.60%～8.11%。表明本方法具有良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，能夠滿足水體中初級(jí)芳香胺化合物的測(cè)定要求。

本方法在0.08～50μg·L-1濃度范圍內(nèi)具有良好的線性，41種初級(jí)芳香胺的相關(guān)系數(shù)為0.989 9～0.999 8。取3倍和10倍信噪比所對(duì)應(yīng)的初級(jí)芳香胺濃度作為方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），41種化合物的LOD和LOQ分別在0.01～0.15μg·L-1和0.04～0.3μg·L-1范圍內(nèi)。

2.4 實(shí)際樣品驗(yàn)證

采集北京地區(qū)10個(gè)不同的地表水樣品進(jìn)行測(cè)定，均未檢出41種初級(jí)芳香胺化合物，說(shuō)明目前該地區(qū)尚未受到此類化合物的污染，日后將進(jìn)一步擴(kuò)大采樣范圍，對(duì)地表水源進(jìn)行此類化合物的篩查分析研究。

圖1 41種初級(jí)芳香胺總離子流圖（0.05%甲酸、離子源噴霧電壓2 000 V條件下）Figure 1 TICof 41 PAAs（0.05%formic acid，ion source spray voltage 2 000 V）

表3 41種初級(jí)芳香胺化合物準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results on the accuracy and reproducibility of 41 PAAs

表4 41種初級(jí)芳香胺化合物線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 4 Linear range，correlation coefficient，LODand LOQof 41 PAAs

3 結(jié)論

本研究建立了水體中41種初級(jí)芳香胺化合物的UPLC-MS/MS快速檢測(cè)方法。水體樣品未經(jīng)凈化，直接過(guò)膜后超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)。該方法線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度和精密度高，分析時(shí)間短，通量高，目標(biāo)物覆蓋范圍廣，操作極為簡(jiǎn)便。