冒鑫哲，彭政，周冠宇，堵國成，張娟

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)3(江南大學(xué) 協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫，214122)4(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

角蛋白是羽毛、羊毛、角、頭發(fā)、指甲、蹄的主要成分[1]，其結(jié)構(gòu)中包含大量高度交聯(lián)的二酶硫鍵，不易被普通蛋白酶降解[2]。全球禽業(yè)每年產(chǎn)生幾百萬噸羽毛廢棄物，畜牧業(yè)還以皮革、毛發(fā)和馬蹄等形式產(chǎn)生數(shù)百萬噸角蛋白廢棄物[3]，這些廢棄物不僅浪費蛋白質(zhì)資源，也造成空氣、土壤和水的污染。角蛋白酶是一類特殊的蛋白水解酶，具有特異性降解不溶性角蛋白的能力[4],主要由細(xì)菌、真菌和放線菌產(chǎn)生[5-6],具有降解不溶性蛋白的特性，可用于羽毛降解。角蛋白酶在飼料[7-8]、肥料[9]、洗滌劑[10]、皮革[11-12]、紡織[13]、化妝品行業(yè)[14]和醫(yī)療[15]等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

目前，針對角蛋白酶發(fā)酵優(yōu)化的研究，主要集中在野生菌的篩選、發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件的優(yōu)化[16]，最常見的產(chǎn)角蛋白酶的菌是細(xì)菌，具有發(fā)酵周期短、酶活性高、生產(chǎn)安全性好等優(yōu)點，具有良好應(yīng)用前景[17-20]。廖朝勇等[18]在枯草芽孢桿菌WB600中構(gòu)建角蛋白酶重組菌WB600-K，通過單因素試驗及正交試驗進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，酶活性達(dá)到56.9 U/mL，較優(yōu)化前提高49.74%；蔣彪等[19]通過篩選獲得一株產(chǎn)角蛋白酶菌株，鑒定為芽孢桿菌，利用單因素優(yōu)化，酶活性達(dá)到337.6 U/mL，是優(yōu)化前的1.26倍。TIWARY等[20]通過單因素和響應(yīng)面試驗進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，產(chǎn)角蛋白酶菌株酶活性達(dá)到1 962 U/mL，酶活性提高8倍。

角蛋白酶性能突出，在工業(yè)化應(yīng)用中潛力巨大，但目前能夠?qū)崿F(xiàn)角蛋白酶高效生產(chǎn)的例子較少[21]。課題組前期研究中，成功構(gòu)建了1株能夠高效生產(chǎn)角蛋白酶的枯草芽孢桿菌工程菌WB600-p43-ker，角蛋白酶基因來源為地衣芽孢桿菌。本研究對產(chǎn)角蛋白酶菌株WB600-p43-ker發(fā)酵培養(yǎng)基成分以及發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，提高發(fā)酵水平，降低發(fā)酵成本，為工業(yè)化生產(chǎn)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

質(zhì)粒pP43NMK、宿主菌枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) WB600由本實驗室保藏；枯草芽孢桿菌工程菌WB600-p43-ker為本實驗室構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10。(固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂)，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，Na2HPO4·12H2O 6，KH2PO43，MgSO4·7H2O 0.3，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQZY-VAF振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；5418高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；T&J-Atype臺式玻璃生物反應(yīng)器，迪必爾生物工程有限公司；UVmini-1280紫外分光光度計，島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)方法

菌株活化：取保存于-80 ℃的甘油菌1支于LB固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)14～16 h。

一級種子液培養(yǎng)：從平板上挑取單菌落接種于3 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜。

二級種子液培養(yǎng)：250 mL三角瓶裝50 mL LB培養(yǎng)基，將一級種子液按體積分?jǐn)?shù)2%接種量接入LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)4～6 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：250 mL三角瓶裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，將二級種子液按體積分?jǐn)?shù)5%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液酶活力。

1.3.2 角蛋白酶酶活力測定方法

粗酶液制備：將發(fā)酵獲得的菌液于4 ℃、7 000 r/min離心5 min。

酶反應(yīng)：向1.5 mL離心管中加入150 μL Gly-NaOH溶液(pH 10)、100 μL 25 g/L可溶性角蛋白和50 μL角蛋白酶溶液，混合均勻，于60 ℃中反應(yīng)20 min；加入200 μL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，12 000 r/min離心2 min。對照組為加入酶液前加入200 μL三氯乙酸溶液。

顯色反應(yīng)：取200 μL上清液加入到1 mL 50 g/L Na2CO3溶液中，加入200 μL福林酚試劑，混合均勻，50 ℃顯色10 min，使用分光光度計測定波長660 nm下的吸光度。

