鄭 洋 王佳慧 汪 磊 梁天堅(jiān) 趙鐵建,2 李成林

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)1 賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)系，2 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，南寧市 530222，電子郵箱：1793853705@qq.com)

內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)可以調(diào)控體內(nèi)一氧化氮(nitric oxide,NO)的生成，而NO是調(diào)控血管舒張功能最重要的因素[1]。NO是在一氧化氮合酶催化下，L-精氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-瓜氨酸時(shí)產(chǎn)生。血管內(nèi)皮細(xì)胞合成NO后擴(kuò)散至血管平滑肌細(xì)胞，激活該細(xì)胞上的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，催化三磷酸鳥(niǎo)苷產(chǎn)生環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)，介導(dǎo)平滑肌舒張，從而導(dǎo)致血管舒張，這一分子信號(hào)傳導(dǎo)路徑被稱為eNOS-NO-cGMP通路[2]。有研究表明，eNOS-NO-cGMP通路在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗口的形成過(guò)程中發(fā)揮十分重要的作用，而核因子κB信號(hào)通路可以通過(guò)調(diào)控eNOS基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)控制NO的生成，說(shuō)明eNOS基因在eNOS-NO-cGMP通路上具有關(guān)鍵作用[3-6]。本課題組一直致力于研究廣西道地藥材莪術(shù)抗肝纖維化的作用機(jī)制，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)莪術(shù)主要活性成分莪術(shù)醇對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的窗口和基底膜有影響[7]，但是具體的作用機(jī)制仍不清楚。本研究利用生物信息學(xué)方法深入分析eNOS基因及其所編碼的蛋白質(zhì)，為研究莪術(shù)與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞作用關(guān)系提供生物信息學(xué)方面的理論支持。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取eNOS基因的核酸序列，在UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)中獲取eNOS蛋白的氨基酸序列。

1.2 分析方法 (1)用BDGP(http://www.fruitfly.org/)和TFDB在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/)進(jìn)行啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)，前者是基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法的在線數(shù)據(jù)庫(kù)，用于模擬轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)域序列的相互作用。(2)用ProtParam在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)分析eNOS基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)；用ProtScale在線軟件(https://web.expasy.org/protscale/) 分析蛋白質(zhì)的親水性和疏水性。(3)用SignalP 4.1軟件來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽，通過(guò)對(duì)目的肽鏈前70個(gè)氨基酸間潛在酶切位點(diǎn)的預(yù)測(cè)來(lái)判斷是否存在信號(hào)肽。設(shè)置臨界值為0.450，預(yù)測(cè)C分值、Y分值、S分值，其中S的平均值可以用來(lái)判斷是否為分泌蛋白(S>0.5則判斷為分泌蛋白并且有信號(hào)肽)，Y的最大值用來(lái)判斷信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)[8]。(4)用TMHMM軟件[9]來(lái)分析蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)，只有位于膜外區(qū)域的氨基酸序列才有可能作為抗原的表位，而其他兩個(gè)區(qū)域的氨基酸序列一般不會(huì)作為抗原表位[10]。(5)用SOPMA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；用SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫(kù)(https://swissmodel.expasy.org/)來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。(6)在真核細(xì)胞中，蛋白質(zhì)被基因翻譯后還要進(jìn)行加工才能發(fā)揮其功能，比較常見(jiàn)的加工方式有磷酸化和糖基化等，這種加工對(duì)于蛋白質(zhì)發(fā)揮功能具有十分重要的意義，因此應(yīng)用NetNGlyc1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和NetOGlyc4.0 Server在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)分別對(duì)蛋白質(zhì)N-糖基化和O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析；由于蛋白質(zhì)的磷酸化修飾對(duì)于信號(hào)傳導(dǎo)具有十分重要的意義，因此應(yīng)用NetPhos2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析。(7)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/cgi/input.pl)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的相互作用。(8)用BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)eNOS基因進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié) 果

2.1 eNOS基因的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)結(jié)果 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索eNOS基因，發(fā)現(xiàn)其位于7q36.1區(qū)，含有28個(gè)外顯子。用BDGP在線數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域，設(shè)置Score為0.9，預(yù)測(cè)得到的啟動(dòng)子見(jiàn)表1。選取評(píng)分最高的一段啟動(dòng)子用TFDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)，評(píng)分較高的前10位轉(zhuǎn)錄因子見(jiàn)表2。

