周偉 包曉華 何陳林

摘要 ? ?本試驗(yàn)以藥用植物金花葵為研究材料，對金花葵ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)體系為dNTP濃度為0.10 mmol/L、Taq酶濃度為0.25 U、引物濃度為0.20 mmol/L、Mg2+濃度為0.40 mmol/L、DNA濃度為50 ng;反應(yīng)步驟為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，40次循環(huán)，72 ℃最后延伸10 min，4 ℃條件下保存。本試驗(yàn)建立的金花葵ISSR反應(yīng)體系具有穩(wěn)定性好、清晰度高、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，可為今后金花葵遺傳多樣性研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ? ?金花葵;ISSR;體系優(yōu)化

中圖分類號 ? ?S567.21+9 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）17-0043-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

金花葵（Abelmoschus manihot（Linn.）Medic），又名金芙蓉、野芙蓉、菜芙蓉、黏干或山榆皮等，多年生錦葵科秋葵屬植物，植株高大可達(dá)2 m，適應(yīng)性特別強(qiáng)。2003年8月被中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院在河北邢臺地區(qū)發(fā)現(xiàn)，屬于瀕危藥用植物，目前在河南、河北、山西、吉林等地區(qū)人工種植，每年5月種植，7—9月為花期，果實(shí)成熟為10月。金花葵含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括黃酮、VE、氨基酸以及金絲桃苷等活性物質(zhì)，具有較高的藥用價值和保健作用。其葉片、鮮果以及莖桿含有豐富的氨基酸、微量元素和雌性激素，對于減輕或避免中老年更年期、延長女性青春期有突出效果。金花葵中黃酮的含量高達(dá)6%，比大豆的黃酮成分含量高出幾十倍，具有鎮(zhèn)痛、抗免疫、抗氧化、解熱抗炎等多種藥理活性。金花葵盛夏開花，具有無限開花結(jié)果習(xí)性，花大如盤，花徑15～20 cm，可種植于庭院或花園供觀賞，花中含有豐富的金絲桃苷成分，具有保肝、心腦血管保護(hù)以及抗炎作用[1]。歷版《中國藥典》以及衛(wèi)計委部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)對于金花葵均未記載，鑒于金花葵有如上藥用價值，應(yīng)對其有效成分、生物活性進(jìn)行深入研究，針對潛在價值深入挖掘。

ISSR是加拿大學(xué)者Zietkiewicz等人于1994年提出的，該技術(shù)是在一種簡單重復(fù)序列基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型分子標(biāo)記，以錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，在SSR序列的3′端或5′端加錨2～4個隨機(jī)核苷酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可以引起特定位點(diǎn)退火，導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增[2]。本試驗(yàn)對金花葵ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，以期為今后金花葵分子研究奠定基礎(chǔ)。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗(yàn)材料

金花葵種子及其植株。

1.2 ? ?DNA的提取

利用無錫百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PlantGen DNA Kit植物基因組DNA提取試劑盒對金花葵新鮮葉片進(jìn)行提取。

1.3 ? ?基因組DNA的質(zhì)量檢測

取適當(dāng)DNA原液將其稀釋后，再量取5 μL DNA稀釋溶液，然后再加入1 μL 6×Loading buffer（30 mmol/L EDTA，36%（體積比）甘油，0.05%（質(zhì)量體積比）二甲苯氰，0.05%（質(zhì)量體積比）溴酚藍(lán)），攪拌混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔，以免膠被戳破，并且在第1個膠孔內(nèi)點(diǎn)入6 μL DL 2000 DNA Marker作為分子量的標(biāo)準(zhǔn)，檢測DNA濃度用1×TAE，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓調(diào)節(jié)至3 V/cm，膠板在凝膠成像儀上觀察并拍照。

1.4 ? ?初始反應(yīng)體系

本試驗(yàn)初始反應(yīng)體系見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸10 min，40個循環(huán)，72 ℃最后延伸10 min，4 ℃保存。以此為基礎(chǔ)進(jìn)行ISSR參數(shù)優(yōu)化研究。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?DNA純度檢測

金花葵葉片中含有大量營養(yǎng)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、糖類以及維生素等，為DNA提取增加了難度，試驗(yàn)提取金花葵的DNA純度高、亮度好、無降解，可完全滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求（圖1）。

2.2 ? ?引物濃度

引物濃度大小對于擴(kuò)增結(jié)果影響很大，若引物濃度過大可能會出現(xiàn)背景模糊不清或者重演性較差等不良現(xiàn)象。本次試驗(yàn)共設(shè)置了4個濃度梯度，分別為0.10、0.15、0.20、0.25 mmol/L。從圖2可以看出，濃度為0.20 mmol/L時效果最優(yōu)，條帶多且清晰;濃度為0.10 mmol/L和0.15 mmol/L時擴(kuò)增條帶少，多態(tài)性差;0.25 mmol/L時無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。

