龍丹丹 張 清 占 凱 薛 娟 羅 磊

(1 湖北省宜昌市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科， 宜昌市 443000，電子郵箱：7207631@qq.com；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東省廣州市 510000；3 湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢市 430000)

流行病學(xué)研究表明，發(fā)達(dá)國家中大約45%的死亡是由纖維化疾病引起的[1]。肝纖維化是肝臟的慢性損傷過程，是多種肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，其特征包括肝星狀細(xì)胞的活化、細(xì)胞外基質(zhì)的過度累積和肝臟結(jié)構(gòu)的破壞[2]，如不加以控制，可進(jìn)一步進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌[3]。近年來，雖然很多重要的研究結(jié)果使得人們對(duì)肝纖維化有了更深入、更全面的理解，但是目前尚無藥物被證實(shí)對(duì)肝臟有明確的抗纖維化作用。目前認(rèn)為肝纖維化甚至早期肝硬化是可以逆轉(zhuǎn)的[4]，因此尋找和研究有效且耐受良好的抗肝纖維化藥物，具有十分重要的意義。近年來，中藥在抗肝纖維化方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景。大黃素是中草藥的一種化學(xué)成分，主要提取自大黃、虎杖、何首烏、蘆薈等中藥。研究表明，大黃素具有多種藥理作用，包括抗炎、抗腫瘤、抗過敏、瀉下等[5-8]。還有研究顯示，大黃素具有抗纖維化作用，包括抗胰腺纖維化、心肌纖維化、肺纖維化等[9-11]。目前有關(guān)大黃素抗肝纖維化的研究報(bào)道較為罕見，因此本研究通過采用四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型，旨在觀察大黃素對(duì)肝纖維化的治療作用，并對(duì)其作用機(jī)制做初步的探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只健康成年雄性SD大鼠購買于湖北省疾病預(yù)防控制中心[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(鄂)2016-0009]，8周齡，體重180～220 g，于恒溫(22℃～25℃)、濕度45%～50%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 四氯化碳購買于Sigma公司(產(chǎn)品批號(hào)：48604)；大黃素(純度>95%)購買于上海阿拉丁生物化學(xué)試劑有限公司(產(chǎn)品批號(hào)：E7881)；橄欖油采用食用橄欖油；血清透明質(zhì)酸、層粘連蛋白(laminin,LN)、Ⅲ型前膠原(procollagen type Ⅲ,PCⅢ)、Ⅳ型膠原酶聯(lián)免疫分析試劑盒購買于上海西塘科技有限公司(產(chǎn)品批號(hào)分別為：F5737、YK127、F5712、F5734)；結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)-1、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP)-9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、TRIzol Reagent試劑購買于TaKaRa公司(產(chǎn)品批號(hào)分別為：RR047A、RR047Q、9108)；AU5821型全自動(dòng)生化分析儀購自Beckman Coulter公司，LightCycler96 PCR儀購自羅氏公司。

1.3 分組及造模方法 50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用完全隨機(jī)分組法將大鼠分為正常組、模型組、大黃素低劑量組(15 mg/kg)、大黃素中劑量組(30 mg/kg)、大黃素高劑量組(60 mg/kg)，每組10只。正常組不予處理，大黃素各劑量組及模型組采用40%四氯化碳-橄欖油混合液(四氯化碳與橄欖油的混合比例為2 ∶3)腹腔注射給藥，首劑為4 mL/kg，以后按2 mL/kg注射，2次/周，共持續(xù)8周。

1.4 干預(yù)方法 從造模第5周開始，大黃素低劑量組、大黃素中劑量組、大黃素高劑量組分別給予15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg的大黃素灌胃，灌胃前將大黃素粉末加入生理鹽水在搖床上搖勻使其充分溶解，參考文獻(xiàn)[12]制定大黃素給藥劑量。模型組及正常組給予相應(yīng)劑量(1 mL/100 g)的生理鹽水灌胃(四氯化碳-橄欖油混合液腹腔注射后半小時(shí)進(jìn)行)。各組灌胃均1次/d，共持續(xù)4周。