表1 eNOS基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果

表2 評(píng)分最高啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子

2.2 eNOS基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)獲得eNOS基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，然后將其輸入到ProtParam數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。eNOS蛋白質(zhì)分子量為133 274.78，蛋白質(zhì)的總分子式為C5930H9269N1677O1734S46，總原子數(shù)為18 656，含有1 203個(gè)氨基酸殘基。其中，帶正電荷的氨基酸殘基精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)占10.47%(126/1 203)；帶負(fù)電荷的氨基酸殘基天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)占10.64%(128/1 203)。理論上等電點(diǎn)=6.94，說(shuō)明eNOS蛋白偏中性。氨基酸組成中亮氨酸(Leu)含量最高，達(dá)到10.6%。eNOS蛋白的不穩(wěn)定指標(biāo)達(dá)到了53.49，屬于不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。eNOS蛋白的脂肪指標(biāo)為79.48。再依托ProtScale軟件檢測(cè)該蛋白質(zhì)的親水和疏水性，采用Hphob./Kyte&Doolittle算法，結(jié)果顯示eNOS蛋白最大的疏水性分值為2.311，親水性最小的分值為-3.444，eNOS蛋白疏水性的氨基酸分值小于親水性的氨基酸(見(jiàn)圖1)，因此eNOS蛋白總體上屬于親水性蛋白。

圖1 eNOS蛋白親水性和疏水性分析結(jié)果

2.3 eNOS蛋白信號(hào)肽的分析 運(yùn)用SignalP 4.1軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，C的最大值為0.076，Y最大值為0.073，S最大值為0.216，其預(yù)測(cè)的剪切點(diǎn)在33位氨基酸。S平均值為0.088，說(shuō)明eNOS蛋白不是分泌蛋白并且也沒(méi)有信號(hào)肽。見(jiàn)圖2。

圖2 eNOS蛋白信號(hào)肽分析結(jié)果

2.4 eNOS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的分析 將eNOS蛋白的氨基酸序列輸入到TMHMM軟件進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。由圖3可見(jiàn)，eNOS蛋白全部在膜外，沒(méi)有在跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)。

圖3 eNOS蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.5 eNOS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果 用SMOPA數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，將構(gòu)象數(shù)設(shè)置為3(Helix、Sheet、Coil)，其他的參數(shù)默認(rèn)為原始數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，α螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲各占37.52%、15.39%、47.09%，見(jiàn)圖4。其中α螺旋所占比重較高，這有利于維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定構(gòu)象，而無(wú)規(guī)則卷曲常在蛋白質(zhì)分子的表面，有利于抗原和抗體的相互作用。

圖4 eNOS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.6 eNOS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 用SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用同源建模的方法來(lái)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的蛋白質(zhì)進(jìn)行序列的對(duì)比，選擇相似度高的模型建模，預(yù)測(cè)的結(jié)果見(jiàn)圖5，該蛋白質(zhì)存在較多的扭曲和折疊,結(jié)構(gòu)較為豐富,而這些結(jié)構(gòu)對(duì)其生物學(xué)功能的發(fā)揮有重要作用。

圖5 eNOS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)和同源性蛋白質(zhì)相似性波形圖

2.7 eNOS蛋白翻譯后的加工 分別運(yùn)用NetNGlyc1.0 Server和NetOGlyc4.0 Server在線軟件對(duì)N-糖基化和O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在該段序列上沒(méi)有N-糖基化位點(diǎn)(見(jiàn)圖6)，O-糖基化位點(diǎn)位于第6、33、39、44、53、56、57、60、102、114、424、483、488、491、495、599、600、624、625、633、634、636、725、729、738、824、836、920、1171位。用NetPhos2.0 Server進(jìn)行蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果為有Ser:35，Thr:14，Tyr:4可以成為磷酸化的位點(diǎn)，見(jiàn)圖7。

圖6 eNOS蛋白N-糖基化分析

圖7 eNOS蛋白磷酸化的分析結(jié)果

2.8 eNOS蛋白的相互作用 借助STRING數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的相互作用，預(yù)測(cè)eNOS蛋白可以與10個(gè)蛋白發(fā)生相互作用。其中，eNOS蛋白可以與α-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(alpha serine/threonine-protein kinase 1，AKT1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)發(fā)生作用(見(jiàn)圖8)，前者在血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，后者對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的各種生理活動(dòng)都有調(diào)節(jié)作用，說(shuō)明eNOS蛋白與血管的各種生理活動(dòng)關(guān)系密切。其他相互作用蛋白都可以協(xié)同eNOS蛋白的功能。

圖8 eNOS蛋白相互作用的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.9 人eNOS基因同源性分析 將人、小鼠、豬、大鼠、羊、馬、牛、兔子、狗的eNOS基因序列導(dǎo)入Blast數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因序列分析，9個(gè)物種的eNOS基因序列相似度較高，處于75.95%～90.04%之間。其中人與豬的eNOS基因序列相似度最高(為86.22%)，與馬的基因序列相似度最低(為75.95%)，其他各物種之間相似度比較結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同物種eNOS基因序列相似度比較