酶活力定義：1 U為吸光度在波長660 nm下升高0.001單位[22]。

1.3.3 單因素試驗

1) 培養(yǎng)基碳源優(yōu)化：以初始培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別使用葡萄糖、半乳糖、甘油、蔗糖、麥芽糖、糊精和淀粉為碳源，添加質(zhì)量濃度為20 g/L，搖瓶培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液酶活力；添加不同質(zhì)量濃度的蔗糖(10、15、20、25、30、35、40 g/L)，搖瓶培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液酶活力。

2) 培養(yǎng)基氮源優(yōu)化：在現(xiàn)有優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別使用蛋白胨、酵母浸膏、麩皮、豆粕、玉米漿粉、(NH4)2SO4和NH4Cl為氮源，添加質(zhì)量濃度為30 g/L，搖瓶培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液酶活力；分別添加不同質(zhì)量濃度豆粕(20、25、30、35、40、45、50 g/L)測定發(fā)酵液酶活力。在已經(jīng)確定1種氮源的基礎(chǔ)上，添加第二氮源(NH4)2SO4、NH4Cl、玉米漿粉、蛋白胨、酵母浸膏，添加質(zhì)量濃度為10 g/L，搖瓶培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液酶活力；分別添加不同質(zhì)量濃度酵母浸膏(1、5、10、15、20、25、30 g/L)，搖瓶培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液酶活力。

3) 培養(yǎng)基金屬離子優(yōu)化：在現(xiàn)有優(yōu)化基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基中添加K+、Na+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+，添加質(zhì)量濃度為0.3 g/L，搖瓶培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液酶活力；分別添加不同質(zhì)量濃度MgSO4·7H2O(0.1、0.3、0.5、1、1.5 g/L)，搖瓶培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液酶活力。

5) 培養(yǎng)基初始pH優(yōu)化：在現(xiàn)有優(yōu)化基礎(chǔ)上，改變發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH(6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10)，搖瓶培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液酶活力。

6) 培養(yǎng)基接種量優(yōu)化：在現(xiàn)有優(yōu)化基礎(chǔ)上，將種子液以不同接種量(體積分?jǐn)?shù)1%、3%、5%、7%、9%)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液酶活力。

7) 培養(yǎng)溫度優(yōu)化：在現(xiàn)有優(yōu)化基礎(chǔ)上，調(diào)整培養(yǎng)發(fā)酵溫度(30、32、35、37、40 ℃)，搖瓶培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液酶活力。

1.3.4 響應(yīng)面試驗

1) Plackett-Burman試驗設(shè)計：將單因素試驗的8個因素作為試驗的因素，以角蛋白酶酶活力(Y)為響應(yīng)值，利用Minitab 19軟件進(jìn)行n=12的Plackett-Burman(PB)試驗設(shè)計。PB試驗設(shè)計的各因素與水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of the Plackett-Burman design

2) Box-Behnken中心組合試驗：采用Box-Behnken中心組合試驗進(jìn)行實驗條件優(yōu)化，以酵母浸膏(A)、pH(B)、溫度(C)為變量，以角蛋白酶酶活力(Y)為響應(yīng)值設(shè)計3因素3水平試驗，試驗方案中的各因素和水平如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

1.3.5 發(fā)酵罐放大實驗

使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件對菌株進(jìn)行3 L發(fā)酵罐試驗。裝液量1.5 L，按體積分?jǐn)?shù)5%接種量轉(zhuǎn)接二級種子至發(fā)酵罐中，初始條件為溫度37 ℃、pH 7.68、通氣量1.5 L/min。控制發(fā)酵過程中pH 7、溫度37 ℃、溶氧25%～30%；由于實驗室前期驗證了補料葡萄糖或蔗糖對產(chǎn)酶無顯著影響，故發(fā)酵時使用便于檢測的葡萄糖進(jìn)行補料，按照發(fā)酵時間9～16 h以30 mL/h、26～30 h以25 mL/h恒速補料，葡萄糖質(zhì)量濃度為720 g/L；發(fā)酵10 h后以0.5 mL/h速度補料消泡劑。發(fā)酵過程中定時取樣測定菌體濃度和角蛋白酶酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 最佳碳源的確定