1.5 標(biāo)本收集 第8周末次灌胃給藥后，各組大鼠禁食禁水24 h，采用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，無菌條件下收集大鼠門靜脈血液，離心(37℃，3 000 r/min，10 min)收集血清于-20℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)取新鮮肝臟組織，一部分于-80℃保存，一部分采用10%多聚甲醛固定后于24 h內(nèi)行石蠟包埋。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 肝功能指標(biāo)檢測：采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清ALT、AST、白蛋白水平。

1.6.2 肝纖維化指標(biāo)檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清透明質(zhì)酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.6.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法測定肝組織中CTGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA表達(dá)水平： 取100 mg大鼠肝臟組織，按照試劑盒說明書中的步驟采用TRIzol法提取總RNA后，檢測其濃度及純度，A260/A280在1.8～2.0，表明RNA純度較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL作為熒光定量PCR模板，配成10 μL的PCR反應(yīng)體系，包括SYBR green 5 μL，cDNA 1 μL，ROX 0.2 μL，前引物0.2 μL，后引物0.2 μL，ddH2O 3.4 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，由電腦軟件分析讀取Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參照，使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。CTGF 上游引物為5′-GGCAGGGCCAACCACTGTGC-3′,下游引物為5′-CAGTGCACTTGCCTGGATGG-3′;TIMP-1 上游引物為5′-AGCCCTGCTCAGCAAAAGG-3′,下游引物為5′-CTGTCCACAAGCAATGACTGTCA-3′；MMP-9上游引物為5′-AAAGGTCGCTCGGATGGTTAT-3′,下游引物為5′-CTGCTTGCCCAGGAAGACGAA-3′；GAPDH上游引物為ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游引物為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.6.4 肝組織病理學(xué)變化： 將10%多聚甲醛固定的肝組織標(biāo)本，經(jīng)過常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin， HE)染色和Masson染色，光鏡下觀察肝組織一般病理學(xué)變化及肝組織膠原纖維增生情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常，排列規(guī)則，無炎性細(xì)胞浸潤及膠原纖維沉積;模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肝細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，可見炎性細(xì)胞浸潤，以匯管區(qū)為中心，出現(xiàn)不同程度纖維增生性改變;與模型組比較，經(jīng)不同劑量大黃素治療后，大鼠肝細(xì)胞破壞明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，纖維增生性改變減輕，肝臟損傷程度呈現(xiàn)好轉(zhuǎn)趨勢。見圖1。Masson染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，未見膠原纖維增生；模型組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，伴假小葉形成，可見大量膠原纖維增生；不同濃度大黃素治療組大鼠肝纖維組織增生均有不同程度的改善，肝組織結(jié)構(gòu)趨向正常。見圖2。

圖1 5組大鼠肝組織HE染色結(jié)果 (100×)

圖2 5組大鼠肝組織膠原纖維增生的情況(Masson染色，100×)

2.2 5組大鼠血清肝功能指標(biāo)比較 與正常組大鼠相比，模型組大鼠血清ALT、AST水平升高，白蛋白水平降低(均P<0.05)；與模型組大鼠相比，大黃素各劑量組大鼠血清ALT、AST水平下降，白蛋白水平升高(均P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠血清肝功能指標(biāo)比較(x±s)

2.3 5組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)水平比較 與正常組相比，其他各組大鼠血清中透明質(zhì)酸、LN、Ⅳ型膠原和PCⅢ水平均升高(均P<0.05)，進(jìn)一步表明肝纖維化模型制備成功；與模型組比較，大黃素各劑量組大鼠血清中透明質(zhì)酸、LN、Ⅳ型膠原和PCⅢ水平均有不同程度的下降(均P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)水平比較(x±s)