2.3 ? ?Mg2+濃度

因?yàn)門aq DNA聚合酶對于Mg2+有較強(qiáng)的敏感度，并且還會有引物、擴(kuò)增產(chǎn)物以及模板DNA等結(jié)合，擴(kuò)增模板的數(shù)量也會受到Mg2+的影響。本次試驗(yàn)共設(shè)置了4個濃度梯度，分別為0.30、0.35、0.40、0.45 mmol/L。從圖3可以看出，濃度為0.40 mmol/L時電泳效果最優(yōu)，條帶清晰均勻且多;濃度為0.35、0.45 mmol/L時條帶較少，豐富性較差;濃度為0.30 mmol/L時條帶不清晰，背景模糊。

2.4 ? ?dNTP用量

dNTP作為PCR反應(yīng)的原料，其用量直接影響產(chǎn)物的產(chǎn)量、特性及合成的忠實(shí)性。本試驗(yàn)共設(shè)置4個濃度梯度，分別為0.08、0.10、0.12、0.14 mmol/L。從圖4可以看出，濃度為0.10 mmol/L時，條帶豐富性較好且較為清晰，效果最優(yōu);濃度0.08、0.12、0.14 mmol/L時條帶不清晰，多態(tài)性較差。

2.5 ? ?DNA用量

DNA模板量也是影響擴(kuò)增效果的主要因素之一。模板量過低，無擴(kuò)增產(chǎn)物或產(chǎn)物少而不穩(wěn)定;模板量過高，又會導(dǎo)致擴(kuò)增條帶的模糊和非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)。本試驗(yàn)設(shè)置4個濃度梯度，分別為50、60、70、80 ng。從圖5可以看出，濃度在50 ng時，帶數(shù)最多;在濃度60～80 ng時，出現(xiàn)帶數(shù)少且模糊不清。因此，最優(yōu)的濃度為50 ng。

2.6 ? ?Taq酶用量

Taq酶用量直接影響擴(kuò)增反應(yīng)成功與否，使用高濃度Taq酶易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，但如果Taq酶濃度過低，則會導(dǎo)致產(chǎn)物合成效率下降。本試驗(yàn)共設(shè)置4個濃度梯度，分別為0.15、0.20、0.25、0.30 U。從圖6可以看出，濃度為0.30 U時，條帶清晰且均勻重演性好，為最優(yōu)選擇;濃度為0.25 U時，條帶分布不均勻;當(dāng)濃度為0.15 U、0.20 U時，條帶較少。

3 ? ?結(jié)論與討論

雖然 ISSR標(biāo)記是一種隨機(jī)標(biāo)記，但是在一定條件下是相對比較穩(wěn)定的，進(jìn)行ISSR-PCR體系優(yōu)化是十分有利的，因?yàn)榈玫竭m合該物種的反應(yīng)程序和最佳體系，影響ISSR擴(kuò)增的因素有很多，幾乎組成反應(yīng)程序和最佳體系中的每個因子都可以影響擴(kuò)增的效果[3-4]。因此，要獲得較清晰、穩(wěn)定、可重復(fù)的條帶，對于ISSR-PCR反應(yīng)體系的各種影響因子（包括Taq酶、dNTP、Mg2+、引物濃度、模板濃度）進(jìn)行試驗(yàn)是非常必要的。

在進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)時，引物與模板結(jié)合后在Taq酶的作用下開始進(jìn)行延伸，Mg2+對于Taq DNA聚合酶有依賴性作用，受Mg2+濃度的影響，而Mg2+與dNTP產(chǎn)生拮抗作用，各種因素濃度過高或過低，對擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量都會產(chǎn)生影響，從而引起錯配和非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增，以至于增加引物二聚體的形成概率[5-6]。本研究最終建立金花葵ISSR最佳反應(yīng)體系：在20 μL的反應(yīng)體系中，dNTP濃度為0.10 mmol/L，Taq酶濃度為0.25 U，引物濃度為0.20 mmol/L，Mg2+濃度為0.40 mmol/L，DNA濃度為50 ng。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，40次循環(huán)，72 ℃最后延伸10 min，4 ℃條件下保存。通過對金花葵進(jìn)行ISSR體系建立與優(yōu)化，加深了對瀕危植物金花葵的理解與研究，為今后利用分子標(biāo)記技術(shù)對金花葵種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定、分子標(biāo)記輔助育種和遺傳多樣性研究等奠定了理論基礎(chǔ)。

4 ? ?參考文獻(xiàn)

[1] 唐曉清，王金羽，王寶華，等.金花葵引種及高產(chǎn)栽培試驗(yàn)[J].吉林農(nóng)業(yè)，2018（15）：88.

[2] 楊詩婷，王曉倩，廖廣輝.金絲桃苷的藥理作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2018，35（6）：947-951.

[3] 盧丹，賈瑞波.中藥金花葵的研究進(jìn)展[J].中國藥物評價，2015，32（2）：90-92.

[4] 張蕾，嚴(yán)萍，韓正洲，等.兩面針I(yè)SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，29（1）：70-74.

[5] 孫葉，趙國琦，袁媛，等.96份中、日春蘭資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].分子植物育種，2020，18（5）：1535-1547.

[6] 蔡芷辰，劉訓(xùn)紅，王程成，等.金銀花分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2020，45（6）：1272-1278.