選用價格低廉的7種碳源進(jìn)行培養(yǎng)基碳源優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)碳源為蔗糖時，酶活力最高，麥芽糖和糊精次之，甘油最低。當(dāng)培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量濃度30 g/L時，酶活力最高，但進(jìn)一步提高蔗糖質(zhì)量濃度酶活力下降。有文獻(xiàn)報道，蔗糖質(zhì)量濃度過高導(dǎo)致滲透壓增大，影響菌株的生長與產(chǎn)酶[23]。因此，選擇質(zhì)量濃度30 g/L蔗糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

a-碳源種類對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響; b-蔗糖添加量對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響圖1 碳源對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.1 Effects of single cabon source on the production of keratinase

2.1.2 最佳氮源的確定

選用價格低廉的8種氮源進(jìn)行氮源優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。有機(jī)氮源作為唯一氮源的效果明顯優(yōu)于無機(jī)氮源。當(dāng)使用豆粕作為氮源時，酶活力最高。當(dāng)培養(yǎng)基中豆粕質(zhì)量濃度40 g/L時，酶活力最高，繼續(xù)提高豆粕質(zhì)量濃度，酶活力無明顯變化。由于不同來源的氮源對菌體生長和產(chǎn)酶促進(jìn)作用不同，當(dāng)使用復(fù)合氮源時，對產(chǎn)酶有進(jìn)一步的促進(jìn)作用[23,24]，故向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加第二氮源，探究其對產(chǎn)酶的影響。

a-氮源種類對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響; b-豆粕添加量對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響圖2 氮源對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.2 Effects of nitrogen source on the production of keratinase

培養(yǎng)基中添加第二氮源結(jié)果如圖3所示。添加酵母浸膏促進(jìn)產(chǎn)酶的效果最好，蛋白胨次之，而(NH4)2SO4、NH4Cl和玉米漿粉對產(chǎn)酶有抑制作用。當(dāng)培養(yǎng)基中酵母浸膏質(zhì)量濃度為5 g/L時，酶活力最高。因此，選擇質(zhì)量濃度40 g/L豆粕和質(zhì)量濃度5 g/L酵母浸膏作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

a-氮源種類對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響;b-酵母浸膏添加量對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響圖3 第二氮源對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.3 Effects of the second nitrogen source on the production of keratinase

2.1.3 最佳金屬離子的確定

不同金屬離子對產(chǎn)酶的影響如圖4所示。其中，添加Mg2+時，酶活力最高?？赡茉蚴荕g2+促進(jìn)菌體的生長代謝，進(jìn)而促進(jìn)角蛋白酶的合成和分泌[25]。當(dāng)培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.3 g/L時，酶活力最高。因此，選擇質(zhì)量濃度0.3 g/L MgSO4·7H2O作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳金屬離子。

2.1.4 最佳磷酸鹽質(zhì)量濃度的確定

磷酸鹽對產(chǎn)酶影響如圖5所示。低質(zhì)量濃度磷酸鹽對產(chǎn)酶抑制較明顯，磷酸鹽質(zhì)量濃度4.5 g/L后，酶活力最高，繼續(xù)提高磷酸鹽質(zhì)量濃度，酶活力無明顯變化。當(dāng)磷酸鹽質(zhì)量濃度達(dá)到22.5 g/L時，酶活力下降。為降低發(fā)酵成本，確定產(chǎn)酶最佳磷酸鹽質(zhì)量濃度為4.5 g/L即Na2HPO4·12H2O質(zhì)量濃度為 3 g/L，KH2PO4質(zhì)量濃度為1.5 g/L。

a-金屬離子種類對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響; b-MgSO4·7H2O添加量對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響圖4 金屬離子對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.4 Effects of metal ions on the production of keratinase

圖5 磷酸鹽質(zhì)量濃度對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.5 Effects of phosphate concentration on the production of keratinase

2.1.5 最佳初始pH的確定

初始pH對產(chǎn)酶的影響如圖6所示。培養(yǎng)基初始pH在7～8時，酶活力最高；初始pH<7時，對產(chǎn)酶抑制較大；初始pH在8.5～10時，酶活力降低，與酸性環(huán)境相比，菌株對堿性環(huán)境的耐受性較強(qiáng)。因此，確定初始pH 7.5為發(fā)酵產(chǎn)酶最適初始pH。

圖6 pH對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.6 Effects of pH on the production of keratinase

2.1.6 最佳接種量的確定

接種量對產(chǎn)酶的影響如圖7所示。當(dāng)接種量為體積分?jǐn)?shù)1%～5%時，酶活力隨著接種量的增加而增加；接種量為體積分?jǐn)?shù)5%時，酶活力最高。因此，確定接種量體積分?jǐn)?shù)5%為發(fā)酵產(chǎn)酶最佳接種量。

圖7 接種量對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.7 Effects of inoculum on the production of keratinase