3 討 論

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)的各種軟件，對(duì)eNOS基因及其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)的分析，發(fā)現(xiàn)其具有以下特點(diǎn)：eNOS基因高得分的啟動(dòng)子有14個(gè)，SPl1是得分最高的轉(zhuǎn)錄因子；eNOS基因編碼的蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定親水性偏中性的蛋白質(zhì)，其不是分泌蛋白，也沒(méi)有信號(hào)肽，全部分布在膜外，說(shuō)明其可以作為受體參與信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程；eNOS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋所占比重較高，這有利于維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，且其三級(jí)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，說(shuō)明其功能具有多樣性；O-糖基化位點(diǎn)有29位，Ser:35、Thr:14、Tyr:4可以成為磷酸化的位點(diǎn)，這些修飾位點(diǎn)可以對(duì)蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)；同源性分析結(jié)果雌雄激素受體1提示eNOS基因的進(jìn)化上具有一定的保守型，并且人與豬的eNOS基因序列相似度最高，為86.22%，與馬的基因序列相似度最低，為75.95%。

進(jìn)一步行蛋白質(zhì)的相互作用分析，結(jié)果顯示，eNOS蛋白可以與10個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，說(shuō)明這些蛋白與eNOS蛋白在功能上有聯(lián)系。其中雌激素受體1參與調(diào)控真核細(xì)胞基因的表達(dá)，影響靶細(xì)胞的增殖和分化，雌激素受體1可以抑制核因子κB信號(hào)通路的活化，從而減少白細(xì)胞介素6等的表達(dá)[11-12]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在血管生成、血管發(fā)育、血管通透性、胚胎造血等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用，其可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、存活、遷移和分化，以及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組，并可介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)1/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)2、MAPK3/ERK1和MAPK信號(hào)通路以及AKT1信號(hào)通路的激活，以及磷酸肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞單位1的磷酸化、磷脂酰肌醇3-激酶的調(diào)節(jié)亞基、肌動(dòng)蛋白骨架的重組和蛋白酪氨酸激酶2/局部黏著斑激酶的激活[13-15]。VEGFA在血管生成內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)中起積極作用，其可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞遷移，抑制凋亡，調(diào)控血管通透性[16]。90 kDa熱休克蛋白αA1可以在3個(gè)水平上調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄：首先，它們改變某些轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)態(tài)水平，以應(yīng)對(duì)各種生理刺激；其次，它們調(diào)節(jié)某些表觀遺傳修飾物(如組蛋白脫乙酰酶或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)的活性，從而對(duì)環(huán)境的變化做出反應(yīng)；再次，它們參與將組蛋白從某些基因的啟動(dòng)子區(qū)域逐出，從而啟動(dòng)基因表達(dá)[17]。此外，90 kDa熱休克蛋白αA1還可以與細(xì)菌脂多糖結(jié)合，介導(dǎo)脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[18]。AKT1為AKT激酶的3種緊密相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1、AKT2和AKT3)之一，它調(diào)控著細(xì)胞的代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和血管生成等多種過(guò)程，而這是通過(guò)絲氨酸和(或)蘇氨酸磷酸化一系列下游底物來(lái)介導(dǎo)的[19]。小窩蛋白1可以充當(dāng)支架蛋白的作用，參與T細(xì)胞受體介導(dǎo)的T細(xì)胞活化所必需的共刺激信號(hào)；它與二肽基肽酶4的結(jié)合以T細(xì)胞受體/CD3依賴的方式誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和核因子κB的活化[20]。一氧化氮合酶運(yùn)輸因子是一種多價(jià)適配蛋白，可通過(guò)使蛋白其遠(yuǎn)離質(zhì)膜而降低目標(biāo)蛋白的活性[21]。精氨酸酶Ⅱ可能在調(diào)節(jié)尿素外循環(huán)、精氨酸代謝和降低NO合成方面發(fā)揮作用，肝外的精氨酸酶對(duì)一氧化氮合酶的生物利用度有調(diào)節(jié)作用，精氨酸代謝是天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可以通過(guò)調(diào)節(jié)核糖體蛋白S6激酶B1信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞衰老，并導(dǎo)致一氧化氮合酶3/eNOS功能障礙[22-23]。鈣調(diào)蛋白1通過(guò)鈣結(jié)合介導(dǎo)大量酶、離子通道、水通道蛋白和其他蛋白質(zhì)的調(diào)控，而鈣調(diào)素-鈣復(fù)合物刺激的酶包括許多蛋白激酶和磷酸酶[24]。激肽原1在凝血過(guò)程中以及對(duì)血管通透性和炎癥因子產(chǎn)生等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[25]。

eNOS是NO合成的關(guān)鍵酶，而NO又是調(diào)控血管功能的關(guān)鍵因子，因此eNOS是所有與血管相關(guān)疾病研究的重要靶點(diǎn)。通過(guò)對(duì)人基因eNOS及其所編碼蛋白質(zhì)的深入分析，我們對(duì)其有了更加深入的了解， eNOS具有利于蛋白間相互作用的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和在細(xì)胞膜定位的特點(diǎn)，表明其具有傳遞信息的功能，這或可為后期的基礎(chǔ)研究提供一個(gè)科學(xué)導(dǎo)向。