2.4 5組大鼠肝組織CTGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 與正常組相比，模型組大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高，MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低(均P<0.05)；與模型組相比，大黃素各劑量組CTGF、TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低，MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高(均P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠肝組織CTGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

3 討 論

肝纖維化是由于各種因素(酒精、病毒、自身免疫等)導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞的激活，引起肝臟中膠原纖維為主的細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解失調(diào),從而導(dǎo)致纖維結(jié)締組織在肝臟內(nèi)過量堆積所致。HE染色常用來顯示組織或細(xì)胞一般形態(tài)的改變，也是觀察肝纖維化情況常用的染色方法之一；Masson染色則是顯示纖維結(jié)締組織的重要染色方法之一，其能較為準(zhǔn)確地判斷出組織纖維化的嚴(yán)重程度。此外，血清學(xué)指標(biāo)透明質(zhì)酸、LN、Ⅳ型膠原和PCⅢ水平在肝纖維化時(shí)明顯升高，其水平的高低與肝纖維化程度呈正相關(guān)，是反映和監(jiān)測肝纖維化發(fā)展的常用指標(biāo)[13]。本實(shí)驗(yàn)采用四氯化碳-橄欖油復(fù)合法建立肝纖維化大鼠模型，病理學(xué)檢測結(jié)果顯示模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重、大量膠原纖維增生，且血清透明質(zhì)酸、LN、Ⅳ型膠原和PCⅢ水平高于正常組(均P<0.05)，提示肝纖維化模型制備成功。而經(jīng)不同劑量大黃素干預(yù)后，大鼠肝臟結(jié)構(gòu)破壞不同程度減輕，膠原纖維增生減少，血清透明質(zhì)酸、LN、Ⅳ型膠原和PCⅢ水平均有不同程度的改善(均P<0.05)，這提示大黃素對(duì)大鼠的肝纖維有一定的逆轉(zhuǎn)作用。

ALT、AST是反映肝功能水平的基本指標(biāo)，白蛋白常用來反映肝臟損壞的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較模型組大鼠血清ALT、AST水平升高，白蛋白水平下降，大黃素給藥干預(yù)后大鼠ALT、AST水平下降，白蛋白水平升高(P<0.05)，這提示大黃素對(duì)肝纖維化大鼠的肝功能損害有一定的改善作用。

CTGF主要由成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞合成，其在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。動(dòng)物及臨床研究表明，發(fā)生纖維化的肝臟組織中CTGF表達(dá)顯著增加[14-15]， 且CTGF可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和成纖維細(xì)胞的增生[16]。MMP和TIMP是細(xì)胞外基質(zhì)降解和重塑的關(guān)鍵因素。MMP-9可降解正常肝臟膠原基質(zhì)，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的破壞，進(jìn)而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化，并分泌大量的膠原蛋白，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[17]。TIMP-1在肝纖維化進(jìn)程中起著重要作用，可通過結(jié)合MMP-9的酶原形成復(fù)合物，從而抑制MMP-9活性，其水平可以反映肝纖維化的嚴(yán)重程度[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較模型組大鼠CTGF、TIMP-1 mRNA表達(dá)水平升高，MMP-9 mRNA水平降低(P<0.05)，而經(jīng)大黃素干預(yù)后，各劑量組大鼠CTGF、TIMP-1 mRNA表達(dá)水平較模型組均有不同程度的降低，MMP-9 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。這說明大黃素或通過抑制CTGF和TIMP-1的表達(dá)，同時(shí)提高M(jìn)MP-9的表達(dá)來達(dá)到改善肝纖維化的作用。

綜上所述，大黃素可抑制大鼠肝纖維化的發(fā)展，改善肝功能，其機(jī)制可能與抑制CTGF、TIMP-1的合成及促進(jìn)MMP-9的表達(dá)有關(guān)。這也為大黃素干預(yù)肝纖維化提供了前期的理論基礎(chǔ)，但其具體作用機(jī)制仍須進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從而為臨床治療肝纖維化提供新的可能。