2.1.7 最佳發(fā)酵溫度的確定

溫度對產(chǎn)酶的影響如圖8所示。隨著溫度的升高，發(fā)酵酶活力呈現(xiàn)先提升后降低的趨勢。在溫度37 ℃時，酶活力最高。因此，確定37 ℃為發(fā)酵產(chǎn)酶最佳溫度。

圖8 溫度對發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.8 Effects of temperature on the production of keratinase

2.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，用Minitab 19軟件設(shè)計Plackett-Burman(n=12)試驗。選取單因素試驗中的8個因素進(jìn)行顯著性考察，試驗結(jié)果見表3。由表4方差分析結(jié)果可知，X3、X6和X8,即酵母浸膏、pH和溫度在進(jìn)行F檢驗后，P<0.05，因此以上3因素均為顯著因素，選定并進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗。

表3 Plackett-Burman試驗結(jié)果Table 3 Results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗方差分析Table 4 The variance of the Plackett-Burman experiments

2.3 響應(yīng)面設(shè)計與分析

2.3.1 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果分析

將酵母浸膏(A)、pH(B)、接種量(C)作為變量，以角蛋白酶酶活力(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，試驗結(jié)果見表5。利用Design-Expert 8.0軟件試驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸方程為：

表5 Box-Behenken試驗結(jié)果Table 5 Results of Box-Behenken design experiments

Y=256 300+7 865A+14 760B+17 965C-8 070AB-8 720AC+5 350BC-8 231A2-20 261B2-36 291C2。

表6 Box-Behenken試驗方差分析Table 6 The variance of Box-Behenken design experiments

2.3.2 模型預(yù)測與驗證實驗

利用Design-Expert 8.0軟件，分析3種顯著性因素酵母浸膏、pH、溫度的響應(yīng)面和等高線。預(yù)測得到發(fā)酵培養(yǎng)基最佳工藝參數(shù)為酵母浸膏質(zhì)量濃度5.72 g/L，pH 7.68，溫度37.69 ℃，理論最高酶活力可達(dá)到261 711 U/mL。為驗證模型的準(zhǔn)確性及重復(fù)性，利用上述最佳工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行驗證，測定角蛋白酶的平均酶活力為(260 480±1 430) U/mL，實際值與理論值較為接近，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化能夠很好地預(yù)測枯草芽孢桿菌產(chǎn)角蛋白酶的實際情況。

2.4 發(fā)酵罐放大產(chǎn)角蛋白酶試驗

為使優(yōu)化后的結(jié)果能夠更好地指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)，對該結(jié)果進(jìn)行3 L發(fā)酵罐發(fā)酵放大試驗，發(fā)酵曲線如圖9所示。由圖9可知，角蛋白酶酶活力和菌體生長曲線基本一致。當(dāng)菌株發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)入對數(shù)中期后，發(fā)酵酶活力迅速提高，角蛋白酶被大量表達(dá)。當(dāng)發(fā)酵時間達(dá)到26 h時，酶活力達(dá)到最大值，為704 400 U/mL，發(fā)酵罐發(fā)酵水平高于搖瓶發(fā)酵水平，可能是發(fā)酵罐培養(yǎng)比揺瓶培養(yǎng)具有更穩(wěn)定的pH及溶氧條件。酶活力峰值過后菌體濃度和酶活力同時開始下降，推測由于菌株生長進(jìn)入衰亡期，菌體自溶導(dǎo)致酶活力下降。

圖9 菌株發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶曲線Fig.9 Fermentation curve on the production of keratinase

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman設(shè)計篩選出酵母浸膏、pH、溫度3個顯著因素，利用Box-Behnken中心組合設(shè)計確定最優(yōu)的角蛋白酶菌株發(fā)酵條件。確定了優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基為30 g/L蔗糖、40 g/L豆粕、5.72 g/L 酵母浸膏、3 g/L Na2HPO4，1.5 g/L KH2PO4，0.3 g/L MgSO4；優(yōu)化的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度37.69 ℃，接種量體積分?jǐn)?shù)5%，pH 7.68。在此優(yōu)化條件下，菌株搖瓶發(fā)酵酶活力為260 480 U/mL，較優(yōu)化前酶活力提高4.26倍，3 L發(fā)酵罐發(fā)酵26 h酶活力達(dá)到最大值704 400 U/mL，超過文獻(xiàn)報道的最高水平，優(yōu)化后發(fā)酵原料成本較優(yōu)化前降低了96%。本研究顯著提高了產(chǎn)酶水平并降低了生產(chǎn)成本，為工業(yè)上生產(chǎn)角蛋白酶提供參考。